Гемоглобин электрофоретическая подвижность

Рис. 10.11. Электрофоретическая подвижность гемоглобина здорового человека (вверху) и больного серповидноклеточной анемией в тяжелой (в середине) или легкой (внизу) форме. Препарат, содержащий гемоглобин, помещают в электрическое поле на участке, помеченном стрелкой. Нормальный гемоглобин (А) мигрирует

Рис. 126. Электрофоретическая подвижность нормального и серповидного гемоглобина как функция pH, Изоэлектрическая точка серповидного гемоглобина пpи epнo на 0,2 единицы pH выше, чем у нормального гемоглобина. Наблюдается более или менее постоянное различие в подвижности во всем интервале pH, величина которой дает основание полагать, что 7. для нормального гемоглобина более отрицательно примерно на два заряда во всей приведенной области pH

Аномальные гемоглобины, различающиеся по форме, химическому составу и величине заряда, были вьщелены при помощи электрофореза и хроматографии. Передающиеся по наследству изменения чаще всего являются результатом мутации единственного триплета, приводящей к замене одной какой-либо аминокислоты в полипептидных цепях молекулы гемоглобина на другую. В большинстве случаев происходит замена кислой аминокислоты на основную 1ши нейтральную (табл. 2.1). Поскольку это замещение осуществляется в обеих полипептидных цепях одной из пар (а 1ШИ 3), образовавшийся аномальный гемоглобин будет отличаться от нормального величиной заряда и соответственно электрофоретической подвижностью. [c.82]

Рис. 40.5. Примеры трех типов миссенс-мутаций, ведущих к появлению аномальных -цепей гемоглобина. На рисунке указаны аминокислотные замены и возможные замены в соответствующих кодонах. У гемоглобина Хикари -цепь обладает практически нормальными физиологическими функциями при измененной электрофоретической подвижности. Функция гемоглобина S в результате мутации в -цепи частично утрачена он может связывать кислород, но при деоксигенации выпадает в осадок. В гемоглобине М Бостон в результате мутации в а-цепи ион железа II, входящий в состав гема, окисляется до железа III, что полностью исключает связывание кислорода.

Электрофоретическое разделение НЬА и НЬ8 по методу подвижной границы показывает, что разница между зарядами этих молекул составляет один элементарный заряд на половину молекулы. Вполне возможно, что эта разница обусловлена заменой всего лишь одной аминокислоты в а- или р-цепи. Для того чтобы дать точный ответ, нужно было бы иметь данные полного анализа аминокислотной последовательности в обеих цепях. Однако установить участок, в котором два вида молекул гемоглобина различаются по аминокислотному составу, можно и без полного определения последовательности аминокислот. Протео-литический фермент трипсин гидролизует пептидные связи, в образовании которых участвуют карбоксильные группы остатков лизина и аргинина. И лизин, и аргинин имеют сравнительно длинные неразветвленные боковые цепи с положительным зарядом на конце. В каждой половине молекулы гемоглобина на 287 аминокислотных остатков приходится около 26 остатков лизина и аргинина. Таким образом, трипсиновый гидролизат половины молекулы гемоглобина должен содержать около 28 пептидов (поскольку в каждой половине имеются две различные цепочки), каждый из которых содержит в среднем немногим больше 10 остатков. В действительности при таком гидролизе отщепляется устойчивое ядро , содержащее около четверти аминокислотного состава половины молекулы. Анализ состава этого ядра , отделенного центрифугированием от прочих пептидов, показывает, что в НЬА и в НЬЗ оно имеет одинаковый аминокислотный состав и, вероятно, одинаковую последовательность аминокислотных остатков. [c.223]

Так, например, была определена структура НЬ S, имеющего большую электрофоретическую подвижность, чем НЬ А, и отличающегося от НЬ А тем, что у него в положении 6 р-цепи глутаминовая мислота заменена валином формула этого гемоглобина а р . В НЬ G (afP ) глутаминовая кислота в положении 7 заменена глицином в НЬ Е глутаминовая кислота в положении 26 — лизином в НЬ Цюрих (а Р ) гистидин в положении 63 — аргинином. Возможны замещения аминокислот и в а-цепи. [c.132]

Результаты указывают на существование значительных различий в электрофоретической подвижности гемоглобина, выделенного из эритроцитов здоровых людей, и гемоглобина, выделенного из эритроцитов больных серповидноклеточной анемией [c.71]

Гемоглобин S отличается от гемоглобина А по электрофоретической подвижности [c.90]

Изоэлектрическая точка белка-это значение pH, при котором данный белок не несет электрического заряда. При таком значении pH электрофоретическая подвижность равна нулю, поскольку 2 = 0 [уравнение (1)]. При pH ниже изоэлектрической точки молекула белка заряжена положительно при значениях pH, лежащих выше изоэлектрической точки, белок заряжен отрицательно. Гемоглобин, серповидных клеток отличается от нормального по изоэлектрической точке [c.91]

Различие в электрофоретической подвижности гемоглобина А и 5 может объясняться изменением либо общего заряда Z, либо коэффициента трения / Сам по себе эффект трения (обусловленный изменением формы) выразился бы в том, что одно вещество двигалось бы медленнее другого во всем диапазоне pH. В рассматриваемом случае этого не происходило, судя по тому, что кривые зависимости электрофоретической подвижности от pH имели одинаковый угол наклона (рис. 5.4). Кроме того, другие физико-химические исследования, а именно определение скорости седиментации и свободной диффузии показали, что коэффициенты трения оксигенированных форм гемоглобина А и гемоглобина 8 были одинаковы. [c.91]

Рис. 5.4. Зависимость от pH электрофоретической подвижности нормального гемоглобина и гемоглобина серповидных клеток.

При изучении гемоглобина у гематологических больных, а также при обследовании здоровых людей было обнаружено более 100 мутантных форм гемоглобина. Гемоглобины, отличающиеся по электрофоретической подвижности от гемоглобина А, подвергают анализу методом пептидных карт ( отпечатков пальцев ) и затем определяют последовательность аминокислот того пептида, по которому исследуемый гемоглобин отличается от гемоглобина А. Выявлено несколько классов мутаций гемоглобинов. К мутациям первого класса относятся замены аминокислот на поверхности молекулы почти всегда эти замены безвредны, а гемоглобин 8 составляет поразительное [c.101]

Анализ пептидных карт широко применяется при сравнении белков с весьма близкими структурами, отличающимися одним или несколькими остатками. Многие аномальные гемоглобины (гл. 31) отличаются от нормального одним единственным остатком. Пептид, содержащий такой остаток, обычно проявляет отличную от соответствующего пептида нормального белка электрофоретическую или хроматографическую подвижность (рис. 6.1). [c.172]

Изоэлектрическую точку можно найти прямым путем методами потенциометрического титрования или электрофореза. В последнем случае изо-электрическая точка определяется как такое значение pH, при котором электрофоретическая подвижность и полиионов равна нулю. Для нахождения изоэлектрической точки измеряют подвижность нолиионов при различных 5,0 е,о 7,0 з,о рн значениях pH и затем путем интер- р с. у.8. Завнспмость электро-поляции находят значение pH, при форетической подвижности и котором и = 0. Пример такого на- гемоглобина от pH среды, хождения изоэлектрической точки (для [c.145]

В дополнение к основному гемоглобину HbAj в крови взрослого человека доказано существование мигрирующего с меньшей скоростью при электрофорезе гемоглобина НЪЛ также состоящего из 4 субъединиц двух а-цепей и двух б-цепей. На долю НЬА, приходится около 2,5% от всего гемоглобина. Известен, кроме того, фетальный гемоглобин (гемоглобин новорожденных), обозначаемый HbF и состоящий из двух а-цепей и двух Y-цепей. Фетальный гемоглобин отличается от HbAj не только составом аминокислот, но и физико-химическими свойствами спектральным показателем, электрофоретической подвижностью, устойчивостью к щелочной денатурации и др. Кровь новорожденного содержит до 80% HbF, но к концу 1-го года жизни он почти целиком заменяется на НЬА (все же в крови взрослого человека открывается до 1,5% HbF от общего количества гемоглобина). Последовательность аминокислот в у- и б-цепях гемоглобинов окончательно не расшифрована. [c.81]

Особенно хорошо изучен в настоящее время патологический HbS, входящий в состав эритроцитов при так называемой серповидноклеточной анемии — заболевании, распространенном в малярийном поясе тропических стран. HbS благодаря своей плохой растворимости легко вьшадает в осадок в содержимом эритроцита и, деформируя красную кровяную клетку, придает ей характерную серповидную форму. HbS обладает меньшим сродством к кислороду, чем и объясняется при замещении им большого количества НЬА возникновение у людей анемии. В то же время следует заметить, что люди, в крови которых содержится HbS, невосприимчивы к малярии. HbS отличается от обычного НЬА (А — adultus, взрослый) по своей электрофоретической подвижности и по аминокислотному составу, причем изменение аминокислотного состава касается только двух остатков глютаминовой кислоты примерно из 600 аминокислот, входящих в состав молекулы гемоглобина. В HbS в двух полипептидных цепочках Р (стр. 64—65) вместо остатка глютаминовой кислоты находится валин. Ниже приводится строение фрагмента полипептидной цепочки гемоглобина А и соответствующего фрагмента этой же цепочки гемоглобина S [c.474]

В 1949 г. Полинг, Итано, Сэнгер и Уэллс обнаружили, что гемоглобин больных серповидноклеточной анемией, НЬ5, отличается по своей электрофоретической подвижности от нормального гемоглобина человека, НЬА. Э то исследование, в котором было обнаружено различие зарядов двух форм молекул гемоглобина, положило начало изучению молекулярных болезней крови. Генетики установили, что серповидноклеточная анемия наследуется по простым менделевским законам. Ген НЬ5 аллелей гену НЬА, т. е. расположен в том же локусе. Индивидуумы, гомозиготные по гену НЬЗ, обычно умирают в раннем возрасте. В их крови часто сохраняется значительное количество гемоглобина плода. У индивидуумов, гетерозиготных по этому гену, содержится примерно 40% НЬ5. Такие индивидуумы испытывают неприятные ощущения после физической нагрузки и во время -тгребывани в самолетах, не, оборудов11нных устанрБ ками для поддержания нормального атмосферного давления. В окисленной форме гемоглобины НЬА и НЬЗ нельзя различить никакими [c.222]

Гемоглобины дают очень интересный материал для изучения генетических мутаций у высших животных и человека. Их разделение и идентификация осуществляются обычно на бумаге или ацетат-целлюлозной мембране при pH 6,5 в фосфатном или како-дилатном буфере, хотя отличия в электрофоретической подвижности между некоторыми из них очень невелики. Электрофорез в гелях, обладающий гораздо большей разрешающей силой, все чаще применяется для вышеуказанной цели [53]. [c.103]

Если один из сравниваемых белков обладает какими-то отличиями в аминокислотной последовательности определенного участка первичной цепи, то пептидные фрагменты этого участка будут передвигаться по электрохроматографическому полю с иными скоростями (а часто и в ином направлении) по сравнению с фрагментами такого же участка другого белка. В результате первые пептиды займут особое положение на пептидных картах, тогда как фрагменты цз идентичных участков полипептидных цепей займут аналогичные места. Отличия в последовательности, таким образом, будут обнаружены в пятнах, имеющихся на одной электрохроматограмме и не появляющихся на другой. Элюция и количественный аминокислотный анализ лишних пептидных пятен позволяет далее установить наличие специфических для данного белка аминокислот, характеризующих эти фрагменты. В частности, методом пептидных карт для триптического гидролизата удалось выявить особенности структуры различных гемоглобинов. Гемоглобин 5 отличается от нормального гемоглобина А по электрофоретической подвижности и частично замещает последний у больных серповидно-клеточной анемией. Исследования методом пептидных карт позволили локализовать различие в первичной структуре между гемоглобинами А и 5 в одной точке полипептидной цепи [c.82]

В работе Бордмэна и Партриджа [13], посвященной СО-гемо-глобинам (изоэлектрическая точка около pH 7,0) было показано, что на этой смоле можно фракционировать и нейтральные белки. Хойсмен и Принс [25] обнаружили любопытный факт порядок элюирования четырех СО-гемоглобинов из смолы ШС-50 при pH 6,5 отличается от того порядка, которого можно было ожидать, исходя из электрофоретической подвижности этих белков при pH 6,75. Скорости элюирования из этой смолы фракции исследованных гемоглобинов падает в ряду Р>А>В>С величина изоэлектрической подвижности возрастает в ряду А<Р<В<С. Очевидно, в основе разделения на смоле белков лежит особенность их общей структуры. Другой нейтральный белок, который был очищен на смоле ШС-50, [c.231]

Возникает вопрос почему в процессе эволюции ие исчезли больные дрепаноцитозом, поскольку этот признак ведет к гибели гомозиготного потомства Объяснение здесь допустимо следующее. Все индивидуумы, имеющие хотя бы частично серповидные эритроциты, оказались невосприимчивы к малярии. Малярийный плазмодий не может жить в крови подобных людей. В условиях Африки, где борьба с малярией велась плохо, это вызвало естественный отбор гетерозиготных особей, несущих мутированный ген, и число наследственных больных пе падало, а возрастало с течением времени. Объяснение природы этого заболевания было найдено Лайнусом Полингом. Он предположил, что происходящая мутация относится к цистрону, который управляет синтезом гемоглобина, т. е. белка, переносящего в организме человека молекулярный кислород. Полинг с сотрудниками изучил свойства мутированного гемоглобина и сравнил его с нормальным. Оказалось, что электрофоретическая подвижность аномального гемоглобина отличается от подвижности нормального. Подобным способом были изучены темоглобины многих заболеваний крови. В настоящее время найдено уже свыше 10 различных мутированных гемоглобинов. Некоторые из них, по-видимому, безобидны, другие связаны с тяжелыми поражениями. Полинг назвал их болезнями молекул . Это остроумно, но не точно заболевает, понятно, организм человека вследствие изменений в структуре определенной функционально важной молекулы. [c.416]

То обстоятельство, что электрофоретическая подвижность мутантов отлична от подвижности нормального белка, неудивительно, ибо кислотное звено Глу заменено на незаряженное Вал илп щелочное Лиз. Интересна физическая природа самого заболевания. Дело вовсе не в потере способности гемоглобина обратимо связывать кислород. Специальные измерения показали, что константа связывания молекулярного кислорода гемоглобином одинакова у всех трех форм гемоглобина, но существенно изменяется растворимость белка, с понижением которой белок начинает кристаллизоваться внутри эритроцитов, чем и вызывает исканченную форму последних. Выпадение гемоглобина из раствора лишает его способности выполнять свою функцию, откуда и возникает анемия. Мутантные формы гемоглобина явились прекрасным доказательством того, что и в высшем организме имеются генетические области — цистроны, управляющие синтезом одпого определенного полипептида. Провозглашенный Бидлом п Тэтумом для микроорганизмов принцип один ген — один фермент нашел здесь прекрасное подтверждение. [c.417]

В последнем случае возникает такое заболевание, как серповидно-клеточная анемия. Аномальные гемоглобины отличаются от нормального величиной заряда и электрофоретической подвижностью. Физико-химические изменения гемоглобинов сопровождаются на- рущением транспорта кислорода. [c.35]

В молекуле глутаминовой кислоты по сравнению с молекулой валина имеется дополнительная карбоксильная группа. Эта разница в зарядах и обусловливает различия в электрофоретической подвижности нормального и серповидноклеточного гемоглобина. [c.72]

Точный диагноз нестабильности гемоглобина может быть затруднен, особенно если не наблюдается изменений электрофоретической подвижности. В этом случае необходимо выделение преципитированных глобиновых цепей для дальнейшего анализа в специализированных лабораториях. Нестабильные гемоглобины являются причиной врожденных несфероцитарных гемолитических анемий. Такие гемоглобины могут возникать в результате новых мутаций. [c.82]

Для электрофореза гемоглобинов широко используют также крахмальный и полиакриламидный гели. При разделении разных форм гемоглобина характерный для этих гелей эффект молекулярного сита не играет никакой роли, в то же время их превосходные стабилизирующие свойства имеют очень важное значение, так как благодаря этим свойствам диффузия в гелях ограниченна, что облегчает разделение компонентов, лишь слегка различающихся по электрофоретической подвижности. Для повседневных анализов гемоглобинов рекомендуется использовать систему трис-борат-ЭДТА, а для разделения минорных гемоглобинов с низкой подвижностью лучше применять неоднородную систему трис-цитрат-ЭДТА [334]. Для обнаружения аномальных метгемоглобинов все присутствующие в образце гемоглобины переводят в восстановленную форму и затем проводят электрофорез при pH 7,0—7,1 [430]. Гемоглобин Н можно отделить от гемоглобина Барта и гемоглобина I с помощью электрофореза в фосфатном буфере при pH 7,7 (это значение pH является критическим) [592]. [c.323]

Тот же самый подход был использован для определения числа коварионов в семействах других белков инсулине, а- и -цепях гемоглобина, рибонуклеазе, фибринопептиде Л. И в этих случаях лишь ограниченное число кодонов способно фиксировать нуклеотидные замены, приводящие к аминокислотным заменам. Об этом свидетельствуют и обширные данные по изучению белкового полиморфизма в природных популяциях дрозофилы. Сравнение популяций по наличию в них форм данного белка с различной электрофоретической подвижностью показало, что разнообразие популяций обеспечивается одними и теми же несколькими вариантами. Поскольку эти исследования были сделаны для большого числа белков, то можно, по-видимому, сделать вывод о том, что для каждого локуса существует небольшое число позиций, в которых происходит фиксация по крайней мере некоторых замен оснований. [c.487]

Необходимо отметить, что в случае медленно движущихся аномальных фракций гемоглобина (НЬЗ и НЬЬ) результаты определения процентного содержания НЬАз могут быть искусственно завышены за счет следов этих медленных фракций. В случае наличия гемоглобина Е, имеющего такую же электрофоретическую подвижность, как НЬАг, определение содержания НЬАг оказывается невозможным. [c.247]

Структурные мутации гена приводят к синтезу аномальной молекулы глю-козо-6-фосфатдегидрогеназы. Нарушения в этой молекуле изменяют каталитическую активность, кинетические свойства, стабильность и электрофоретическую подвижность. Известно более 200 вариантов глюкозо-6-фосфатдегид-рогеназы, но развитие патологических реакций обусловливают немногие из них. При наличии аномальной молекулы глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах снижаются связывание кислорода, скорость восстановления мет-гемоглобина и устойчивость к воздействию различных потенциальных окислителей. При аномальном варианте глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы нарушается основная функция фермента — поддержание стабильности мембран эритроцитов. [c.236]

В решении этого вопроса помогло исследование другой наследственной болезни человека — серповидно-клеточной анемии. Л. Полинг (СЯ1А) в 1949 г. обнаружил, что гемоглобин таких больных отличается от гемоглобина здоровых людей по электрофоретической подвижности. Как стало ясно позднее, это различие обусловлено заменой 6Glu Val в (3-цепи гемоглобина. Отсюда следовал вывод, что ген определяет первичную структуру белков. При этом информация, записанная с помощью определенного чередования нуклеотидных остатков, переводится в информацию, записанную чередованием аминокислотных остатков. Это можно сравнить с переводом записи, сделанной азбукой Морзе, на буквенную запись. [c.126]

С помощью электрофореза на ацетате целлюлозы легко можно разделить целый ряд различных видов гемоглобина человека, например гемоглобины А, Р, 5 и С. Однако при электрофорезе в щелочных условиях нельзя отделить НЬ5 от других гемоглобинов, имеющих сходный заряд, а также НЬС от тех вариантой гемоглобина, которые, подобно НЬС, отличаются от НЬА на два заряда (НЬЕ и НЬО). Из-за незначительных различий в подвижностях гемоглобинов А и Р трудно обнаружить небольшие количества НЬА в присутствии больших количеств НЬР, и наоборот. Шмитд и Холланд [1136], проводившие оценку готовых наборов, предназначенных для электрофореза гемоглобинов (на ацетате целлюлозы), подчеркивают, что на каждую пластинку ацетата целлюлозы следует наносить набор свидетелей, содержащий гемоглобины А, Р, 5 и С. Они также пришли к выводу, что некоторые партии ацетата целлюлозы дают плохие результаты. Шмидт и Брозиус [1135] обращают внимание на тот факт, что источником ошибок при тестах на аномальные виды гемоглобина нередко является неверная интерпретация электрофоретической картины. Поэтому считают необходимым при определении фенотипа гемоглобина использовать по меньшей мере два метода, например электрофорез при разных pH или электрофорез при одном значении pH в сочетании с тестом на растворимость НЬ5. [c.322]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология