Разделение и количественный анализ аминокислот

Для разделения и количественного анализа аминокислот и родственных соединений в белковых гидролизатах и физиологических жидкостях предназначены автоматические аминокислотные анализаторы, выпускаемые многими фирмами. [c.91]

В то время промышленное производство ионитов только начиналось. Полагали, что разделение веществ на ионитах должно осуществляться благодаря различию в константах диссоциации. Однако в действительности иониты обладали и адсорбционными свойствами и они оказались наиболее удачными хроматографическими материалами для количественного анализа аминокислот. При этом вместо ранее применявшихся (при хроматографии на крахмале) органических растворителей стало возможным вести элюирование водными буферными растворами это позволило существенно усовершенствовать и ускорить детектирование аминокислот [3]. По сравнению с хроматографией на крахмале в этом случае достигалось более высокое разрешение, пики были острее, а базовая линия более стабильной. Кроме того, разделению аминокислот не мешали неорганические соли, присутствующие в образце. [c.305]

С момента создания метод количественного анализа аминокислот использовали для анализа других природных соединений, дающих положительную реакцию с нингидрином. По сравнению с анализом белковых гидролизатов в этом случае предъявляются гораздо более высокие требования к эффективности разделения, поскольку приходится анализировать смеси очень сложного состава. Наряду с аминокислотами такие смеси включают вещества самой разной природы их единственным общим свойством является способность давать положительную реакцию с нингидрином. С целью повышения эффективности анализ в данном случае проводят на более длинной колонке. Естественно, что такой анализ требует большего времени, чем анализ белковых гидролизатов, и особой системы буферных растворов. Источники свободных аминокислот существенно различаются в количественном и качественном отношении, и, следовательно, каждую конкретную смесь приходится анализировать в особых, нестандартных условиях. [c.307]

Количественный анализ аминокислот может быть проведен при пропускании анализируемого раствора через колонки, заполненные ионообменными смолами разделение аминокислот при этом происходит вследствие различий в их способности к комплексообразова-нию с высокополярными участками смолы. Раствор, вытекающий из колонки, смешивают с раствором ниНгидрина и интенсивность возникающего синего окрашивания измеряют с помощью фотоэлектроколориметра. Затем строят график зависимости интенсивности от времени при постоянной скорости потока. Типичная хроматограмма, полученная при анализе смеси аминокислот этим методом, приведена на рис. 20-4. [c.111]

Рассмотренные данные позволяют считать, что в ряде случаев газо-хроматографический анализ эфиров аминокислот может быть применен для определения производных с относительно высоким давлением паров, таких как эфиры алифатических и дикарбоновых аминокислот. Вероятно, что, видоизменив режимы хроматографирования, можно проводить анализ и некоторых других аминокислот. Однако вряд ли метод может быть пригоден для определения гетероциклических или двухосновных аминокислот вследствие указываемой рядом авторов деструкции их производных при хроматографическом разделении. Тем более очевидной является непригодность эфиров для количественного анализа аминокислот. Все это составляет одну из причин того, что в последних работах все большее предпочтение отдается эфирам К-замещенных производных, при использовании которых можно уменьшить размывание пиков, с одной стороны, и избежать полимеризации, с другой. [c.262]

В настоящее время метод газо-хроматографического разделения и анализа аминокислот не представляет еще законченного и универсального способа аминокислотного анализа белковых гидролизатов. Разработанные методики конверсии аминокислот в летучие производные, особенно количественной конверсии в К-ТФА-метиловые, и в значительной степени их успешное разделение на колонках с низким содержанием полиэфирных полярных стационарных фаз позволяют уже сейчас в ряде случаев использовать метод газо-жидкостной хроматографии для определения абсолютных количеств аминокислот в смесях. Но требуется дальнейшая доработка метода, и в особенности его аппаратурного оформления, прежде чем он займет должное место при изучении аминокислотного состава белков. [c.267]

Современные методы количественного анализа аминокислот основаны на элютивной ионообменной хроматографии с использованием колонок, заполненных сульфополистирольным катионитом в натриевой форме. Этот метод аминокислотного анализа впервые предложен сотрудниками Рокфеллеровского института в США Штейном и Муром [1], которые до этого занимались разделением аминокислот на крахмальных колонках. [c.124]

Методы хроматографии аминокислот на бумаге получили многочисленные применения в биохимии животных и растений, в микробиологии и медицине. Для количественного анализа аминокислот наиболее удобен все же способ, использующий образование комплексных соединений с медью. Содержание аминокислоты определяется по количеству меди в таком комплексе. Этот метод можно применять к смесям аминокислот, разделенных в одномерной хроматограмме. [c.161]

Второй раздел практикума ставит своей целью познакомить студентов с особенностями выделения, фракционирования, идентификации и количественного определения различных природных азотсодержащих < оединений. белков, пептидов, аминокислот, нуклеиновых кислот, нуклеотидов и пр Предлагаемые экспериментальные работы включают аиболее широко используемые в лабораторной практике современные методы разделения и анализа этих соединений различные виды электрофореза, хроматографии, спектрофотометрии, колориметрии и др. Работа проводится как на готовых коммерческих препаратах высоко- и низкомолекулярных азотсодержащих соединений, так и на препаратах, выделяемых студентами из различных тканей лабораторных животных. [c.79]

Наиболее совершенным методом для количественного анализа аминокислотного состава белков и пептидов в настоящее время является их определение с помощью автоматических приборов — анализаторов аминокислот. Разделение аминокислот в них происходит по [c.125]

Общая стратегия определения первичной структуры белка включает несколько этапов. Необходимо (а) провести количественный анализ гидролизата для того, чтобы определить мольное соотнощение имеющихся аминокислот (см. разд. 23.3.2) (б) определить молекулярную массу с помощью подходящего физического метода для того, чтобы вычислить количество всех присутствующих аминокислотных остатков [I—3] (в) определить количество входящих в молекулу полипептидных цепей либо с помощью хроматографического или электрофоретического разделения, либо посредством количественного анализа остатков, содержащих аминогруппу (JV-конец) и карбоксильную группу (С-конец) (см. разд. 23.3.4) [c.256]

Первым методом превращения аминокислот для использования в ГХ-анализе была реакция с нингидрином. Как известно, в этой реакции наряду с окрашенными веществами и СОг образуются и упоминавшиеся выше альдегиды, имеющие на один углеродный атом меньше, чем в исходной молекуле. Опираясь на метод количественного определения аминокислот, разработанный на основе этой реакции [92], с помощью ГХ удалось разделить и идентифицировать эти летучие альдегиды [37]. Очевидно, этот метод пригоден только для тех аминокислот, которые в реакции с нингидрином дают летучие альдегиды, и, следовательно, из этой группы, естественно, исключаются Про и родственные ему аминокислоты [61]. Побочные реакции при ГХ, такие, как полимеризация, затрудняют или вообще делают невозможным идентификацию определенных аминокислот [130]. Чтобы преодолеть указанные трудности, альдегиды окисляли [3] до карбоновых кислот и хроматографировали в виде метиловых эфиров. Несмотря на отмеченные недостатки, Златкис и др. [130] указывают, что этот процесс модификации аминокислот интересен в техническом отношении. По принципу реакций, используемых в ГХ, превращение аминокислот, а затем разделение и количественное определение альдегидов, переводимых в результате каталитического гидрокрекинга в метан, может происходить [c.326]

Для количественного определения аминокислот в отличие от обычной количественной ГХ важно парциальное содержание в смеси не аминокислотного производного, а исходной аминокислоты. Ошибки всех операций, проводимых перед разделением и идентификацией, оказываются включенными в общую ошибку конечного аналитического результата. Поэтому превращение аминокислот должно быть количественным или по крайней мере количественно воспроизводимым. Большие различия в выходах, даже если они воспроизводимы, заведомо усложнят работу и сделают ее чрезвычайно трудоемкой. Как показано при исследовании образования бутиловых эфиров ТФА-аминокислот, средние выходы для определенных аминокислот почти не отличались друг от друга и составляли около 96% [16, 53]. Однако при получении летучих ТФА-метиловых эфиров Ала, Гли и Вал происходили значительные потери вещества даже при аккуратном концентрировании образцов [19, 53]. Если для аминокислотного анализа выбраны производные с высокой летучестью, подобных операций лучше изрыгать. [c.336]

Хроматография производных аминокислот получила интенсивное развитие в связи с разработкой методов определения первичной структуры белков. Вероятно, трудно найти в органической химии и биохимии более удачный пример столь тесной взаимосвязи развития представлений о структуре и функциях большого класса веществ, каким являются белки, с хроматографическими методами анализа. Основное внимание было направлено на разработку методов определения N-концевых остатков аминокислот в белках, причем в идентификации соответствующих производных большое значение имели тонкослойная (ТСХ) и бумажная хроматография (БХ) (см. обзоры [1, 2]). Газожидкостная и жидкостная колоночная хроматографии находят в этой области ограниченное применение, однако интерес к последнему методу постепенно растет. Интерес к жидкостной хроматографий вызван вполне определенными причинами. Во-первых, постоянно появляются новые методы избирательной модификации остатков аминокислот в белках, а идентификация производных аминокислот требует развития хроматографических методов. Во-вторых, исследованию подвергают все более труднодоступные белки, что в свою очередь вызывает необходимость создания надежных методов количественного анализа. Интерес к колоночной хроматографии возрастает также в связи с выделением и получением необычных аминокислот, а также в связи с необходимостью предотвращения ошибок при определении аминокислотной последовательности. Понятия современный и классический метод используют здесь условно, поскольку новые методики обычно создают на базе стандартной аппаратуры примером может служить автоматический анализ ДНФ- и ДНС-аминокис-лот [3, 4]. Насколько известно, до сих пор не пытались использовать скоростную хроматографию высокого разрешения для разделения производных аминокислот, хотя некоторые соединения, например ДНС-аминокислоты, являются для этого метода довольно удобным объектом. Производные аминокислот использовали в структурном анализе белков крайне неравномерно. По-видимому, всеобщее увлечение ДНФ-аминокислотами проходит окончательно, уступая место повышенному интересу [c.360]

Система с градиентным элюированием обладает рядом преимуществ по сравнению с методом тонкослойной хроматографии. Во-первых, сводится к минимуму возможность ошибки, поскольку разделение идет в стандартных условиях, а полученные результаты можно контролировать методом ТСХ. Во-вторых, этот метод позволяет выявлять необычные аминокислоты или устойчивые к гидролизу пептиды, что в некоторых случаях представляет большой интерес. Как показано на рис. 33.8, на одной колонке удается разделить все обычные аминокислоты, а при соблюдении стандартных условий провести и количественный анализ. Однако эти преимущества достигаются благодаря применению более сложного оборудования и больших количеств веществ (по крайней мере, вдвое по сравнению с ТСХ). [c.377]

Для разделения и количественного определения аминокислот особенно эффективными оказались методы распределительной, адсорбционной и ионообменной хроматографии. Большое применение, в частности, получил метод Мура и Стейна, в котором исследуемый раствор пропускают через колонку, наполненную или крахмалом (твердый полярный адсорбент), или ионообменной смолой (сочетание адсорбции с ионным обменом), и затем связанные на колонке вещества вымывают с различной скоростью подходящими растворителями. Сбор и анализ отдельных фракций осуществляются при помощи автоматических приспособлений. Метод Мура и Стейна позволяет получить через 24 часа данные о полном аминокислотном составе образца белка, используя при этом только 2,5—3,5 мг белка. Для оценки эффективности и значения этого метода полезно напомнить, что старые и более грубые аналитические приемы требовали для получения данных о полном аминокислотном составе белка нескольких недель трудоемкой работы, связанной с расходованием десятков граммов белка. [c.35]

Иониты широко используют для уменьшения жесткости воды и ее обессоли-вання (см. 212), для выделения и разделения разнообразны.х неорганических и органических ненов. Ионный обмен используют в кожевенной, гидролизной, фармацевтической промышленности для очистки растворов, а также для удаления солей пз сахарных сиропов, молока, вин. С помощью ионитов улавливают ноны ценных элементов из природных растворов и отработанных вод различных производств. Промышленное производство многих продуктов жизнедеятельности микроорганизмов (антибиотиков, аминокислот) оказалось возможным или было значительно удешевлено благодаря использованию ионитов. Применение ионного обмена позволило усовершенствовать методы качественного и количественного анализа многих неорганических и органических веществ. [c.326]

Наиболее важное преимущество этого метода заключается, очевидно, в возможности использования его для разделения нелетучих соединений. В качестве примера соединений, разделенных на колонках со смолами, можно указать на аминокислоты (гл. 8, разд. Б.1.6), органические кислоты фосфора (разд. В.П этой главы), сульфокислоты (см. там же) и сахара (разд. Г.П этой главы). Сторонники газо-жидкостной хроматографии могут доказывать, что все эти кислоты можно разделить методом газовой хроматографии после превращения их в летучие сложные эфиры. Однако необходимость проведения дополнительной стадии анализа лишает газовую хроматографию ее наиболее ценного качества — экономии времени. Кроме того, для количественного анализа каждая кислота должна полностью превратиться в ее сложный эфир или же процент превращения должен быть постоянным и точно известным. Более того, соединения, которые в обычных условиях улетучиваются и конденсируются без разложения, в газовой хроматографии могут разлагаться или вступать в реакции под каталитическим влиянием нагретого сорбента. [c.255]

Адсорбция на носителе. При работе с пористым носителем поверхность раздела фаз очень велика и даже сравнительно слабая адсорбция может привести к полной неудаче при электрофоретическом разделении. Причины адсорбции не всегда достаточно ясны. По-видимому, силы неэлектростатического происхождения играют большую роль по отношению к белкам, чем к малым ионам. Адсорбция последних (пептидов, аминокислот и т. д.) связана с наличием ионизованных групп на поверхности носителя. Установлено, что в целлюлозе и крахмале, например, имеется значительное количество карбоксильных групп. Так как эти группы заряжены отрицательно, опасность адсорбции относительно мала для отрицательных ионов, но велика для положительных. Делались попытки уменьшить заряд бумаги этерифи-кацией карбоксилов диазометаном. С белками рекомендуется работать при pH выше их изоточки, тогда электростатическое отталкивание препятствует адсорбции. Этот эффект можно усилить, используя ионообменную бумагу, в которой с поверхностью целлюлозных волокон химически связано значительное число ионизированных групп с зарядом, противоположным заряду исследуемого иона. Для уменьшения адсорбции белков применялись также детергенты иногда помогает предварительная обработка носителя раствором исследуемого белка. Хотя в некоторых случаях эти меры приносят желаемый эффект, адсорбция часто (для белков — почти всегда) наблюдается в той или иной степени при электрофорезе на твердом носителе. Обратимая адсорбция проявляется в уменьшении скорости движения и в образовании хвостов у движущихся зон, что ухудшает разделение и затрудняет количественный анализ. Необратимая адсорбция приводит к тому, что на всем пути зоны остается равномерный след — адсорбированный белок, а количество вещества в зоне постепенно уменьшается. Если это количество мало, зона может вообще исчезнуть по дороге. Иногда адсорбция сопровождается денатурацией белка, частичной или полной потерей его биологической активности. [c.81]

Количественный расчет площади полностью разделенных пиков, полученных на двухлучевом фотометре, не представляет труда, для этого лишь следует измерить полное расстояние между вершинами ников на хроматограмме Н) и расстояние В между точками пересечения базовой линии с касательными, проведенными к наружным сторонам пика на их полувысоте. Площадь, полученная произведением НхВ, позволяет производить количественный анализ после градуировки на эталонных смесях аминокислот. [c.147]

В последнее время наиболее широкое распространение среди различных К-замещенных производных аминокислот получили их К-ацилированные эфиры. Относительно высокая упругость паров, термическая стойкость и сравнительно легкая возможность количественной конверсии аминокислот разных классов определяют интерес к использованию эфиров К-ацилпроизводных для анализа аминокислот методом газо-жидкостной хроматографии. Однако следует отметить, что, как правило, непосредственное сравнение результатов хроматографического разделения К-ацил-производных аминокислот, полученных отдельными авторами, практически невозможно, поскольку это разделение проводилось для разных производных в несопоставимых условиях с использованием различных по эффективности разделительных колонок, применением отличных по строению и характеру стационарных растворителей и твердых носителей, причем количество неподвиж- [c.262]

В настоящее время широко распространен достаточно точный нингидриновый метод определения аминокислот при помощи хроматографического разделения на бумаге. Однако разделение некоторых аминокислот обычной хроматографией на бумаге требует большой затраты времени например, для разделения основных аминокислот, необходимо минимум 4— 5 суток. Применение электрофоретического разделения позволило сократить время разделения лизина, аргинина и гистидина до 3 часов и за счет этого сократить общее время, необходимое для количественного анализа этих аминокислот, с 5—б дней до 6—7 часов. [c.254]

Хроматография является эффективным методом разделения и анализа сложных по составу газообразных и жидких смесей. Твердые вещества могут быть проанализированы после перевода их в жидкое (растворенное) или газообразное состояние. Качественный и количественный анализ проводится по характеристикам удерживания. Универсальность газовой и газо-жидкостной хроматографии значительно возрастает при сочетании хроматографического разделения и анализа компонентов масс-спектраль-ным или иным подходящим методом. Жидкостная распределительная хроматография особенно эффективна при разделении веществ, близких по химическим свойствам, например аминокислот. [c.359]

Очевидно, что описанные параметры газо-хроматографического анализа К-ТФА-бутиловых эфиров аминокислот могут быть использованы с меньшими или большими видоизменениями и для разделения ТФА-производных других эфиров. Это тем более важно, так как методика получения бутиловых эфиров К-трифтор-ацетилированных аминокислот является весьма трудоемкой и для получения соответствующих производных требуется значительно больше времени, чем для проведения собственно хроматографического разделения. Поэтому в настоящее время усилия многих исследователей направлены на исследование возможности более простого и количественного превращения аминокислот в летучие производные, что является необходимым условием для количественных определений аминокислот методом газо-жидкостной хроматографии. [c.265]

Количественный анализ аминокислот методом ГХ представляет несомненный интерес. Как правило, количественное определение аминокислотного состава пептида является одним из решающих моментов анализа последовательности. Поскольку при деградации крупного белка образуется большое число фрагментов, желательно затрачивать на анализ каждого из них минимальное количество времени и вещества. Привлечение в данном случае ГХ достаточно хорошо удовлетворяет этим условиям. Многочисленные исследования по ГХ аминокислот в конечном итоге направлены на решение этой задачи. Однако к действительно эффективному количественному методу предъявляются несоизмеримо более высокие требования, чем к качественному. Если учесть к тому же трудности получения и разделения производных аминокислот, станет ясно, почему до сих пор не разработан стандартный метод их количественного определения с помощью газового хроматографа. Основные трудности связаны, как подчеркивалось в разделе о получении производных, с полифункциональными аминокислотами. Метод, игнорирующий их идентификацию, может найти лишь ограниченное применение. Количественный анализ только простых аминокислот не может удовлетворять экспериментатора [40]. Вопрос о том, все ли аминокислоты, встречающиеся в белках, можно определять ГХ с достаточной точностью, все еще остается открытым. Здссь можно только вкратце рассмотреть имеющиеся условия и возможности. Проблемы, связанные с аппаратурой, необходимой для количественной ГХ, уже обсуждались ранее (см. стр. 302). [c.335]

Особое затруднение при количественном анализе аминокислот в виде сложных эфиров их N-TФAпpoизвoдныx вызывает разделение гистидина и триптофана, так как каждое из этих производных элюируются двумя пиками [25, 33]. Сначала элюируются диацил-производные этих аминокислот, затем моноацилпроизводные. При анализе бутиловых эфиров К-ТФАпроизводных аминокислот на одной колонке не было получено количественного и воспроизводимого разделения аргинина, цистина и гистидина [128]. [c.70]

Имеется ряд детальных обзоров, охватывающих применение хроматографии для анализа аминокислот, извлеченных из белков гидролитическими методами [89, 127, 134]. Читатель может найти в этих обзорах сведения об анализе отдельных белков. Достаточно указать на то, что в настоящее время количественно наиболее точным является метод, разработанный Муром и Стейном [93]. В этом методе применен градиентный проявительный анализ на ионообменных колонках из сульфированного полистирола. На рис. 165 показан типичный пример [62] превосходного разделения, осуществленного этим методом. Если применение сложной аппаратуры нецелесообразно, то хроматография на бумаге вполне применима для анализа белковых гидролизатов [7, 10, 30, 80]. [c.336]

Силильные производные приготовлены реакцией соответствующих аминокислот с БСА [1, 3, 112. Использовали и другие силилирующие реагенты, ТМХС и ГМДС [112], которые, как оказалось, не приводят к 100%-ному превращению в ТМС-производное. Во всех работах получено удовлетворительное разделение на колонках с силиконовыми фазами, однако сведения об анализах природных смесей отсутствуют. Только в одной работе [3] упоминается о трудностях при экстракции природных смесей из крови. В той же работе [3] продемонстрировано определение МИТ в количестве до моля с помощью электронозахватного детектора, а в работе [112] сообщается об определении до 6-10 моля МИТ с использованием пламенно-ионизационного детектора. Указанные чувствительности как раз имеют порядок величин, позволяющий анализировать один или несколько миллилитров цельной крови. Недостатком триметил-силилирования является его заметная неспецифичность, поэтому многие из сопутствующих соединений образуют производные, появляющиеся на хроматограммах при использовании пламенно-ионизационного детектирования. Электронозахватный детектор должен устранить этот недостаток. Иодированную контрастную среду, которая может мешать количественному анализу иодированных аминокислот, предварительно отделяют от их ТМС-производных при использовании ГХ. [c.93]

Отдельные пики получены при хроматографировании ТМС-аминокислот на ряде силиконовых жидких фаз (таких, как 5е-30 [8, 77, 116], силиконорое масло [106], 5е-52, рр-1, ВС-200 [П4] и ПС-550 [116]). На полиэфирах и полигликолях были получены неидентифицируемые пики 114], поэтому можно с уверенностью утверждать, что ТМС-производные недостаточно устойчивы для хроматографического анализа на этих жидких фазах. Ценной особенностью реакции силилирования является то, что она проходит количественно в одну стадию за короткий промежуток времени, однако без подходящих для анализа газохроматографических колонок количественное превращение не всегда осуществимо. В работах, проиллюстрированных хроматограммами, разделение ограничивалось несколькими аминокислотами [8, 106, 116]. Можно только предполагать, что достигаемое раз- [c.102]

Целлюлоза, как и полиамиды, относится к числу наиболее часто применяемых органических сорбентов, особенно в распределительной хроматографии. В ТСХ используют два типа целлюлозы — природную волокнистую и микрокристаллическую. Длина волокон природной целлюлозы составляет от 2 до 25 мкм, а средняя степень полимеризации колеблется между 400 и 500. Частицы микрокристаллической целлюлозы крупнее—от 20 до 40 мкм, а средняя степень полимеризации ниже—между 40 и 200. Благодаря применению очень коротких волокон целлюлозы в форме порошка в ТСХ не получается такое быстрое растекание хроматографируемых веществ вдоль волокон, которое имеет место на целлюлозе, иопользуемой в в>и-де хроматографической бумаги, и поэтому при одних и тех же концентрациях ТСХ дает более четкие пятна и позволяет получить лучшее разделение, чем БХ. Микрокристаллическая целлюлоза химически чище, чем природная целлюлоза, хотя некоторые марки последней, например MN 300 HR, вполне сравнимы по чистоте с микрокристаллической целлюлозой. На чистой щеллюлозе проводят главным образом количественный анализ или разделение фосфорных кислот, фосфатов и т. п. Большинство марок товарной целлюлозы выпускают без связующего, поскольку адгезионные свойства ее слоев намного выше, чем у неорганических сорбентов. В некоторые марки этого адсорбента добавляют флуоресцентный индикатор. Добавка гипса может даже оказать отрицательное влияние, как, например, при разделении аминокислот, но иногда может и улучшить разделение. [c.104]