Субстраты определение активности

Шаг 6. Экспериментальное определение активности катализатора для эталонного и опорных субстратов. [c.67]

С другой стороны изучение ферментативных реакций в стационарном режиме имеет ряд существенных недостатков. Наиболее важным из них является то, что стационарная кинетика дает весьма ограниченную информацию о детальном кинетическом механизме ферментативной реакции. Стационарная кинетика, отражая лишь лимитирующие стадии процесса, практически не дает информации о быстрых , нелимитирующих стадиях превращения субстрата в активном центре фермента. Определение элементарных констант скорости многостадийной ферментативной реакции из данных стационарной кинетики не представ-ляется.возможным. Действительно, кинетика каталитической реакции, включающей п промежуточных соединений (схема 5.16), описывается 2 п + 1) константами скорости. Стационарная же скорость этой обратимой реакции независимо от числа промежуточных соединений, принимающих участие в механизме реакции, дается уравнением (см. гл. VI) [c.174]

Итак, теоретические расчеты авторов работы [14] приводят к выводу о зависимости среднего числа мономерных остатков субстрата, прошедших через активный центр, и среднего числа расщепленных при этом связей не только от строения активного центра, но и от степени полимеризации субстрата. Поскольку эти значения (средние числа) определяют численные величины констант Михаэлиса и максимальной скорости реакции, то Кт и Ут достигают своих предельных величин при степенях полимеризации субстрата существенно больших, чем число сайтов в активном центре фермента. Таким образом, по мнению авторов работы [14], характер зависимости величин Кт или Ут (или их отношения) от степени полимеризации субстрата не может быть использован для определения числа сайтов в активном центре фермента. Здесь следует отметить, что именно на последнем подходе в значительной степени базируется концепция картирования активных центров, разработанная Хироми и сотр. С другой стороны, формальный подход, используемый для расчета степени множественной атаки, приводит к тому, что с его помощью нельзя объяснить специфичность действия эндоглюканаз по отношению к длинным субстратам по сравнению с короткими (см. [14]). Видимо, в основе подобного несоответствия подхода определенным экспериментальным данным опять лежит (как в подходе Хироми) предположение о некой характеристической константе скорости расщепления связей субстрата в активном центре, независимо от числа занимаемых центров и степени полимеризации субстрата. Это общий недостаток многих теоретических концепций о расщеплении полимерных субстратов разрабатываемых в последнее время. [c.101]

Широкое распространение приобрели методы определения активности с использованием вспомогательных ферментов. Они основаны на том, что продукт изучаемой реакции служит субстратом вспомогательного фермента. Этот метод имеет особое преимущество в тех случаях, когда непрерывная регистрация скорости изучаемой реакции затруднена или когда продукт реакции является ингибитором исследуемого фермента. [c.208]

В-пятых, при определении активности ферментов с помощью сопрягающих систем реакцию удобно начинать либо одним из субстратов изучаемой реакции, либо самим ферментом. Такая постановка позволяет предварительно выявить возможность протекания побочных реакций. Кроме того, присутствие системы сопряжения в среде инкубации до начала реакции обеспечит плавную регистрацию образующегося продукта. [c.209]

Если фермент является чистым и насыщен субстратом, а также выполнены стандартные условия определения активности, то для числа оборотов справедливы следующие соотношения [c.8]

Таким образом, установив, что вследствие индивидуальной структуры фермента определенные группы в полипептидной цепи расположены специфическим образом, мьт можем представить образование активного центра, который в дальнейшем и предопределяет природу превращений, приводящих к образованию того или иного продукта реакции. Сама же ферментативная реакция протекает в составе активного комплекса, который образуется при взаимодействии фермента и субстрата, при этом связывание с активным центром фермента происходит в результате образования специфических нековалентных связей, в том числе гидрофобных, и электростатического взаимодействия. Влияние специфических групп фермента за счет кооперативности дестабилизирует связи субстрата, который превращается в более реакционноспособное соединение. В соответствии с этим можно дать определение активного центра как участка белка фермента, который включает все специфические группы, участвующие в образовании активного комплекса [25]. [c.165]

Пептиды. Включено несколько физиологически активных пептидов. Пептиды, используемые в качестве субстратов для определения активности пептидаз, включены в разд. 15 Искусственные и природные субстраты . [c.11]

Субстрат для определения активности а-О-галактозидазы. Недостаток фермента приводит к болезни Фабри. [c.308]

Субстрат для определения активности а-О-глюкозидазы. [c.308]

Эти исследования — наглядный пример использования стереохимических представлений в катализе. Они свидетельствуют о возможности существования на поверхности катализаторов наборов активных центров, оптимальных для катализа определенных молекул благодаря соответствию межатомных расстояний и углов кристаллической решетки катализатора и аналогичных параметров молекул субстрата. Естественно, что увеличение или уменьшение параметров решетки приведет к изменению геометрии активных центров, а следовательно, к росту или уменьшению скорости реакции в зависимости от улучшения или ухудшения соответствия между реакционным индексом молекулы субстрата и активным центром. Позднее различие каталитической активности гладкой поверхности металлических катализаторов, ступенчатых структур, выступов и пиков на ней наглядно продемонстрировал Соморджай (см. разд. У.5). Приведенные данные являются также серьезными доводами против представлений о гидрировании вдали от поверхности катализатора [15]. Следует также специально подчеркнуть, что представления о существовании на поверхности катализатора оптимальных активных центров получили подтверждение при изучении гидрогенолиза оптически активных соединений [16—20]. [c.13]

Ферменты катализируют биохимические реакции стереоспеци-фично. Вследствие этого асимметрический синтез в природе происходит повсеместно и чаще всего в единственном направлепии, Следовательно, большинство природных соединений оптически активно, потому что получены ири каталитическом действии ферментов, обладающих определенной трехмерной структурой, В самом общем виде можно сказать, что между субстратом и активным центром фермента существует точное геометрическое соответствие, Например, фермент триозофосфатизомераза катализирует превращение оптически неактивного диоксиацетонмонофос-фата до о-глицеральдегид-З-фосфата [59]. Субстрат имеет прохиральный центр , и один атом водорода специфически переносится с одной стороны (ге-поверхности) двойной связи на карбонильную [c.203]

Основным методическим подходом при картировании акгивно-го центра в концепции Тома является определение относительных частот расщепления связей полимерного субстрата под действием фермента. На рис. 11 видно, что расщепление каждого продуктивно связанного позиционного изомера должно приводить к образованию двух определенных продуктов. В итоге распределение продуктов реакции по олигомерам свидетельствует об относительной доле определенных позиционных изомеров при связывании субстрата с активным центром, и следовательно, о величине соответствующих микроскопических констант ассоциации позиционных изомеров, а скорость появления каждого продукта связана с соответствующим гидролитическим коэффициентом скорости реакции. Из кинетического уравнения (47) следует, что отношение скоростей образования продуктов Рт.г и Р ,+1,,+1 из одного субстрата со степенью полимеризации п равно отношению соответствующих микроскопических констант скоростей второго порядка [c.66]

Как показывают результаты картирования активных центров карбогидраз, в большинстве случаев сайт слева от каталитического участка характеризуется весьма невыгодной энергетикой связывания с мономерным остатком субстрата. Напротив, следующий сайт — справа от каталитического участка — обычно характеризуется сильным сродством к субстрату. Не исключено, что эти особенности взаимодействия полимерных субстратов с активными центрами деполимераз имеют прямое отношение к искажению субстрата поблизости от его реакционного центра при каталитическом расщеплении. Однако, поскольку данные по картированию активного центра получены в определенной степени спорными методами (особенно в отношении сайтов, прилегающих к каталитическому участку), в настоящее время еще рано делать какие-либо обобщения на этот счет. Наконец, сами предположения об искажении реакционного центра полисахаридных субстратов весьма спорны и при рассмотрении реакций, катализируемых лизоцимом, как показано в разделе Б, нуждаются в тщательной проверке. [c.75]

Встречается и обратная ситуация, когда 5-образная кривая в присутствии аллостерического эффектора превращается в гиперболическую. Например, пируваткиназа скелетных мышц характеризуется кинетикой Михаэлиса, но в присутствии аллостерического ингибитора (фенилаланина) кривая зависимости скорости реакции от концентрации субстрата становится 5-образной, при этом сродство фермента к субстрату (фосфоенолпирувату) уменьшается. Изменение кинетических свойств под действием аллостерических эффекторов обусловлено конформационной перестройкой молекулы белка. С помощью сшивающих реагентов или каких-либо других воздействий на структуру белка можно наблюдать потерю чувствительности фермента к аллосте-рическим эффекторам. Для выявления аллостерических свойств иногда необходимо изменить условия определения активности сместить pH реакционной среды в кислую или щелочную область от рН-оптимума или исследовать влияние эффектора при ненасыщенной концентрации субстрата. [c.215]

Триозофосфатизомераза пивных дрожжей имеет молекулярную массу 53 000 Да, состоит из двух неидентичных субъединиц. Оптимум pH в триэтаноламин-НС1-буфере — 7,0—8,5 и 7,6—9,5 соответственно при определении активности с использованием в качестве вспомогательного фермента глицерол-З-фосфатдегидрогеназы или глицеральде-гид-З-фосфатдегидрогеназы. Константа равновесия реакции изомеризации D-глицеральдегид-З-фосфата при pH 7,5 и 25°С равна 19. Кт для этого субстрата при тех же условиях — 1,27x10 М, а для диоксиацетонфосфата — 1,23X10 М. Л ° 1см при 280 нм равна 9,9. [c.249]

Суспензию сефарозы с иммобилизованной дегидрогеназой промывают 10-кратным объемом раствора мочевины, смешивают с 4-кратным объемом раствора мочевины той же концентрации и инкубируют суспензию при перемешивании. За ходом инактивации следят, измеряя активность фермента на носителе. Через каждые 10 мин из инкуба-ционной смеси отбирают аликвоты препарата дегидрогеназы и без отмывания геля от мочевины вносят их в стандартную систему для определения активности. Реакцию начинают добавлением субстрата через 10 с после внесения суспензии сефарозы. Исследуют влияние концентрации мочевины на процесс инактивации фермента. Оптимальной концентрацией мочевины является такая, которая позволяет провести денатурацию 3 из 4 субъединиц дегидрогеназы и перевести эти субъединицы в раствор. Подбирая концентрацию мочевины, следует получить такую зависимость инактивации фермента от времени, на которой будет выраженное плато на уровне 25% от исходной активности. При определении белка и активности на разных стадиях денатурации можно показать, что в начале плато в связанном с матрицей состояний находится димер дегидрогеназы, сохраняющий 50% от исходной удельной активности. При сохранении в процессе инкубации активности такого димера происходит постепенное отщепление неактивной субъ- [c.302]

Первая стадия. На первой стадии реакции фосфодиэстераза гидролизует 3, 5 -цАМФ до АМФ (6). Реакцию проводят в инкубационной среде, состоящей из 50 мМ трис-НС1 (pH 7,0), 10 мМ ацетата магния, цАМФ как субстрата реакции (концентрацию цАМФ выбирают в зависимости от целей эксперимента) и 0,3—0,4 мкКи ( Н)-цАМФ для определения скорости реакции по изменению концентрации радиоактивного изотопа в пробе. Дополнительно в соответствии с поставленной задачей инкубационная среда может содержать ЭГТА для определения активности фосфодиэстеразы свободной от кальмодулина или Са + и кальмодулина для активации фермента, различные комбинации концентрации Са +, кальмодулина и его антагонистов для определения действия последних на комплексе Са +—КМ—ФДЭ. [c.381]

Сорбция субстрата в активном центре а-Х, обеспечивается гвдрофобной полостью. Ее размеры 1,0x0, 5x0,4 нм оптимальны для связывания боковых цепей остатков гвдрофобных аминокислот (триптофан, фенилаланин, лейцин, тирозин), а конфигурация допускает лишь определенную ориентацию субстрата. Механизм каталитич. гвдролиза включает стадию сорбции субстрата, расщепления пептвдной связи с образованием ацилфермента и послед, переноса ацильной фуппы на нуклеоф. акцептор. [c.263]

За последнее время большое распространение получил метод определения активности протеолитических ферментов с помощью хромогенных субстратов. Для трипсина, например, употребляют м-нитроанилид -бензоил-1),Ь-аргинина [1]. Методы получения этого субстрата, описанные в литературе, используют труднодоступные реактивы, такие, как диэтилфос-фин, три-н-бутиламин [2] и дициклогексилкарбодиимид [1]. [c.76]

Б. Контроль Ба — раствор меченого анти1ена инкубируют в кюветах Бб — после определенного периода инкубирования меченые антигены, неиммуиоабсорбированные, удаляются промывкой (П) Бв — проводится характеризующая фермент реакция (С — добавленный субстрат). Эту активность можно наблюдать невооруженным глазом или точно замерять с помощью спектрофотометра. [c.107]

Аналогичный метод применяли для определения активного водорода в растворимых образцах полиоксифенилена, нолиоксипро-пилена и полиэтиленимина, а также их производных [16]. В ана-/1изе этим методом полимер растворяют в безводном диоксане с добавкой тритиевой воды и через некоторое время, необходимое для прохождения реакции обмена, растворитель и воду удаляют путем быстрого высушивания вымораживанием. Радиоактивности иыделенного тонкоизмельченного полимера и субстрата измеряют жидкостным сцинтилляционным счетчиком. [c.251]

Принцип, положенный в основу всех методов определения активности фермента (Е), заключается в регистрации скорости исчезновения субстрата (5) (т. е. вещества, на которое действует фермент) или скорости образования продуков реакции [c.25]

Сам каталитический акт химической реакции происходит в фермент-субстратном комлексе, состоящем из субстрата и активного центра фермента, образованного из определенных функциональных групп аминокислот, кофермента, иногда ионов металла, строго фиксированных в пространстве. [c.13]

II субстрата, при этом связывание с активным центром фермента происходит в результате образования специфических нековалентных свя-зс11. в том числе гидрофобных, и электростатического взаимодейст-иия. Влияние специфических групп фермента за счет кооперативности дестабилизирует связи субстрата, который превращается в более реакционноспособное соединение. В соответствии с этим можно дать определение активного центра как участка белка фермента, который включает все специфические группы, участвующие в образовании активного комплекса [251. [c.205]

О. медл. гидрол. при 100 °С в 1 М на. р/С, 1,34 рК 6,55. Использ. в качестве буфера и субстрата для определения активности фосфомоноэсте-раз. Р-ция сопровождается освобождением Р,. Naj-соль +5HjO, р. HjO. Может содержать небольшие к-ва от-глицеро л- 3-фосфата. [c.58]

Св.-кремовый порошок -I-IH O. 87-88. [а] -1-24 (i - 1 в EtOH). Раств-сть о. п. р. HjO р. гор. Н2О. Субстрат для определения активности химотрипсина. За гидрол. следят по снижению поглощения при 237 нм (pH [c.304]

Гигр. крист. 129,5 - 131. [а] -17,5 (с = 2 в HjO). Раств-сть р. Н О. Субстрат для определения активности трип-НС сипа, папаина, фицина. Гидрол. контролируют по увел, поглощения при 253 нм (pH 8) [ВВА 16, 570 (1955)] или по освобождению карбоксильных гр. [Meth. Bio hem. Anal. 2, 215 (1955) 4, 171 (1957)]. Медл. гидрол. в раств. за 24 ч при 4°С и pH 8 степень гидрол. 4%. [c.305]

Смотреть страницы где упоминается термин Субстраты определение активности: [c.135] [c.501] [c.7] [c.241] [c.401] [c.304] [c.304] [c.305] [c.305] [c.305] [c.305] [c.305] [c.306] [c.306] [c.306] [c.306] [c.306] [c.307] [c.307] [c.307] [c.308] [c.308] [c.309]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология