Пептиды методы разделения

Второй раздел практикума ставит своей целью познакомить студентов с особенностями выделения, фракционирования, идентификации и количественного определения различных природных азотсодержащих < оединений. белков, пептидов, аминокислот, нуклеиновых кислот, нуклеотидов и пр Предлагаемые экспериментальные работы включают аиболее широко используемые в лабораторной практике современные методы разделения и анализа этих соединений различные виды электрофореза, хроматографии, спектрофотометрии, колориметрии и др. Работа проводится как на готовых коммерческих препаратах высоко- и низкомолекулярных азотсодержащих соединений, так и на препаратах, выделяемых студентами из различных тканей лабораторных животных. [c.79]

При выборе методов разделения пептидов учитывают физ.-хим. свойства, кол-во и длину молекул разделяемых соединений. Для первичного фракционирования смесей коротких пептидов, содержащих до 15-20 аминокислотных остатков, в большинстве случаев используют ионообменную хроматографию на катионитах. Дальнейшее разделение и очистку проводят с помощью хроматографии и электрофореза на бумаге или пластинках с тонким слоем целлюлозы или силикагеля. [c.251]

С помощью БХ можно разделить и анализировать практически все классы хим. соед., в т. ч аминокислоты, сахара, стероиды. Кроме того, БХ в сочетании с двумерным электрофорезом используется как микропрепаративный метод разделения природных в-в, в частности пептидов. [c.325]

Только благодаря появившимся в начале 40-х годов новым методам, вопрос об определении аминокислотного состава получил свое полное и окончательное разрешение. В настоящее время основными способами такого определения являются следующие 1) распределительная хроматография 2) ионофорез 3) электрохроматография 4) ионообменная хроматография и 5) противоточное распределение. Последним методом пользуются главным образом при разделении пептидов. Метод распределительной хроматографии на бумаге, разработанный в 1941 г. Гордоном, Мартином и Синджем, положил начало новой эры в развитии химии белка. [c.479]

Смесь пептидов, образующихся в результате использования различны> методов расщепления, сначала должна быть разделена, и каждый из пептидов очищен. Целевой компонент перед анализом последовательности должен быть гомогенен по данным как минимум четырех различных методов разделения ионообменной хроматографии, электрофореза, бумажной или тонкослойной хроматографии и противоточного распределения. [c.366]

Наиболее широкое применение электрофоретический метод получил в биохимии, в частности, для разделения сывороточных белков, гидролизатов нуклеиновых кислот, аминокислот и пептидов. Методы электрофореза подробно рассмотрены в обзорах [32— 34 , а метод электрофореза на бумаге в монографиях [3, 35, 361. [c.27]

С помощью горизонтального электрофореза на бумаге можно проводить анализ смеси пептидов методом отпечатков пальцев и выделять микроколичества различных фракций. Для решения этих задач удобен электрофорез на бумаге в двух буферных растворах, который позволяет в одноэтапном эксперименте четко разделить кислые и основные компоненты смеси [8]. После гидролиза средней продолжительности в реакционной смеси обычно присутствует смесь кислых и основных пептидов. Одновременная подача двух разных буферных растворов способствует более полному разделению таких пептидов. [c.38]

Для ГХ этих соединений нужно было прежде всего решить проблемы, связанные с термостабильностью колонок и подобрать метод разделения. Из-за более высокой, чем у аминокислот, полярности для пептидов требуется, как правило, температура более 200° С. Не касаясь вопроса о стабильности фаз, отметим, что применение в данном случае полярных жидких фаз, например реоплекса или полифенилового эфира, довольно ограничено. Для [c.341]

Рис. Ч. Разделение пептидов методом ионообменной хроматографии.

Рис. 10. Разделение пептидов методом пептидных карт.

Рис. п. Разделение пептидов методом <. 1Ь фильтрации. [c.54]

По-видимому, при количественном разделении аминокислот и пептидов метод ионообменной хроматографии имеет определенные преимущества по сравнению с бумажной хроматографией, даже несмотря на необходимость нахождения оптимальных условий разделения методом проб и ошибок [65]. [c.396]

Методы хроматографического разделения гликопротеинов фактически не отличаются от методов, используемых в химии белков и пептидов. Также имеется ряд белков, которые в обычном смысле не считаются гликопротеинами, хотя они содержат один или несколько гликозидных остатков. Конечно, существует множество методов, с помощью которых могут разделяться различные гликопротеины. С точки зрения хроматографиста, здесь не следует детально их описывать. С другой стороны есть хроматографический метод, специфичный для структурных анализов гликопротеинов и гликопептидов. Специфичность основана на вы-боре подходящей системы детектирования, а не собственно метода разделения. Здесь будет кратко рассмотрен метод, описанный в работе [221- [c.145]

Тем не менее, несмотря на высокую эффективность современных методов, разделение сложных смесей пептидов приходится проводить в несколько стадий. Некоторые пептиды удается получить в достаточно очищенном виде уже на первой, стадии, в то время как для разделения пептидов, близких по молекулярному весу, по суммарному заряду или сродству к матрице, приходится подбирать специальные условия, варьируя при этом природу буферного раствора, тип ионита или молекулярного сита. Найти условия разделения пептидов с известной структурой не составляет большого труда. На практике исследователь имеет дело с малоизученным материалом, поэтому поиск оптимальных условий фракционирования приходится вести методом проб и ошибок. Ограниченное количество исходного материала и неизбежные потери из-за необратимой сорбции вынуждают резко ограничивать выбор возможных вариантов. [c.388]

Эту главу следует рассматривать в качестве краткого руко-водства по методам разделения пептидов с указанием их преимуществ и недостатков. Такое построение материала продиктовано желанием помочь исследователю ориентироваться в массе экспериментальных данных и найти правильный путь решения стоящей перед ним задачи. [c.388]

II. Методы разделения пептидов [c.389]

В данном разделе приведено несколько примеров разделения пептидов методом гель-проникающей хроматографии. [c.397]

Ионообменная хроматография является важнейшим и наиболее широко применяемым методом разделения пептидов. В обширной литературе и в ряде обзоров можно найти подробные описания техники эксперимента и многочисленных модификаций метода. В данном разделе приведены краткие сведения о применяющихся ионитах, а также ряд примеров, демонстрирующих возможности метода. [c.402]

Наиболее наглядным примером разделения пептидов методом распределительной хроматографии на сефадексе G-25 является выделение трех главных компонентов актиномицина С (актиномицинов i, Сг и Сз) (фиг. 40). Здесь также вначале готовили гель [c.196]

Еще одним эффективным методом разделения белков является ионообменная хроматография, основанная большей частью на различиях в плотности и знаке заряда белков при данном значении pH. Таким образом, метод ионообменной хроматографии можно применять для разделения не только аминокислот (разд. 5.18) и пептидов (разд. 5.21), но и белков. [c.146]

Взаимодействие растворимых веществ с сорбентами обычно изучается с целью создания сорбционных методов разделения смесей веществ. Вторая возможная область применения этого явления заключается в использовании сорбции для изучения свойств сорбируемых молекул. Это направление успешно развивается и уже в настоящее время позволяет определять эквивалентный вес сорбата, число зарядов в молекуле, оценивать молекулярный вес. Особенно важен сорбционный метод для изучения ряда свойств макромолекул. Он является важным дополнением к гидродинамическим методам анализа размеров и формы молекул глобулярных белков. Наряду с этим изучение электрохимических свойств макромолекул сорбционными методами позволяет получить ряд дополнительных сведений по сравнению с результатами потенциометрического титрования. Естественно, что для развития теории сорбции макромолекул необходимо предварительно изучить сорбцию низкомолекулярных веществ аналогичного типа. В связи с этим здесь последовательно рассматривается сорбция аминокислот, пептидов и белков. Изучение законов сорбции этих групп веществ может быть использовано также для их разделения как на основе одноактных сорбционных, так и хроматографических методов. [c.187]

Рнс. 12.25. Разметка листа бумаги и результаты разделения пептидов методом двухмерной хроматографии [82]. [c.333]

Определение концевых М-аминных групп разработано достаточно детально. Самым простым, хотя и не совершенным, является метод дезаминирования пептида азотистой кислотой, хлористым нитрознлом, или же окисления бромноватистой кислотой или нингидрином. В результате аминогруппа заменяется гидроксильной или карбонильной и после гидролиза пептида и разделения аминокислот на хроматограмме одна аминокислота исчезает. [c.510]

Важнейшие методы разделения белков, основанные на различии молекул по размеру, — зто диализ, ультрафильтращи, центрифугирование и гель-хроматофафия. С помощью диализа и улыпрафипьтрации [32] отделяют преимущественно низкомолекулярные компоненты от белков. При проведении диализа полупроницаемая мембрана (размер пор 5 — 100 нм) беспрепятственно пропускает воду, небольщие иоиы и молекулы, в то время как крупные молекулы белков задерживаются. Движущей силой процесса разделения является перепад концентраций между раствором и растворителем на мембране. При ультрафильтрации процесс разделения ускоряется путем приложения повышенного давления (0,5 — 10 бар). В качестве мембран чаще всего применяются синтетические материалы на основе производных целлюлозы и полиамида, делающие возможным при различных размерах пор (1 — 10 нм) разделение пептидов, пептидных производных и белков. [c.349]

Если электрофорез и хроматографию на бумаге можно отнести к микропрепаративным методам, то метод разделения смеси пептидов с помощью ионообменной хроматографии следует, пожалуй, считать макропрепаративным. Его главное преимущество заключается в том, что он позволяет обрабатывать большие количества материала и получать несомненно большие выходы фракций. Применение при ионообменной хроматографии летучих буферов дает возможность избежать трудоемкой процедуры обессоливания, которая осложняла ранее предложенные методики [49, 92]. Большим достижением в области ионообменной хроматографии является введение сферических смол. Их применение способствует увеличению скорости потока фракционируемых веществ через колонку и значительно сокращает продолжительность препаративного разделения. Сферические смолы в автоматических аминокислотных анализаторах обеспечивают воспроизводимую сравнительную хроматографию пептидов с высокой разрешающей способностью, т. е. позволяют автоматически проводить анализ методом отпечатков пальцев . [c.38]

ЭМ, для анализаторов Amino hrom (ВНР) смолу можно использовать при одноколоночном методе разделения. 50. ЭМ, для фракционирования полипептидов ( пептид-смола ). 51—52. ЭМ, для отечественного аминокислотного анализатора ХЖ-1301. [c.24]

Пептиды, подобно аминокислотам, как правило, гидрофильны. Поэтому методика хроматографического анализа аминокислот в тонком слое в принципе применима также к пептидам. Эта аналогия справедлива в определенных пределах. Б случае высших пептидов на растворимость и адсорбцию оказывает влияние число, природа и последовательность аминокислотных остатков и поэтому в данном случае следует работать при других условиях опыта или даже перейти к другим методам разделения. Пептиды с защищенными функциональнцми группами (синтез промежуточных продуктов) менее гидрофильны, чем пептиды без защитных групп. [c.408]

Ионофоретическое разделение смеси веш еств на тонком неорганическом-носителе — ионофорез в тонком слое — было описано независимо друг от друга Пастуска и Тринксом [195] и нами [123]. После того как ХТС была, разработана Шталем [196—200] в виде простой и стандартной методики,, с таким исключительным успехом использованной в первую очередь для разделения липофильных и гидрофильных веществ и превосходящей метод, хроматографии на бумаге, казалось соблазнительным распространить эту методику на метод ИТС. В принципе при осуществлении этой методики не возникает трудностей Консден, Гордон и Мартин [99] уже в 1946 г. успешно применили силикагель в качестве носителя для разделения аминокислот и пептидов методом ионофореза. Их еще слишком сложная методика не нашла широкого распространения по сравнению с ионофорезом на бумаге.. [c.430]

Высокоэффективным методом разделения является сочетание электрофореза на бумаге с обычной хроматографией. При этом сначала через влажную бумагу, на которую нанесена смесь, пропускают ток высокого напряжения, а затем смесь хроматографируют с помощью подходящего растворителя в направлении, перпендикулярном направлению электрофореза. В результате достигается разделение первоначальной смеси в двух измерениях. Применение такого метода к продуктам ферментативного расщепления белков позволяет получить двухмерную картину, которую называют пептидной картой. Каждый белок дает характерную для него при каждом конкретном способе расщепления картину. Локализацию отдельных компонентов во многих случаях определяют с помощью специфических красителей. При определении аминокислот и пептидов в качестве такого красителя используют, например, нингидрин. Если производится элюция адсорбированных компонентов, то удобнее всего устанавливать их присутствие в элюате спектрофотометрически. Вероятно, наиболее тонким методом разделения белков следует считать иммуноэлектрофорез, при котором эффект достигается за счет использования различий в двух свойствах электрофоретической подвижности и иммунологической специфичности. [c.220]

Чрезвычайно интересной является возможность выделить и изучить фрагмент, т. е. часть молекулы фермента, сравнительно небольшую, но включающую активный центр, точнее — группировку, выполняющую каталитический акт. Большие трудности в этой работе возникают потому, что при расщеплении (гидролизе) молекулы фермента образуется не однородное вещество, а очень сложная смесь разнообразных пептидов. При этом активностью обладают не все, а лишь немногие. Их трудно выделить и не так просто расшифровать их структуру. Однако современная химия белка располагает исключительно тонкими (главным образом, хроматографическими) методами разделения пептидов. Эти методы очень чувствительны и при их помощи можно отобрать из гидролизата практически любые структуры. Р1меются химические способы и для выявления всех деталей состава активных осколков белка. Поэтому можно ожидать, что этим путем будут получены важные сведения о природе активных центров ферментов. [c.328]

Двумерные разделения в настоящее время выполняются почти исключительно на бумаге, хотя известны подобные разделения на геле и комбинированные — на бумаге и геле. Ниже мы кратко опишем процедуру двумерного разделения на бумаге, не касаясь принципов методов хроматографии и электрофореза (см. соответствующие статьи настоящего сборника, а также работы [1, 2]), а затем приведем примеры применения двумерных методов разделения на бумаге. При разделении пептидов обычно используется Whatman 3 ММ или хроматографическая бумага с номи- [c.234]