Полипептиды фракционирование

В более длинных цепях аминокислотные остатки крайне редко встречаются по одному разу, обычно же в таких цепях имеется не меньше пяти одинаковых аминокислотных остатков. В этих случаях для изучения соединений с длинной цепью требуются -более селективные методы гидролиза, и для установления последовательности аминокислот необходимо выделять полипептиды с более длинной цепью. Однако такие полипептиды с трудом поддаются фракционированию для каждого выделенного полипептида должны быть определены количественный состав и последовательность сцепления аминокислот. [c.165]

Окисленная рибонуклеаза. Действие химотрипсина на рибонуклеазу менее специфично, чем действие на этот субстрат трипсина. Об этом свидетельствуют более низкие выходы полипептидов при разделении гидролизата методом ионообменной хроматографии [154]. В выделенных полипептидах установлено наличие 151 аминокислотного остатка, в то время как в полипептидах, полученных в результате расщепления трипсином, обнаружено всего 124 остатка. По-видимому, это объясняется тем, что некоторые участки полипептидной цепи появляются более чем в одном из пептидных обломков. О более сложном составе гидролизата можно судить по небольшим количествам примесей (как правило, не выше 15%), присутствующих в большинстве основных фракций. Эти примеси не мешали определению аминокислотного состава фракций, но их присутствие еще раз подчеркивает трудности, которые встречаются при фракционировании смесей пептидов, полученных менее специфическими методами гидролиза. Гидролизаты рибонуклеазы были получены инкубированием в течение 24 час с ферментом при pH 7. При более кратковременном инкубировании гидролизат содержал дополнительно [c.204]

Даже при специфическом ферментативном или химическом расщеплении белка или полипептида среднего молекулярного веса получается довольно сложная смесь пептидов. Существует набор разнообразных методических приемов фракционирования этой смеси и очистки отдельных компонентов. Вряд ли можно предложить какую-то одну схему фракционирования, которая была бы равным образом применима ко всем белковым гидролизатам. Первым этапом обычно является предварительное фракционирование в соответствии с зарядом или размером пептидов. За ним следует уже окончательная очистка пептидов с помощью электрофореза, ионообменной или иной хроматографической процедуры. [c.37]

Область применения. Препаративное фракционирование пептидов, микроструктурный анализ белков и полипептидов. [c.199]

Область применения.. Аналитическое и микропрепаративное фракционирование крупных полипептидов. [c.202]

Выбор оптимальных условий,фракционирования в каждом данном случае делается на основании предварительных опытов хроматографии. Однако, как правило, для фракционирования природных полимеров с катионными свойствами, таких, как полипептиды и белки, удобнее градиентное элюирование с увеличением молярности элюента при постоянном pH. [c.213]

Основные успехи разделения биополимеров в гетерогенных системах достигнуты при использовании равновесия между раствором и твердой фазой. Одними из наиболее ранних приемов, сохранивших свое значение и до настоящего времени, являются методы осаждения и кристаллизации. Еще большее значение в настоящее время играют процессы сорбции и их динамическая модификация — процессы хроматографии. Одноактная сорбция белков на окислах металлов и других минеральных сорбентах служит для очистки белков и ферментов уже несколько десятилетий. К этим процессам присоединилась избирательная сорбция белков ионообменными смолами. Одним из наиболее значительных достижений современной физической химии в области фракционирования сложных смесей веществ, в частности белков, нуклеиновых кислот, полипептидов, аминокислот и нуклеотидов, явилась хроматография, особенно в виде ее ионообменной модификации и гельфильтрации на сефадексах. [c.7]

Методы разделения смесей веществ представляют ценность не только как начальная ступень практически любого эксперимента в области исследования биополимеров, так как выделенный и очищенный белок или нуклеиновая кислота претерпевают с течением времени изменения как в растворе, так и в кристаллическом виде или в виде осадка, но и как методы непосредственного изучения свойств биополимеров. Изучение электрохимических свойств белков, нуклеиновых кислот, нуклеотидов, полипептидов методами электрофореза и сорбции, изучение их морфологии методами сорбции и хроматографии представляет собой столь же важную область применения этих методов, как и наиболее до настоящего времени распространенное их приложение для фракционирования и анализа смеси веществ. [c.9]

С-концы пептидных цепей определяются избирательным отщеплением концевой аминокислоты с помощью специфического фермента — карбоксипептидазы и последующей идентификацией этой аминокислоты. Если макромолекула белка состоит из двух (или более) пептидных цепей, как в случае инсулина (см. рис. 73), то избирательно разрушают дисульфидные. мостики окислением (например, над-муравьиной кислотой) и затем полученные полипептиды разделяют путем фракционирования на ионитах. Для определения последовательности расположения аминокислот в каждой полипептидной [c.458]

Вскоре после первой статьи та же группа исследователей опубликовала работы по фракционированию полипептидов [12], белков [12, 13, 59, 102], пептидов [59, 102], аминокислот [95, 103], поли- и олигосахаридов [131]. В этой же лаборатории были сделаны и другие работы, посвященные многочисленным и разнообразным применениям метода ГПХ, например для очистки гормонов [58] и ферментов [59], для разделения макромолекул и низкомолекулярных соединений [102], а также посвященные некоторым специальным задачам, например исследованию сорбции [42], влияния на результаты фракционирования скорости потока элюента, размера частиц геля, объема и вязкости образца [187] и автоматизации метода [11]. [c.115]

Процессе позволяет сократить время хроматографического аминокислотного анализа по сравнению с временем наиболее распространенного ионообменного хроматографического процесса. Распределение веществ между паром и жидкостью при испарении и ректификации является областью, пригодной для разделения стабильных органических соединений. Эти методы не находят применения в химии белков, нуклеиновых кислот и их фрагментов. Несколько большие возможности для фракционирования веществ этих классов открывает экстракция. Однако область применения этой методики в виде ее наиболее эффективного варианта — противоточной экстракции — ограничивается лишь разделением сравнительно низкомолекулярных веществ — полипептидов. И только распределительная хроматография, основанная также на использовании принципа распределения веществ между двумя несмешивающимися жидкими фазами, дала ряд примеров успешного разделения смесей высокомолекулярных биологически активных веществ. [c.7]

В целом адсорбционная хроматография в настоящее время, повидимому, особенно применима для предварительного фракционирования белковых гидролизатов. Выделенные таким образом группы можно затем более подробно исследовать с помощью распределительной. или ионообменной хроматографии. Следует, кроме того, отметить, что адсорбционная хроматография довольно успешно применялась в работах с природными полипептидами (тироцидином) [370]. [c.154]

Фракционирование белковых гидролизатов, главным образом при помощи ионофореза , различных видов хроматографии, противоточного распределения и других методов. Обычно последовательно применяют несколько методов. Конечным этапом такого разделения часто является бумажная хроматография, которая дает возможность индентифицировать ди-, три-, тетра- и более сложные полипептиды, которые часто сравнивают с различными синтетически полученными полипептидами известного строения. [c.307]

Если принять, что исследуемый белок состоит из одной полипептидной цепи (как это чаще всего и бывает) или если в результате предшествующего фракционирования был получен одноцепочечный препарат, то на следующем этапе следует осуществить избирательное расщепление полипептида. Наиболее удобным методом для этого служит трипсиновый гидролиз, при котором пептидные связи [c.70]

Метод ДСП-электрофореза белков в полиакриламидном геле значительно мощнее любого другого метода фракционирования белков из известных ранее хотя бы потому, что может быть использован для выявления любого белка независимо от его растворимости в воде. С помощью этого метода можно разделить на отдельные фракции белки мембран, белковые компоненты цитоскелета и белки, входящие в состав крупных макромолекулярных агрегатов. При использовании этого метода полипептиды разделяются строго по размеру, поэтому с его помощью можно получить информацию о субъединичном составе любого комплекса и о молекулярной массе белков, образующих этот комплекс (рис. 4-49). Фотография геля, который был использован для анализа последовательных этапов очистки белка, представлена на рис. 4-50. [c.216]

Условия нанесения образца па ОФ-колонку существенно влияют на результаты фракционирования. При выделении пептидов для структурных исследований практикуется нанесение образцов в растворах, содержащих мочевину или Gu-H l. Это помогает растворить образцы, предотвращает агрегацию молекул, способствует адсорбции образца на носителе. Адсорбция образца, позволяющая нанести вещество ровным слоем и создать оптимальные условия для взаимодействий между подвижной фазой и растворенным веществом, является одним из важнейших условий успешного фракционирования полипептидов. При больших объемах наносимого образца повышается эффективность последующих хроматографических разделений. [c.213]

С-Концы пептидных цепей определяются избирательным отщепле нием концевой аминокислоты с помощью специфического фермента — карбоксипептидазы и последующей идентификацией этой аминокислоты. Если макромолекула белка состоит из двух (или более) пептидных цепей, как в случае инсулина (см. рис. 53), то избирательно разрушают дисульфидные мостики окислением (например, надмуравьиной кислотой) и затем полученные полипептиды разделяют путем фракционирования на ионитах. Для определения последовательности расположения аминокислот в каждой полипептидной цепи ее подвергают частичному кислотному гидролизу и избирательному расщеплению с помощью ферментов, каждый из которых разрывает полипептидную цепь только в определенных местах присоединения какой-то одной определенной аминокислоты или одного типа аминокислот (основных, ароматических). Таким образом получают несколько наборов пептидов, которые разделяют, используя методы хроматографии и электрофореза. [c.376]

Выбор pH буфера для хроматографии полипептидов, олигонуклеотидов пли белков должен послуншть оптимизации условий разделения, как было пояснено выше. Этот выбор можно провести для одного белка, подлежащего очистке, или (в случае фракционирования) для всего исходного препарата. В первом случае для подбора pH нужно располагать хотя бы грубо очищенным белком. Эмпирически подбор оптимального значения pH можно производить по следующей схеме. [c.290]

ТСХ модифицированных ароматическими заместителями аминокислот в последние годы предпочитают вести на пластинках с полиамидным покрытием, поэтому из обзора Нидервизера процитируем только методы фракционирования немодифицированных аминокислот. Разумеется, ни по чувствительности и воспроизводимости результатов, ни тем более по точности количественных определений ТСХ аминокислот не может конкурировать с современными аминокислотными анализаторами. Однако существует немало ситуаций, когда возможности ТСХ оказываются вполне адекватными поставленной задаче определение аминокислотного состава, сопоставление родственных полипептидов, выявление генетических различий, проявляющихся в замене каких-либо аминокислот, клинические анализы физиологических жидкостей и др. На рис. 160 показана приведенная в цитируемом обзоре картина распределения пятен носле двумерной ТСХ модельной смеси аминокислот на иластинках с сп-ликагелевым покрытием. На старт вносили но 1 мкг каждой из ал1И-нокислот в 0,5 мкл 0,1 М раствора НС1. Элюцию в нервом направленип проводили смесью хлороформа, метанола и 17 %-ного аммиака (2 2 1), а во втором — смесью фенола и воды (3 1 но массе). [c.482]

Сукцинат убихинон-редуктаза (СУР) катализирует окисление сукцината убихиноном. По данным электрофореза, в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия фермент состоит из 3 —4 полипептидов. Субъединицы с молекулярными массами 70 000 и 28 000 Да представляют собой собственно сукцинатдегидрогеназу, в субстратсвязывающем центре которой происходит дегидрирование сукцината низкомолекулярные компоненты комплекса И (м. м. ок. 15 000 Да) придают сукцинатдегидрогеназе реактивность по отношению к убихинону, чувствительность к специфическим ингибиторам и, по-видимому, принимают участие в связывании фермента с мембраной. Выделение препарата СУР основано на экстракции фермента из мембраны с помощью неионного детергента тритона Х-100 и концентрировании препарата охлажденным ацетоном. Дальнейшее фракционирование сульфатом аммония и очистка на кальдий-фосфатном геле позволяют получить фермент в высокоочищенном состоянии с каталитической активностью около 25 мкмоль окисленного сукцината в 1 мин на [c.423]

Лучшим способом аналитического разделения рибосомных белков является электрофорез в геле. Уже при одномерном гель-электрофорезе в денатурируюших условиях можно получить значительное фракционирование р41босомных белков по заряду и молекулярной массе (размеру). Среди рибосомных белков большинства живых организмов преобладают умеренно основные полипептиды, хотя всегда [c.90]

Вторая группа вьсиючает жирно-кислотные синтетазы, из которых отдельные энзимы могут быть выделены методами белкового фракционирования. Такие синтетазы встречаются у ряда микроорганизмов (в частности, у E. oli) и растений. Иными словами, в этих случаях все индивидуальные ферменты синтетазной системы находятся в ввде автономных полипептидов. [c.383]

Б. Выбор размеров колонки. Для фракционирования 100 мг белка или полипептида при использовании КМ-целлюлозы, имеющей емкость 0,7—0,8 мэкв/г, требуется колонка 1,5 х 35 см. Препаративное разделение 1,0 г белка можно проводить на колонке 3,5x45 см- [c.212]

ЭМ, для анализаторов Amino hrom (ВНР) смолу можно использовать при одноколоночном методе разделения. 50. ЭМ, для фракционирования полипептидов ( пептид-смола ). 51—52. ЭМ, для отечественного аминокислотного анализатора ХЖ-1301. [c.24]

Исключительно большое значение в хроматографическом фракционировании имеет использование ионитов — производных целлюлозы (см. гл. VII). Жесткость структуры этих сорбентов и сорбция макроионов исключительно на поверхности зерен сорбентов приводит к полной обратимости сорбции, в результате чего при хроматографическом процессе на таких сорбентах не наблюдается обычно потерь белков, полипептидов и нуклеотидов. Наиболее распространенными целлюлозными ионитами являются карбоксиметилцеллюлоза — СМС, аминоэтилцеллюлоза — АЕ (В = —О—СНз—СН2—КНа), диэтиламиноэтилцеллюлоза — ДЕАЕ (Н=—ОСН2СН2К(С2Нб)2), эктеола -целлюлоза (продукт взаимодействия целлюлозы, эпихлоргидрина и триэтаноламина). Используются также производные целлюлозы с функциональными группами серной и фосфорной кислот, а также бифункциональные иониты — производные целлюлозы. [c.121]

Пористые материалы широко используются для фракционирования смесей по молекулярному весу компонентов. Примером тому служит ультрафильтрация — продавливание раствора через мембрану, способную пропускать лишь молекулы небольших размеров и препятствующую фильтрации макромолекул. Аналогичный принцип был использован при электроосмотической миграции веществ через гели [18]. Противоположное явление — прохождение молекул больших размеров и удерживание молекул меньших размеров ( обратные сита ) — наблюдалось при фильтрации растворов электролитов через колонку, содержащую ионообменную смолу. Это явление основано на способности ионов малых размеров проникать в сетчатую структуру ионита и сорбироваться там в то время, когда ионы больших размеров проходят через колонку без задержки. Применение сильносшитых малопористых смол позволяет отделять ионы металлов от органических оснований. На несколько более набухающих смолах осуществимо разделение высокомолекулярных и низкомолекулярных полипептидов, на сильнонабухающих ионообменных смолах достигается разделение белков по молекулярным весам [19]. [c.201]

РИБОНУКЛЕАЗЫ (РНК-азы) — ферменты, катализирующие гидролитич. расщепление рибонуклеиновых к-т на олиго- и мононуклеотиды. Р. широко распространены в природе и присутствуют во всех исследованных тканях. Наиболее изучена панкреатическая Р., секретируемая поджелудочной железой [систематич. название полирибонуклеотид — 2-олиго-нуклеотидо-трансфераза (циклизующая) шифр 2.7.7.16 — см. Номенклатура и классификация ферментов]. Р., выделенная в кристаллич. виде из поджелудочной железы быка экстракцией разведенной серной к-той с последующим фракционированием (NH4)2S04 — белок основного характера (р/ 7,8) с мол. в. 13 ООО. Установлена природа и последовательность аминокислотных остатков, входящих в состав Р., и выяснены существенные детали ее пространственной структуры, что дало возможность воссоздать трехмерную модель этого белка. Молекула панкреатич. Р. представляет собой одинарную полипептидиую цепь, состоящую из 124 аминокислотных остатков N-концевой аминокислотой в молекуле Р. является лизин, С-концевой — валин. [c.337]

Действие экстрактов гипофиза различных животных in vivo и in vitro вызывает потемнение кожи лягушек. Фракционирование этих экстрактов привело к выделению полипептидов трех типов — а-МСГ, р-МСГ и адренокортикотропинов. У большинства млекопитающих (человек, корова, свинья, овца) МСГ концентрируется в средней доле гипофиза, а у животных, не имеющих средней доли, МСГ вырабатывается в передней доле. [c.226]

После того как из первых опытов по расшифровке кода стало ясно, что код содержит кодоны-синонимы (например, как это видно из табл. 26, лейцин кодируется как УзЦ, так и УгП, возник вопрос, как происходит декодирование таких кодонов в ходе сборки полипептидов. Поскольку незадолго до этого в опытах по фракционированию экстрактов тРНК (подобных представленным на фиг. 208) было показано, что одной аминокислоте могут соответствовать несколько разных типов тРНК, казалось наиболее вероятным, что для каждого кодона существует соответствующая ему тРНК, несущая комплементарный антикодон. [c.447]

В результате расщепления белка или полипептида, каким бы методом оно ни осуществлялось, всегда образуется смесь пептидов. В среднем наиболее короткие пептиды получают при химотрипсиновом гидролизе, а наиболее длинные — при обработке бромистым цианом (так как содержание метионина в большинстве белков очень мало по сравнению с суммарным содержанием крупных гидрофобных аминокислот). При фракционировании смесей пептидов наилучшие результаты дает метод ионообменной хроматографии на колонках. Если для разделения используют смолу дауэкс I или другую, сходную смолу основного характера, а для элюции — ниридин-ацетатный буфер с постепенно понижающимся значением pH (8—3), то первыми с колонки выходят основные пептиды наиболее кислые выходят последними (фиг. 12). Обратный порядок элюции имеет место при [c.72]

Кун и сотр. [33] И Монтрейл и Маллэ [34] впервые обнаружили глико-протеины в женском молозиве. Гот и сотр. [35] выделили из женского молозива недиализуемую гликонолипентидную фракцию, которая содержала 22% полипептида. Анализ углеводной части показал, что она содержит 43% гексоз, 15% гексозаминов, 9% 6-дезоксигексоз и 10% сиаловой кислоты (считая на сухой вес гликоиротеина). При фракционировании препарата методом хроматографии на колонках можно получить 5 подфракций. [c.265]

Часто обнаруживается, что белок или полипептид существует в виде нескольких четко различимых форм, которые (часто по непонятным причинам) разделяются при помощи ОФ-ВЭЖХ. Такие неожиданности, конечно, осложняют фракционирование. Поскольку хроматография даже в наши дни все еще остается экспериментаторским искусством, то остается только посоветовать тщательно подбирать условия очистки образца, позволяющие получить материал в гомогенном состоянии. [c.209]