Первичная структура белков и пептидов

Метод составления пептидных карт, получивший образное название метод отпечатков пальцев , используется при определении сходства или различия гомологичных белков по первичной структуре. Белок инкубируют с каким-либо протеолитическим ферментом. Часто порции белка инкубируют как с пепсином, так и с трипсином. При этом вследствие гидролиза строго определенных пептидных связей образуется смесь коротких пептидов, легко разделяемых с помощью хроматографии в одном направлении и электрофореза-в другом, под углом 90° от первого (пептидная карта). [c.56]

Тонкие различия в первичной структуре родственных белков часто удается выявить методом отпечатков пальцев . Метод этот состоит в том, что белок подвергают частичному перевариванию с помощью одного или нескольких протеолитических ферментов, а затем разделяют продукты гидролиза и идентифицируют их, пользуясь для этого либо электрофорезом, либо хроматографией на бумаге. На фиг. 32 приведены полученные таким способом отпечатки пальцев , или пептидные карты , нормального и аномального гемоглобинов. Детальное изучение этих пептидных карт показывает, что все пептидные пятна, за исключением одного, идентичны. Таким способом генетически измененный структурный элемент выявляется очень легко, и для установления природы структурного изменения нет надобности устанавливать полную аминокислотную последовательность всей молекулы. Действительно, в ряде случаев весьма определенные указания относительно природы имеющегося замещения можно получить просто исходя из результатов анализа аминокислотного состава соответствующих пептидов, выделенных из двух белков. Но, конечно, однозначные доказательства замены одной аминокислоты на другую получают только после установления аминокислотной последовательности анализируемых пептидов. [c.96]

Установить строение природных белков — очень сложная задача надо выделить белок из природного материала, например крови, в чистом виде, установить последовательность аминокислот, а затем вторичную и третичную структуры. Первичную структуру определяют на основании данных кислотного гидролиза белка до аминокислот, а затем ферментативного гидролиза до пептидов с небольшим молекулярным весом. Вторичную и третичную структуру находят, изучая рассеивание лучей Рентгена кристаллом белка. Таким образом, например, было установлено строение белка крови — гемоглобина, содержащего 574 аминокислотных остатка. [c.173]

Изучение физиологически активных пептидов, антибиотиков, ферментов, структурных белков, рецепторных взаимодействий типа гормон — белок и белок — белок, эволюционных взаимосвязей и недавно открытой гомологии первичной структуры между некоторыми онкогенами и нормальными белками — все эти достижения открывают для исследователей вдохновляющую перспективу. Таким образом, в работу с белками все более и более вовлекаются специалисты в различных областях биологической науки. О методологии химии белка опубликован столь обширный материал, что начинающий исследователь может испытывать затруднения С чего начать . [c.8]

Все аффинные метки, составленные из аминокислотных последовательностей, можно разделить на две группы. К первой группе относятся небольшие пептиды, которые оказывают минимальное влияние на основной белок. Такие метки не иммуно-генны, и во многих случаях не возникает необходимости их удаления из гибридных полипептидов. Влияние коротких последовательностей на свойства основных полипептидов зависит от первичной структуры метки и положения в полипептидной цепи рекомбинантных белков [157]. Вторая группа аффинных меток включает большие пептиды или белки. Их использование способствует повышению растворимости основного белка, однако [c.126]

После того как установлена первичная структура- какого-либо белка, обычно нет необходимости проводить полное изучение аминокислотной последовательности у гомологичных белков из близких (соответствующих) источников. Быстрый ответ можно получить, используя технику трипсинового фингерпринта . Для этого подвергают гидролизу трипсином белок с известной структурой и параллельно ему гомологичный белок полученные в результате гидролиза пептиды разделяют обычно с помощью двумерного электрофореза или хроматографии. Если разница в последовательностях невелика, то больщинство пептидов должны занимать идентичное положение на двумерном фингерпринте. Те немногие пептиды, которые отличаются по подвижности, необходимо элюи-.ровать и подвергнуть аминокислотному анализу по Эдману. Эта техника особенно полезна при изучении аномальных гемоглобинов, которые отличаются от нормального природой только одного участка. [c.276]

Для определения локализации дисульфидных связей белок подвергают частичному гидролизу на относительно малые фрагменты с помощью протеиназы низкой специфичности, такой как пепсин, в условиях, при которых протекает минимум обменных реакций. Пептиды разделяют и определяют их аминокисло гный состав для того, чтобы убедиться в том, что они гомогенны и содержат одну дисульфидную связь. Дисульфидная связь в каждом пептиде разрывается (см. разд. 23.3.3) и образуются два фрагмента. Если первичная структура белка известна, то достаточно аминокислотного анализа и частичного определения Л/-концевой последовательности в двух фрагментах для того, чтобы определить ту часть цепи (ей), из которой образовался каждый фрагмент. [c.280]

Протамины и гистоны. Данная группа белков отличается рядом характерных физико-химических свойств, своеобразием аминокислотного состава и представлена в основном белками с небольшой молекулярной массой. Протамины обладают выраженными основными свойствами, обусловленными наличием в их составе от 60 до 85% аргинина. Так, сальмин, выделенный из молок семги, состоит на 85% из аргинина. Высоким содержанием аргинина отличается другой хорошо изученный белок—клу-пеин, выделенный из молок сельди из 30 аминокислот в нем на долю аргинина приходится 21 остаток. Расшифрована первичная структура клу-пеина. Протамины хорошо растворимы в воде, изоэлектрическая точка их водных растворов находится в щелочной среде. По современным представлениям, протамины скорее всего являются пептидами, а не белками, поскольку их молекулярная масса не превышает 5000. Они составляют белковый компонент в структуре ряда сложных белков. [c.73]

Последовательность аминокислотных остатков в полипептид-,ной цепи называется ее первичной структурой. Определение пер.-вичной структуры производится путем частичного гидролиза белка с помощью специфических протеаз, катализирующих расщепление пептидной связи лишь между определенными остатками. Так, трипсин атакует лишь те пептидные связи, которые образованы СО-группами остатков основных аминокислот — Apr или Лиз. В результате образуется смесь коротких полипептидных цепей, олигомеров. Такие короткие цепи называются пептидами. Их исследование производится посредством химических и физико-химических методов (хроматография, масс-спектроскопия). Воздействуя другим ферментом, можно разрезать белок по другим связям, получить смесь других пептидов. N- и С-конце-вые остатки белка (см. стр. 68) определяются в результате их химической модификации, предшествующей частичному гидролизу. Зная строение пептидов, полученных при специфическом расщеплении различными ферментами, можно установить первичную структуру белка. Допустим, что белковая цепь имеет структуру [c.73]

Аминокислотная последовательность Met-энкефалина соответствует последовательности аминокислотных остатков 61—65 -липотропина — полипептида гипофиза, которому до сих пор не приписана никакая специальная функция, кроме слабо выраженного липотропного гормонального действия. Возможно, он служит предшественником для синтеза энкефалинов или по крайней мере одного Met-энкефалина. Аминокислотная последовательность Leu-энкефалина не присутствует, однако, в -ли-потропине, но содержится в динорфине — другом пептиде гипофиза. Еще одно затруднение связано с тем, что в гипофизе присутствует большой белок-предшественник (рис. 8.27), первичная структура которого не только содержит -липотропин, но также и адренокортикотропный гормон (АСТН). Последний регулирует функции желез внутренней секреции, а также образование и секрецию кортизона. Механизм образования Met-энкефалина из предшественника неясен. Помимо энкефалина, другие фрагменты липотропина также обладают опиатными свойствами. Среди этих так называемых эндорфинов -эндорфин (последовательность 61—91 липотропина) особенно известен своим заметным анальгетическим действием. [c.234]

Каждый белок или пептид специфическим образом свернут в пространстве, и эта конформация определяет его физико-хнми-ческие и биологические свойства. Пространственная структура белка (пептида) в целом кодируется его первичной структурой. Эта взаимосвязь создает предпосылки для теоретических расчетов и предсказаний вторичной структуры белков на основе их аминокислотной последовательности. Пространственная структура достаточно подвижна. т. е. способна изменяться под воздействием внешних усло-Ш1Й илн различных агентов, и в этом смысле правильнее говорить [c.82]

Данных по аминокислотной последовательности каждой полипептидной цепи белка еще не достаточно для установления его первичной структуры. Необходимо определить число и местоположение дисульфидных мостиков, связывающих эти цепи в единое целое. Разрешение этой задачи требует очень мягких условий гидролиза, ибо воздействие таких реагентов, как концентрированная соляная кислота приводит к окислению цистина до цистеиновой кислоты и ряда других продуктов. Поэтому белок подвергают энзиматическому гидролизу в возможно более мягких условиях и в присутствии тиоловых ингибиторов (например, Ы-этилмалеинимида). Часто для этой цели используют пепсин и химотрипсин, и расщепление ведут при pH 1,9 и 8,0 соответственно. Полученную смесь пептидов подвергают разделению с помощью одного или нескольких перечисленных выше приемов, п фрагменты, содержащие дисульфидную связь, выделяют в чи- [c.86]

Легко понять, что знание структуры даже всех пептидов, образовавшихся при расщеплении исследуемого белка, еще не позволяет установить его строение, поскольку неизвестно, каким образом соединяются эти пептиды между собой. Иначе говоря, от отдельных букв (аминокислот) мы уже перешли к словам, но еще не знаем того текста, который образуется их комбинацией. Поэтому всегда оказывается необходимым подвергнуть белок вторичному частичному расщеплению, но уже по другим амидным связям и снова выяснить строи1ие образовавшихся фрагментов. Тогда из структуры этих новых фрагментов мы можем выявить места стыковки пептидов, образовавшихся при первоначальном расщеплении белка и таким образом расшифровать его полную структуру. Формально анализ первичной структуры белков чем-то напоминает разгадку кроссворда, но каждый шаг здесь требует огромного внимания, времени и труда, и поэтому на полное выяснение последовательности аминокислотных остатков в сложных белках иногда затрачивается несколько лет. [c.41]

В химии белка уже достигнут ряд выдающихся результатов. Разработаны современные физико-химические методы исследования аминокислот, пептидов и белков. Установлена первичная структура некоторых белковых ферментов и гормонов, таких, как адренокортикотропный гормон, инсулин, рибонуклеаза, миоглобин, гемоглобин, цитохром с, лизоцим, химотрипсиноген, белок вируса табачной мозаики и других. Успешно развиваются методы синтеза биологически активных белков и пептидов. В 1963 г. осуществлен синтез первого высокомолекулярного белка гормональной природы — инсулина, а в 1969 г. — синтез фермента р1[бонуклеазы (124 аминокислотных остатка). Изучена пространственная структура миоглобина, гемоглобина, лизоцима, химотрипсина, карб-оксипеитидазы А, рибонуклеазы и других белков. Эти достижения помимо их высокой научной ценности имеют громадное практическое значение для медицины, сельского хозяйства и ряда отраслей промышленности. [c.18]

Примером химического строения ферментов может служить рибонуклеаза. Первый ферментный белок, первичная структура которого была определена в 1960—1962 гг.,— рибонуклеаза — фермент, катализирующий расщепление рибонуклеиновой кислоты, В 1969 г. осуществлен его химический синтез. Молекулярная масса кристаллической рибонуклеазы равна 13 683. Поли-пептидиая цепь этого фермента состоит из 124 аминокислотных остатков и четырех дисульфидных мостиков, которые, по-видн-мому, связывают между собой отдельные участки. полипептидной цепи рибонуклеазы и поддерживают третичную структуру белка. Концевыми аминокислотами рибонуклеазы являются лизин и валин. Установлено, что каталитическая активность рибонуклеазы зависит главным образом от наличия В ней двух гистидиновых остатков, а молекула фермента свернута таким образом, что эти два аминокислотных остатка — один в начале, другой в конце полипептидной цепи — оказываются в непосредственной близости один от другого. Если блокировать свободную аминогруппу остатка лизина, то также происходит полная потеря каталитической активности фермента. Это свидетельствует о том, что ферментативные свойства рибонуклеазы, а также других ферментов зависят от структуры определенных участков полипептидной цепи и их взаимодействия, т. е. от структуры активного центра фермента. [c.76]

Очень важной особенностью протеиназ является выборочный (селективный) характер их действия на пептидные связи в белковой молекуле. Так, пепсин избирательно ускоряет гидролиз пептидных связей, образованных фен и лей трипсин—арг и лиз-, химотрипсин—ароматическими аминокислотами папаин—арг, лиз и фен и т. д. В результате индивидуальный белок под действием определенной пептидил-пептидогидролазы расщепляется всегда на строго ограниченное число пептидов. Это находит практическое использование при определении первичной структуры белков и имеет огромное значение для регуляции обмена веществ, так как многие продукты селективного гидролиза белков обладают высочайшей биологической активностью именно этим путем из проферментов возникают ферменты, из предшественников гормонов—гормоны и рилизинг-факторы и т. п. Причина избирательного действия пептидпептидогидролаз заключается в том, что радикал аминокислоты, по соседству с которой гидролизуется пептидная связь, служит для образования фермент-субстратного комплекса. [c.131]

Секретируемые белки эукариотических клеток синтезируются на рибосомах, связанных с мембранами шероховатого эндоплазматиче-ского ретикулума (рис. 12.29). Секрецию белка направляет сигнальный пептид. В процессе секреции пре-белок проходит в полость эндо-плазматического ретикулума (ЭР), и от него отщепляется сигнальный пептид. В полости ЭР белок подвергается первичному шикозилирова-нию при наличии в его последовательности участков гликозилирования, имеющих структуру Asn-X-Ser или Asn-X-Thr (X — любая аминокислота). [c.318]