Множественная атака субстрата

Естественно, что разные способы ферментативной атаки на полимерный субстрат описываются различными кинетическими уравнениями, которые будут рассматриваться в следующей главе. Здесь же уделено внимание лишь одному, и наиболее спорному, на взгляд автора, понятию в кинетике и механизмах ферментативной деструкции полимеров — множественной атаке. [c.78]

Степень множественной атаки характеризуется числом молекул продукта, образующихся в результате одной успешной встречи фермента с субстратом, за вычетом двух молекул продукта, которые должны образоваться даже в отсутствие множественной атаки. Отсюда видно, что повторная (не по механизму множественной атаки) деструкция продукта реакции, образующегося после расщепления исходного субстрата, может быть легко и ошибочно принята за доказательство в пользу множественной атаки. [c.79]

Таким образом, при изучении множественной атаки возможность повторной ферментативной деструкции субстрата тривиальным способом (в результате диссоциации комплекса фермента с образующимся продуктом и повторная ассоциация с последующей атакой) должна быть полностью исключена. Подобное проведение столь чистого эксперимента было бы возможным лишь при очень сильной зависимости скорости ферментативного гидролиза от степени полимеризации субстрата в широком диапазоне последней. Тогда после первого же расщепления олигомерного субстрата скорость гидролиза должна настолько замедлиться, что реакция фактически остановится. Не исключено, правда, что она остановится и для процесса множественной атаки. [c.79]

Вообще говоря, логично было бы сделать предположение о том, что ферментативная деструкция промежуточных олигосахаридов вплоть до малых фрагментов 0(, Ог легче происходит при низких pH, в то время как при высоких pH легче атакуются длинные олигосахариды, чем короткие (см. пример 5). Если бы последую-щ lя экспериментальная проверка этого предположения показала, что р11-зависимость начальной скорости гидролиза исходной мальтозы смещена в щелочную сторону по сравнению с рН-зависи-мостью гидролиза, например, тетра- или пентамеров, то подтвердилась бы именно такая трактовка, нежели предположение о рН-зависпмости эффективности множественной атаки . Однако авторы работы [9] не предусмотрели этой достаточно вероятной возможности (см. пример 4) и вместо этого постулировали наличие множественной атаки при pH 6,9. Обработка экспериментальных данных [9] в рамках механизма множественной атаки показала, что субстрат проскальзывает вдоль активного центра а-амилазы на два глюкозных остатка и максимальная степень множественной атаки при pH 6,9 составляет 2,2—3,5. [c.84]

Пример 8. В работе [14] исследуется влияние множественной атаки на величины кинетических параметров ферментативного гидролиза гомополимеров в зависимости от степени полимеризации последних. Данные, приведенные в табл. 28 (отражающие зависимость кинетических параметров ферментативного гидролиза от степени полимеризации субстрата, и в целом подчиняющиеся известному правилу лучшее связывание — лучший катализ [15]), послужили для авторов работы [14] основанием для разработки весьма детализированной кинетической модели множественной атаки. Эта модель включает более десяти микроскопических параметров (число сайтов активного центра положение каталитического участка в активном центре число возможных способов ассоциации субстрата с ферментом число связей субстрата, расщеп- [c.87]

Исходя из принятой методики расчета авторы работы [11] нашли, что с укорачиванием субстрата (от степени полимеризации 155 до 51) степень множественной атаки последовательно возрастает (от 5,8 до 7,9), хотя из общих соображений следовало бы ожидать уменьшения. Наконец, тот факт, что даже для серной кислоты, где множественная атака в принципе должна отсутствовать, авторы получили степень множественной атаки, равную 1,9, указывает на погрешности принятой методики исследований. [c.90]

Как и следовало ожидать, скорость накопления Ог из Оа существенно превышала скорость накопления Об [17]. Аналогично, при регистрации продуктов Оз и О5 в ходе гидролиза того же исходного субстрата было найдено, что, хотя О5 накапливается в ходе реакции в более высокой концентрации, чем Ое (как и должно быть, поскольку реакционная способность О5 примерно в 2 раза ниже, чем Ое, см. табл. 3, 6), скорость его образования была меньше, чем второго продукта, О3. Отсюда был сделан вывод о наличии множественной атаки при действии а-амилазы, причем множественной атаке, по расчетам авторов работы [17], подвергаются 27% молекул субстрата, вступающих в реакцию. Ясно, что вывод основан на непроверенных (и, видимо, неверных) допущениях и не является корректным. Обнаруженное этими же авторами влияние pH на степень множественной атаки также можно объяснить несколько различающимися рН-зависимостями гидро- [c.91]

Согласно приведенным схемам вероятность множественной атаки Т определяется отношением константы скорости проскальзывания к константе скорости диссоциации из активного центра фрагмента субстрата, остающегося после первого каталитического акта [c.94]

Последовательность реакций, приводящая к периодическому образованию коротких фрагментов поли- или олигомерного субстрата за счет множественной атаки, может быть представлена в следующем виде [14, 20] [c.97]

Для практического применения данного подхода при расчете параметров множественной атаки требуется экспериментальное определение средней степени полимеризации продуктов ферментативного гидролиза Пр, максимального числа связей, расщепляемых за время жизни фермент-субстратного комплекса Гтах, числа сайтов в активном центре фермента т и положения каталитического участка (число сайтов слева и справа от каталитического участка). Используя эти данные, с помощью выражения (72) можно рассчитать максимальную длину цепи 2, продвигающейся через активный центр путем периодического проскальзывания. Имея величины г и Пр, можно рассчитать сумму единичных продвижений субстрата 8р вдоль активного центра для всех возможных способов связывания и, далее, с помощью соотношения (73) — среднее число этих единичных продвижений т] за время жизни фермент-субстратного комплекса для субстрата с любой степенью полимеризации. Наконец, с помощью выражения (77) можно вычислить эффективность ферментативного гидролиза полимерного субстрата, а с помощью уравнений (78—79) — время, требуемое для единичного проскальзывания вдоль активного центра. [c.101]

Итак, теоретические расчеты авторов работы [14] приводят к выводу о зависимости среднего числа мономерных остатков субстрата, прошедших через активный центр, и среднего числа расщепленных при этом связей не только от строения активного центра, но и от степени полимеризации субстрата. Поскольку эти значения (средние числа) определяют численные величины констант Михаэлиса и максимальной скорости реакции, то Кт и Ут достигают своих предельных величин при степенях полимеризации субстрата существенно больших, чем число сайтов в активном центре фермента. Таким образом, по мнению авторов работы [14], характер зависимости величин Кт или Ут (или их отношения) от степени полимеризации субстрата не может быть использован для определения числа сайтов в активном центре фермента. Здесь следует отметить, что именно на последнем подходе в значительной степени базируется концепция картирования активных центров, разработанная Хироми и сотр. С другой стороны, формальный подход, используемый для расчета степени множественной атаки, приводит к тому, что с его помощью нельзя объяснить специфичность действия эндоглюканаз по отношению к длинным субстратам по сравнению с короткими (см. [14]). Видимо, в основе подобного несоответствия подхода определенным экспериментальным данным опять лежит (как в подходе Хироми) предположение о некой характеристической константе скорости расщепления связей субстрата в активном центре, независимо от числа занимаемых центров и степени полимеризации субстрата. Это общий недостаток многих теоретических концепций о расщеплении полимерных субстратов разрабатываемых в последнее время. [c.101]

Для анализа экспериментальных данных (распределение продуктов ферментативной деструкции полимера в зависимости от степени полимеризации, или средняя степень полимеризации продуктов гидролиза) используют теоретические модели ферментативной деструкции полимеров — обычно весьма детализированные, но, как правило, содержащие сильные (и неочевидные) допущения, лишающие смысла всю детализацию. К ним относятся допущения об аддитивности показателей сродства индивидуальных сайтов, о постоянстве гидролитического коэффициента независимо от способа связывания субстрата и степени его полимеризации, о постоянстве инкремента свободной энергии активации действия фермента при последовательном заполнении его сайтов и т. д. Несоответствие теоретических данных, рассчитанных с помощью подобных упрощенных моделей, с экспериментальными нередко трактуется как доказательство в пользу существования таких неординарных механизмов, как множественная атака. При этом в работах, как правило, отсутствует критический анализ ограничений модели, и в частности анализ альтернативных механизмов действия фермента без априорного привлечения неординарных механизмов. [c.103]

Схема (84) описывает последовательное отщепление мономера с конца субстрата или посредством множественной атаки (с константой скорости кг), или путем повторных атак с повторяющейся диссоциацией фермент-субстратного комплекса на фермент и укороченный субстрат (с константой скорости кг). Как следует из схемы (84), исходный полимер имеет максимальную длину п- - [c.111]

Накопленный к настоящему времени опыт теоретического рассмотрения кинетики ферментативной деструкции полимеров позволяет утверждать, что иа экспериментально определяемую величину константы Михаэлиса должны влиять гетерогенность состава полимерного субстрата (по типу мономерных звеньев), различия в типах статистического распределения полимеров по степени полимеризации, конкурентное самоингибирование субстратом (или его фрагментами), множественная атака. Конкурентное самоингибирование уменьшает величину эффективной константы Михаэлиса. Напротив, возрастание степени множественной атаки (если последняя вообще имеет место) приводит к возрас- [c.135]

Недавно авторами работы [11] проведен кинетический анализ образования мономера при деполимеризации, протекающей двумя способами путем неупорядоченной или множественной ферментативной атаки гомополимерного субстрата. [c.119]

По-видимому, одноцепочечный механизм является чнсто гипотетическим, и на практике он не наблюдался. Промежуточный случай получил название множественная атака , и при его рассмотрении предполагается, что после образования комплекса фермента с полимерным субстратом по закону случая и первого каталитического акта фермент в течение некоторого времени не диссоциирует из комплекса с оставшимся фрагментом субстрата. За это время он успевает совершить несколько последовательных атак на этот фрагмент, приводя к образованию двух, трех или более молекул продукта (обычно с низкой степенью полимеризации — мономера или димера). [c.78]

Из приведенных здесь пояснений уже очевидна некоторая неоднозначность используемых понятий. Так, способы действия эидофермента более упорядоченного действия и фермента, действующего ио механизму множественной атаки, трудно (если возможно) разделить, так как в обоих случаях наряду с расщеплением срединных связей будет образовываться некоторое количество коротких продуктов деструкции субстрата. Видимо, возникновение этих терминов обусловлено одними и теми же экспериментальными наблк дениями, хотя смысл, вкладываемый в описание способов действия ферментов, совершенно различен. [c.78]

Удивительно, что подобггые реакции и оказались неучтенными, тем более что по данным самих же авторов линейные олигосахариды, образуемые прн раскрытии макрокольца циклоамилоз, являются лучшими субстратами а-амилазы, чем исходные циклоамилозы (табл. 25). Естественно, вторичная атака фермента на образующиеся продукты должна была внести существенный вклад в вычисленную степень множественной атаки . [c.81]

Далее, Хироми и сотр. [8] показали, что при гидролизе Ое скорость образования первичного продукта р-амилазной деструкции, О4, превышает скорость образования вторичного продукта, О2. Напротив, при гидролизе О первичный продукт О5 накапливается медленнее, чем вторичный продукт О3. С помощью данных табл. 10 по эффективности р-амилазной деструкции мальтоолигосахаридов Оз—О7 можно заключить, что именно такая картина ц должна наблюдаться в эксперименте, поскольку константа скорости второго порядка для гидролиза Об выше, чем для гидролиза О4, но для деструкции Оз выше, чем для О7. Таким образом, для интерпретации этих данных не требуется привлечения каких-либо представлений типа множественной атаки или других необычных эффектов. Однако авторы работы [8] считают, что полученные данные являются еще одним доказательством множественной атаки (причем степень множественной атаки зависит от степени полимеризации субстрата). Очевидно, что подобные выводы не выдерживают критики. [c.83]

Возможно, при занятии различных участков связывания в активном центре деполимеразы разными олигомерными субстратами конформация активного центра несколько отличается, что и приводит к соответствующим отклонениям в рН-зависимостях ферментативного катализа. Естественно, это предположение остается в высшей степени гипотетическим, но оно доступно экспериментальной проверке. Для этого следует только определить pH- или температурные зависимости гидролиза О и Об под действием р-амилазы. Если они действительно окажутся различными, предположение о рН-зависимости степени множественной атаки нельзя считать экспериментально подтвердившимся. Поскольку влияние pH на относительное образование 0з /05 было весьма малым (данное отнощение уменьшалось всего в 2,5 раза при изменении pH от 5 до 9), то и отличия в рН-зависимости для объяснения этого эффекта требуются весьма небольщие. [c.84]

Наконец, из табл. 26 и из рассчитанных значений степени множественной атаки ясно видно, что наибольшее отклонение от теоретических зависимостей (вычисленных в предположении об отсутствии повторной атакп фермента па образующиеся продукты реакции) наблюдается для субстратов с наибольшей степенью полимеризации, именно там, где повторная атака субстрата наи- [c.86]

Вместе с тем вся методология обработки экспериментальных данных базируется на весьма сильном допущении, что время, требуемое на единичный проскок субстрата (проокок на один мономерный остаток) вдоль активного центра в ходе множественной атаки, является характеристической величиной, постоянной для действия данного фермента, и независимой от степени полимеризации субстрата или от степени заполнения других сайтов активного центра мономерными остатками. Фактически, это предположение эквивалентно постулату Хироми о постоянстве микроскопического гидролитического коэффициента ферментативного расщепления связей субстрата независимо от степени его полимеризации и степени заиолнения активного центра, применимость которого на практике сомнительна (как в значительной степени отвергающего специфичность ферментативного катализа на молекулярном уровне). [c.88]

Ясно, что эти данные могут быть интерпретированы более простым образом, а именно что способ действия фосфорилазы (априорно принятый в цитируемой работе [16] как канонический для неупорядоченного действия фермента) несколько отличается от способа действия р-амилазы, что приводит к различному распределению продуктов деструкции полимерного субстрата по молекулярным массам (степени полимеризации). Как неоднократно указывалос . выше, это наиболее характерный признак действия деполимераз, и в рамках кинетики и субстратной специфичности действия ферментов он обусловлен различной зависимостью кинетических параметров ферментативной реакции от степени полимеризации (длины цепи) олигосахаридов. С точки зрения термодинамики действия деполимераз этот характерный признак объясняется различным числом сайтов в активном центре фермента, различным их сродством к мономерным остаткам субстрата и положением каталитического участка в активном центре. Как видно, и в этом случае введение гипотезы о множественной атаке было излишним и преждевременным, так как экспериментальные данные, полученные авторами работы [16], не были подвергнуты тщательному анализу. [c.91]

Для действия Така-амилазы А было найдено, что без учета множественной атаки теоретическая модель достаточно хорошо описывает экспериментальные данные, за исключением кинетической кривой образования глюкозы, которая в эксперименте образуется в более высоких концентрациях и на более ранних стадиях гидролиза (например, в концентрации М на глубине 6% вместо расчетной глубины 27%). При действии бактериальной а-амилазы экспериментальные кривые не совпадают с расчетными для образования мальтозы и мальтотриозы, причем в эксперименте мальтотриоза образуется в наибольщих количествах по сравнению с другими сахарами, в то время как по расчетным данным олигосахарид G3 должен следовать за Ge, G2 и G5. Наконец, при действии глюкоамилазы на амилозу отклонения расчетных кинетических кривых от экспериментальных наблюдаются для всех промежуточных олигосахаридов (со степенью полимеризации 2—7), особенно в начальный период реакции. Если расчеты показывают, что промежуточные олигосахариды со степенью полимеризации 2—7 должны появляться в реакционной системе в заметной степени лишь после заметной степени конверсии исходногсу субстрата (мальтоза — после 50% конверсии, мальтотриоза — 40%, мальтогексаоза — 25% и т. д.), то на практике эти промежуточные продукты появляются почти сразу же после начала реакции (мальтоза — при степени конверсии около 10%). [c.92]

Авторы работы [18] показали, что, введя представление о множественной атаке в кинетическую схему (см. схемы 52—53), можно согласовать теоретические расчеты и экспериментальные данные для действия Така-амилазы Л, если степень множественной атаки равна 1,6 (рассчитано по формуле 62), и субстрат проскальзывает вдоль активного центра на мальтотриозный фрагмент. Согласование экспериментальных и теоретических данных для действия глюкоамилазы не совсем удовлетворительное даже в оптимальном случае (степень множественной атаки 8,0 и периодическое проскальзывание на одну глюкозную единицу), хотя и лучшее, чем без введения механизма множественной атаки. [c.92]

Таким образом, модель действия деполимераз (как эндо-, так и экзодействня), базирующаяся на представлении о множественной атаке, может быть с успехом заменена моделью, исходяпгей из картирования активного центра и базирующейся иа переменной величине ги/фолитичсского коэффициента действия фермента в зависимости от степени полимеризации субстрата и характера связывания его с активным центром. [c.93]

Хироми с сотр. [9] провели кинетический анализ двух схем с участием множественной атаки, где а) субстрат проскальзывает вдоль актиЕ.ного центра фермента на произвольное (случайное) число мономерных единиц (схема 52) и б) субстрат проскальзы- [c.93]

Если N — степень полимеризации субстрата и а — доля потенциально расщепляемых связей в молекуле олигомерного субстрата от общего числа связей, соединяющих мономерные остатки (М—1), то число расщепляемых связей на молекулу субстрата равно а(Ы—1). Если при этом среднее число эффективных (приводящих к расщеплению связей) комплексообразованпй фермента с субстратом равно X, то степень множественной атаки а определяется выражением [9] [c.97]

Здесь Пр — степень полимеризации продукта, определяемая экспериментально р, — число сайтов слева от каталитического участка (см., например, рис. 8), если продвижение субстрата идет в сторону восстанавливающего конца. Вводя термин единичное продвижение субстрата, означающий проскальзывание субстрата в активном центре на одно мономерное звено, можно рассчитать сумму единичных продвижений 5р для всех возможных способов свя ывания субстрата с активным центром в ходе множественной атаки [14]. Зная величину 5р для конкретного субстрата, можно вычислить среднее число единичных продвижений т] за время жизни фермент-субстратного комплекса [c.99]

Отсюда видно, что скорость ферментативной деструкции полимера при малой концентрации субстрата зависит от обоих показателей множественной атаки — эффективности гидролиза, г/ , или доли расщепленных связей за продвижение субстата на одну мономерную единицу, и среднего числа единичных продвижений за время жизни фермент-субстратного комплекса, т1 . В то же время максимальная скорость ферментативной деструкции (при насыщающей концентрации субстрата) определяется только эффективностью гидролиза, так как величина ta., предполагается постоянной. Левая часть выражения (77) в соответствии с уравнением Михаэлиса — Ментен (при [5]о<С/(т) равна йкат [5]о//Ст, а выражения (78) — кат) СЛСДОВЗТбЛЬНО [c.100]

Сравнивается действие двух или нескольких ферментов на один поли- или олигомерный субстрат и выявляется состав образующихся продуктов (различное распределение моно- или олигомерных продуктов по степени их полимеризации и по относительной концентрации). При этом состав продуктов действия одного из ферментов более характерен для неупорядоченного (многоцепочечного) способа действия по сравнению с действием других ферментов. Этого, как правило, для авторов достаточно, чтобы заключить о частичном проявления одноцепочечного механизма действия в последнем случае и, базируясь на выбранной ими модели, рассчитать степень множественной атаки. Кроме того, практически ни в одной из приведенных нами работ не вводились количественные поправки на возможную повторную атаку ( вторичный гидролиз образующихся продуктов реакции), исходя из кинетических параметров ферментативного гидролиза олигомеров с различной степенью полимеризации. Иначе говоря, авторы, априори принимая только механизм множественной атаки, не делают контрольных расчетов по альтернативным механизмам ферментативного гидролиза полимеров. [c.102]

Автор допускает возможность существования множественной атаки при действии деполимераз. Более того, он убежден, что этот механизм может играть важную роль в ферментативной деструкции нерастворимых биополимеров, где продвижение адсорбированного фермента по поверхности субстрата происходит с участием периферийных частей белковой (гликопротеиновой) глобулы, что легко представить условно как перекатывание фермента по поверхности нерастворимого субстрата. Наконец, при гидролизе нерастворимых биополимеров важную роль играет своеобразный клеточный эффект , когда молекула фермента последовательно действует на один и тот же участок субстрата, не успевая диффундировать от него на достаточное расстояние и снова адсорбируясь в определенной близости от места предыдущей атаки. Иначе говоря, автор не против множественной атаки, как и других неординарных механизмов ферментативного катализа. Однако в любом случае они должны быть строго обоснованы, и следует обязательно учитывать альтернативные и более тривиальные механизмы. В противном случае и без того сложная картина кинетики и механизмов действия деполимераз дополнительно усложняется введением надуманн 1х-эффектов и необоснованных концепций. [c.104]

Так, было найдено, что средняя степень полимеризации продуктов реакции в точке перегиба кинетической кривой накопления мономера с хорошей точностью соответствовала величине h (см. выше), т. е. большей по размеру части активного центра (гликоновой или агликоновой). Наконец, с помощью численного моделирования в работе [П] была проверена значимость приближения о малых концентрациях субстрата, меньших Кт, в реакционной системе. Было показано, что повышение начальной концентрации субстрата до значений, примерно равных константе Михаэлиса, не влияло существенно на результаты моделирования. Таким образом, критерии, предложенные Мазуром [8, И] и основывающиеся на форме кинетической кривой образования мономера при действии эндодеполимеразы на полимерный субстрат, могут быть использованы для дискриминации механизмов неупорядоченной и множественной атаки. [c.122]

На кинетику гидролиза значительное влияние оказывает и изменяющаяся степень сродства продуктов гидролиза к ферменту. Например, гидролиз глюкоамилазой плесневых грибов замедляется на коротких цепях. Гидролиз олигосахаридов происходит либо по многоцеиочечному, либо по комбинированному способу с уменьшением степени множественной атаки до единицы по мере укорочения цепей субстрата. Таким образом, гидролиз глюкоамнлазой в присутствии а-амилазы ускоряется только в начальных стадиях процесса. [c.179]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология