Получение NAD-агарозы

К полученной агарозе добавляют раствор соответствующего красителя (80 мг в 2,5 мл дистиллированной воды) и перемешивают на смесителе Коултера. [c.173]

Приготовление геля. Взвешивают агарозу (250 мг) и добавляют к ней 25 мл электродного буфера. Суспензию нагревают на кипящей водяной бане до получения прозрачного раствора, не содержащего пузырьков воздуха. Охлаждают агарозу до 40°С и осторожно заливают в предварительно прогретую кассету прибора для электрофореза (с. 97). Оставляют при комнатной температуре на 1—2 ч для полимеризации. [c.175]

Иммобилизация ЛДГ на активированной бромцианом агарозе позволяет достаточно легко получать различные формы ЛДГ, в частности мономер. В зависимости от условий эксперимента и степени активации носителя в образовании ковалентных связей между белком и агарозой может участвовать различное число субъединиц фермента. Необходимым условием получения мономерной формы является наличие препарата ЛДГ, иммобилизованного через одну субъединицу. [c.386]

Определение количества субъединиц, вступивших в реакцию, проводится путем сравнения концентрации иммобилизованного белка до и после обработки 8 М мочевиной. Снижение концентрации белка в суспензии агарозы после инкубации в мочевине в 4 раза позволяет использовать препарат ЛДГ для получения мономера. Обработка иммобилизованного белка 1,5 М мочевиной приводит к разрушению нековалентных взаимодействий между субъединицами ЛДГ, но не влияет на ковалентную связь субъединицы с матрицей (агарозой). Удаление мочевины из системы при промывании буфером ведет одновременно и к удалению диссоциировавших субъединиц. Остающийся связанным белок является мономером ЛДГ, который используется для дальнейших исследований. [c.386]

Таким образом можно приготовить адсорбенты, содержащие множество разных К-групп. Кроме того, присоединив к активированной агарозе диамин [К=(СН2)п—NH2], с полученной в результате со-аминоалкил-агарозой можно далее связать другие соединения. Для этого используется реакция с растворимым в воде карбодиимидом [c.161]

Получение аффинных сорбентов. В ряде случаев необходимо или удобно получать аффинные сорбенты для конкретной цели. Это можно сделать с помощью реакции между выбранным лигандом и либо активированным производным агарозы или другого твердого носителя, либо модифицированной агарозой, несущей спейсер, оканчивающийся реакционноспособной группой. В разд. Материалы для получения аффинных сорбентов перечислены коммерчески доступные активированные агарозы с присоединенными спейсерами. Используя их в качестве исходного материала, можно легко получить аффинный сорбент в мягких условиях прямыми методами. [c.445]

Принцип метода. Анализ включает две стадии а) электрофорез исследуемого белка в геле агарозы и б) повторный электрофорез полученных фракций в геле, содержащем антитела, перпендикулярно к направлению первого разделения. Полоску геля, содержащего фракции исследуемого белка, полученные на первой стадии, помещают на пластинку геля агарозы, содержащего [c.154]

Приготовление геля агарозы, содержащего иммунную сыворотку, и вторая стадия анализа электрофорез фракций, полученных на первой стадии). Специфическую иммунную сыворотку в соответствующем разведении смешивают с 1%-ной агарозой и наслаивают на стеклянную пластинку размером 10 хЮ см слой толщинои 1,5 мм. [c.155]

Проще всего представить себе селекцию ДНК на способность связываться с определепными лигандами. Для этого достаточно иммобилизовать лиганд на нерастворимом носителе, например на агарозе, и пропускать полученную смесь большого числа разнообразных нуклеиновых кислот через колонку. Задержанный на колонке материал после элюции может быть амплифицирован и подвергнут следующему циклу селекции. [c.307]

Фиг. 7. Схема прибора для получения гранул агарозы [22].

Грабб [492] применил иной подход для получения агарозы, в которой не возникало бы электроосмотического тока. Он ввел в нее положительные заряды, обработав ОНЕг-активированную агарозу 2-аминоэтилтриметиламмонийбромидом (гидроброми-дом). Степень замещения зависела от количества использованного СМВг. Производное агарозы с положительным электроосмосом можно смешать с необработанной агарозой и получить гель с нулевым электроосмосом. [c.59]

Приготовление гранулированной агарозы в лабораторных условиях. Получение агарозы Получать агарозу по методу Рассела с сотр. [704] в лабораторных условиях очень трудоемко, и требуются дефицитные реактивы. Поэтому описываем простой и доступный метод Г. Ю. Азкицкого и Г. В. Кобозева [2], основанный на осаждении агаропектина из горячего раствора агар-агара сернокислым аммонием [c.144]

Никаких неприятностей не происходит, если воспользоваться сшитой агарозой. По данным Ансари и Мэйг, колонка с сефарозой L-6B выдерживала воздействие 6 М гуанидинхлорида без видимых изменений своих характеристик в течение 10 мес. Жесткость матрицы позволила им увеличить скорость элюции до 6,8 мл/см -ч. Авторы использовали колонку размером 1,5 х 90 см, а элюцию вели 6 М раствором гуанидинхлорида в 0,1 М Na-фосфатном буфере. pH 7. Для семи белков с молекулярными массами от 2900 до 69 ООО был получен совершенно линейный калибровочный график [Ansari, IVIage, 19771. [c.153]

Таким образом, здесь рекомендуется следующее соотношепие 100 мг Br iV на 1 мл набухшей агарозы. Иногда его увеличивают в два и даже трп раза в пользу Br N для получения более высокой плотности расположения (концентрации) активных групп на матрице. Забегая вперед, заметим, что это далеко не всегда выгодно. [c.349]

Целью работы является сравнение кинетических характеристик ГАФД, растворимой и связанной с нерастворимым носителем, а также получение иммобилизованного димера фермента и изучение его свойств. Методической основой работы является иммобилизация ГАФД на активированной бромцианом агарозе. [c.384]

Иммобилизация ГАФД. В качестве матрицы, на которой иммобилизуют фермент, в работе используют активированную бромцианом агарозу, имеющую 12—14 активированных групп/мл. Для получения препаратов ГАФД, иммобилизованных через одну или две субъединицы, данная степень активации носителя должна быть понижена. Соответствующая обработка агарозы описана на с. 387. [c.384]

Получение иммобилизованных димеров ГАФД и их реассоциация с растворимыми димерами. Диссоциацию тетрамеров фермента на димеры проводят при одновременном воздействии низкой температуры, моновалентных анионов и АТФ. Для этого суспензию агарозы с иммобилизованным ферментом вначале промывают раствором 0,15 М Na l с 5 мМ ЭДТА (pH 7,5), а затем добавляют к ней равный объем [c.385]

Получение иммобилизованного мономера ЛДГ. К одному объему геля агарозы, несущей иммобилизованный тетрамер ЛДГ, добавляют два объема 1,5 М мочевины. Инкубацию проводят в течение 3 ч при комнатной температуре и постоянном осторожном перемешивании, после чего агарозу промывают 10 объемами 1,5 М мочевины, а затем 0,1 М Na-фосфатным буфером (pH 7,4) до полного исчезновения белка в пробе (контролируют по поглощению раствора при 280 нм). Отсутствие в пробе мочевины контролируют с помощью реактива Несслера. В полученной суспензии определяют содержание белка, как указано выше. Измеряют удельную активность иммобилизованного мономера, определяют величины удельной активности, Кт и Утзх для субстратов реакции. Сравнивают полученные величины с соответствующими значениями, полученными для иммобилизованного тетрамера ЛДГ и нативного фермента. [c.388]

Агарозу помещают на стеклянный фильтр и промывают сначала бидистиллированной водой, а затем 0,1 М На-фосфатным буфером, pH 7,4. К суспензии агарозы, количество которой эквивалентно 1 г сухого веса носителя, добавляют 1 мл раствора альдолазы, содержащего фермент в концентрации 1 мг/мл. Предварительно альдолазу обессоливают на колонке с сефадексом 0-50 в указанном буфере, содержащем 5 мМ ЭДТА. Инкубацию проводят 10 мин при комнатной температуре и постоянном осторожном перемешивании на магнитной мешалке. Добавляют глицин до конечной концентрации 70 мМ и инкубируют смесь в течение 2 ч при комнатной температуре и перемешивании. Агарозу промывают указанным буфером с ЭДТА до полного исчезновения в элюате глицина и белка. Отсутствие глицина контролируют по реакции с нингидрином (с. 131). Белок определяют по поглощению при 280 нм. Полученный препарат хранят в холодильнике. [c.390]

Из полисахаридов для иммобилизации наиболее часто используют целлюлозу, декстран, агарозу и их производные. Для придания химической устойчивости линейные цепи целлюлозы и дек-страна поперечно сшивают эпихлоргидрином. В полученные сетчатые структуры довольно легко вводят различные ионогенные группировки. Химической модификацией крахмала сшивающими агентами (формальдегид, глиоксаль, глутаровый альдегид) синтезирован новый носитель — губчатый крахмал, обладаюпщй повышенной устойчивостью к гликозидазам. [c.86]

Сшитые полисахариды широко применяются в промышленности. Наибольший интерес представляют сшитые целлюлозы, крахмалы, декстраны (сефадекс) и агарозы (сефароза), используемые как хроматографические носители наиболее распространенными сшивающими агентами являются эпихлоргидрин и формальдегид. Сшивкой разных полисахаридов получают водонерастворимые субстраты для очистки и определения ферментов. Так, обработкой гликозаминогликанов циклическими имидокарбонатными производными агарозы [248] получен субстрат для определения гликоз-аминогликаназ. [c.275]

В настоящее время применяют ряд усовершенствованных методов разделения нуклеиновых кислот на фракции из суммарного препарата, полученного описанным методом. Это прежде всего хроматография на геле фосфата кальция, ионообменная хроматография (в качестве адсорбентов используют ДЭАЭ-целлюлозу, ДЭЛЭ-сефадекс и др.), ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы, хроматография по сродству на белковых носителях, фильтрация через гели агарозы и сефарозы, гель-электрофорез и др. [c.97]

Природа пористого материала. Перед использованием в молекулярноситовой хроматографии пористый материал должен набухнуть и впитать жидкую фазу, чтобы образовалась наполненная растворителем губка , в которую молекулы могут диффундировать. Поскольку молекулярно-ситовая хроматография проводится с различными жидкими фазами, начиная от воды и кончая углеводородными растворителями, то необходим большой набор различных пористых материалов — от гидрофильных, которые набухают в воде, до липофильных, которые впитывают неполярные органические растворители. Наиболее широко используемым гидрофильным материалом является искусственно сшитый полисахарид, полученный при обработке декстрана (природного полимера глюкозы) различными количествами эпихлоргидрина для получения определенной степени сшитости между цепями. Существует по крайней мере восемь различных степеней сшитости между цепями самый плотный гель будет исключать соединения с молекулярными массами свыше 700. Для полного исключения соединений на большинстве открытых гелей их молекулярные массы должны быть свыше 200 000. Пределы ситового исключения других пористых материалов, включая полиакриламид (имеющий десять различных степеней пористости) и гели агарозы, достигаются для соединений с молекулярными массами до 150000 000. Могут быть также использованы твердые , жесткие материалы, такие как стеклянные зерна с контролируемой пористостью. Молекулярно-ситовую хроматографию, в которой пример няют водную подвижную фазу, иногда называют гель-фильтрационной хроматографией. [c.597]

В — рехроматография фракции 12—22, полученной в опыте Д. на колонке (2,5X40 см) с 4%-ным гелем агарозы. Элюент 0,05 М фосфатный буферный раствор с pH 7,5. Скорость подачи 25 мл/ч. Объем фракций 4 мл. [c.314]

Агароза, согласно Араки [17], является линейным полисахаридом, который построен из О-галактозы и 3,6-ангидро-Ь-галактозы и не содержит ионогенных группировок. Вследствие этого применение суспензии агарозы для гель-хроматографии представляется довольно перспективным [18]. Широкому применению агарозы препятствует в высшей степени трудоемкий процесс выделения ее из агара [17]. Правда, в последнее время предложены два новых метода ее получения. Хьёртен [19] для осаждения кислых примесей из раствора агара применил цетилпиридинийхлорид. Основную трудность при этом представляло удаление избытка осадителя. Рассел, Мид и Полсон [20] предложили выделять агарозу из агара, проводя многократное переосаждение концентрированным раствором полиэтиленгликоля. Полученный обойми способами препарат содержит немного серы, однако в нем совершенно отсутствуют ионогенные группы. В настоящее время суспензия гранулированной агарозы выпускается в продажу (см. табл. 9). [c.38]

Возможность получения количественных данных по связыванию для взаимодействия белков с иммобилизованным пептидом впервые исследована Гавронским и Уолдом [8]. Определена константа диссоциации, равная (2,5 1,0) 10 моль/л, путем прямого титрования 5-белка рибонуклеазы, связанного с 5-пептидом, иммобилизованным на агарозе. Хорошие кривые титрования получены при концентрации 8-белка 10 —моль/л. Когда концентрация связанного белка равна концентрации белок-пептидного комплекса, взаимодействие может быть описано соотношением [c.58]

В табл. 8.11 отсутствует сополимер этилена с малеиновым ангидридом, потому что из-за высокого содержания карбоксильных групп он постепенно все реже используется в аффинной хроматографии, а также для получения иммобилизованных ферментов, как это следует из табл. 11.1. Из табл. 11.1 также ясно видно, что столь же относительно редко используются полиакриламидные гели. Они действительно обладают рядом хороших свойств, но их устойчивость в щелочной среде плохая. При щелочном гидролизе и в сильно кислых средах образуются свободные карбоксильные группы. По-видимому, и.меются очень хорошие перспективы для применения оксиалкилметакрилатных гелей их производство все еще не развито в полной мере, однако с ними накоплен ценный опыт. Использование декстрановых гелей уменьшилось в связи с расширением применения гелей агарозы (за исключением некоторых специальных случаев) в настоящее время гели агарозы являются наиболее широко применяе мыми, как об этом можно судить по данным табл. 11.1. Поэтому в этой главе им уделено большое внимание. [c.228]

Иммунологическая количественная оценка компонентов после гель-фильтрации возможна главным образом при осуществлении несколько модифицированного метода Манчини [58]. В этом случае после гель-фильтрации проводят иммунодиффузию в геле агарозы, содержащем антитела. Существенным моментом в этой методике является создание надежного контакта геля агарозы с гелем сефадекса при сохранении полученной картины разделения. Это удается осуществить, осторожно помещая 1,5%-ный гель агарозы размером 10-10 см на слой сефадекса. По-видимому, этот метод найдет применение при количественном анализе белков, способных к образованию полимеров. На рис. 8 приведен пример количественного анализа высокомолекулярного секреторного JgA в присутствии мономера JgA [59]. [c.272]

Смотреть страницы где упоминается термин Получение NAD-агарозы: [c.351] [c.353] [c.374] [c.378] [c.419] [c.441] [c.451] [c.387] [c.308] [c.183] [c.185] [c.452] [c.54] [c.454] [c.222] [c.232] [c.125] [c.196] [c.198] [c.215] [c.237] [c.249]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология