Приготовление геля агарозы

Приготовление геля агарозы, содержащего иммунную сыворотку, и вторая стадия анализа электрофорез фракций, полученных на первой стадии). Специфическую иммунную сыворотку в соответствующем разведении смешивают с 1%-ной агарозой и наслаивают на стеклянную пластинку размером 10 хЮ см слой толщинои 1,5 мм. [c.155]

Приготовление геля. Взвешивают агарозу (250 мг) и добавляют к ней 25 мл электродного буфера. Суспензию нагревают на кипящей водяной бане до получения прозрачного раствора, не содержащего пузырьков воздуха. Охлаждают агарозу до 40°С и осторожно заливают в предварительно прогретую кассету прибора для электрофореза (с. 97). Оставляют при комнатной температуре на 1—2 ч для полимеризации. [c.175]

В чашки Петри разлейте по 10 мл 1%-ного раствора агарозы с 0,5 мкг/мл бромистого Этидия в любом удобном буфере с низкой концентрацией соли (можно использовать, например, оставшийся после приготовления геля раствор). [c.133]

Готовят агарозный гель, например 1,2%-ный, для разделения РНК длиной 2000—5000 нуклеотидов. Для приготовления геля используют 1,2 г агарозы, 10 мл 10Х буфера, 16,7 мл 36—37%-НОГО формальдегида и 73,3 мл воды. Образцы наносят на гель и проводят электрофорез в 1х буфере до выхода оранжевого G из геля. Окрашивание проводят, как описано в разд. 4.4.1. [c.40]

Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) — один из наиболее эффективных и широко распространенных в настоящее время методов фракционирования и очистки белков. Его используют как на завершающих стадиях эксперимента (аналитический вариант), так и при обработке исходного клеточного гомогената (препаративный вариант). Многие методические приемы, например приготовление гелей полиакриламида н агарозы, окраска белковых полос, элюция белков из гелей и др., роднят ИЭФ с электрофорезом белков, подробно рассмотренным в предыдущей книге [Остерман, 1981]. Фракционирование белков при ИЭФ производится в электрическом поле с помощью тех же приборов, которые используются для электрофореза. Ниже при изложении материала предполагается, что читатель уже знаком с этими методами и аппаратурой. [c.3]

Открытый характер структуры в гелях (рис. 2-18), образуемых производными агарозы, делает крупнозернистые порошки этих гелей удобной твердой основой для приготовления адсорбентов. Гидроксильные группы агарозы часто модифицируют присоединением к ним аминов. Вначале агарозу обрабатывают бромцианом (Вг—С = Ы) в щелочной среде, активируя тем самым углеводную цепь (химическая сторона этого вопроса обсуждается в работе [118]), а затем добавляют амины. Полная реакция описывается следующим уравнением [c.161]

Аффинная хроматография [27—31] представляет собой один из наиболее специфических методов выделения реакционноспособных соединений, в частности ферментов, и даже таких надмолекулярных агрегатов, как вирусы. Сорбентом в этом случае служит гель типа агарозы, к которому ковалентно присоединен подходящий лиганд, например субстрат фермента. Когда раствор, содержащий выделяемое вещество (скажем, фермент), пропускают через колонку с соответствующим образом приготовленным сорбентом, взаимодействие этого вещества с закрепленным на сорбенте лигандом (в данном случае фермента с субстратом) приводит к его удерживанию и, следовательно, к концентрированию. Поскольку сорбция носит обратимый характер, это вещество можно затем элюировать с колонки. Один из вариантов этого приема, который, строго говоря, уже не относится к области хроматографии, заключается в том, что иммобилизованный на геле фермент служит для непрерывного превращения растворенного в подвижной фазе субстрата. Разделение по методу аффинной хроматографии может быть основано на различного рода специфических взаимодействиях, таких, как связывание фермента с ингибитором, гормона с рецептором, антигена с антителом, а также гибридизация полинуклеотидов. Этот метод позволяет выделять даже целые клетки. [c.21]

При исследовании биологических макромолекул эти методы широко применяются в препаративных и реже аналитических целях. Гранулированный материал, используемый для электрофореза, обычно представляет собой сухой порошок, связывающий на своей поверхности различные количества воды. К наиболее употребительным относятся порошки из стекла и пластмассы (поливинилхлорида или чаще сополимера поливинилхлорида и поли винилацетата), гранулированный крахмал и целлюлозный порошок. Можйо также использовать суспензии гидратированных частичек геля, таких, как сефадекс или агароза, приготовленные в виде колонок или блоков. [c.46]

По этому методу электрофорез проводят в суспензии разведенного агарозного геля. Его концентрация может варьировать от 0,12 до 0,2%. Рекомендуется выбирать концентрацию немного выше той, которая требуется для предотвращения оседания пробы. Для приготовления поддерживающего материала необходимое количество агарозы размеш-ивают в горячем буферном растворе, и эту омесь кипятят до полного растворения агарозы. Полученный раствор оставляют на ночь в закрытом сосуде при комнатной температуре. Образовавшуюся на поверхности пленку удаляют и осторожным помешиванием добиваются получения однородной суспензии. Нижний конец колонки закрывают диализной мембраной и при помощи перистальтического насоса колонку наполняют суспензией агарозы. Подлежащая разделению проба должна также содержать агарозу в той же кон- [c.52]

В комбинированных гелях, приготовленных одним из описанных выше способов [984], агароза содержится в такой концентрации, которая достаточна лишь для поддержания формы полиакриламидного геля. Таким образом, разделение нуклеиновых кислот в комбинированном геле зависит в основном от свойств полиакриламидного геля как молекулярного сита. Соответственно нуклеиновые кислоты имеют близкие электрофоретические подвижности в комбинированном и чисто полиакриламидном гелях. [c.381]

Для приготовления агарозных гелей большей концентрации агарозу, чтобы она не пригорала, следует расплавлять на кипящей водяной бане . [c.385]

HI. Дайте агарозе затвердеть, уберите спейсер и оставьте гель во влажной камере при 4°С на 1 ч. Рекомендации по приготовлению и установке гелевых пластин можно найти в проспектах фирм —изготовителей приборов для ИЭФ. [c.160]

Приготовление геля. Фракционирование РНК проводят в 2,2%-ном полиакриламидном геле (поскольку полиакриламидный гель данной концентрации имеет полужидкую консистенцию, рекомендуется сначала сделать пробку из геля более высокой концентрации или 1%-ной агарозы трубки можно закрыть снизу целлофановой пленкой). К смеси 2,2 г акриламида и 0,12 г метиленбисакриламида добавляют 33 мл трис-ацетатного буфера pH 7,8, 50 мл прокипяченной Н2О, 0,075 мл ТЕМЕД, 16 мл 0,5%-ного раствора персульфата аммония. Смесь осторожно перемешивают и заливают для полимеризации в кассету или трубочки электрофоретической камеры (с. 94). Сверху наслаивают трис-ацетатный буфер, разведенный в 3 раза (электродный буфер). [c.173]

Приготовление пластинки геля агарозы. 1 %-ный раствор агарозы, содержащий 1 ммоль лактата кальция, готовят на вероналовом буферном растворе с [c.155]

Из рис. 5.3, б видно, что количество связанного трипсина, определенное экспериментально в ходе исследования равновесного связывания, зависит от концентрации исходного раствора трипсина (в 0,05 М бицине, pH 8,15, и 0,25 М хлориде калия, 4 ч, 4°С), а также что только аффинный сорбент, приготовленный из 4%-ного геля агарозы, содержащего 19,2 мкэкв./мл ж-аминобензамиднна, характеризуется идеальным поведением. Этот носитель имеет существенно более высокую емкость при насыщении, чем аффинный сорбент, приготовленный из 6%-ной агарозы, содержащей [c.66]

Полиакриламидные гели низкой концентрации, применяемые при изучении, например, нуклеиновых кислот или нуклеопротеидных частиц, обладают низкой механической прочностью. Для ее повышения предложено вводить в гель агарозу [984, 1324]. Способы приготовления составных и полиакриламидных гелей практически не отличаются друг от друга. Очищенную агарозу растворяют в воде при нагревании в колбе с обратным холодильником. Полученный раствор, в котором концентрация агарозы должна быть в два раза выше, чем ее конечная концент- [c.101]

В большинстве случаев для приготовления геля используют стандартную 1%-ную агарозу с низким эндоосмосом (табл. 8). Гель наливают на установленный по уровню горизонтальный столик, гребенка должна быть строго перпендикулярна поверхности геля. Для воспроизводимости результатов гребенку всегда вставляйте одинаково (в приборе Ри1зарЬог — 3 см от края геля размерами 20X20 см). [c.72]

Для приготовления геля размером 50X17X0,3 см готовят отдельно следующие растворы а) 120 мл 4,5%)-ной агарозы (3-кратный концентрат) для растворения агарозы суспензию обрабатывают в микроволновой печи или автоклавируют ее [c.153]

Электрофорез проводят в геле агарозы по методу, разработанному Оман и соавторами (Ohman е. а., 1971), используют пластинки, приготовленные следующим образом. На предметные стекла (2,5X8 см) наливают по 2 мл 1 % раствора агарозы ( Serva ) в 0,04 М [c.134]

Агароза для электрофореза выпускается обычно в виде лио-филизированного порошка. Для приготовления геля выбр-анной концентрации навеску порошка растйоряют в соответствующем буфере и выдерживают на кипящей водяной бане или в термостате при 90—95 около 2 ч для образования истинного раствора полимера. Иногда раствор агарозы просто кипятят с обратным холодильником. [c.19]

Приготовление гранулированного геля агарозы Бенгтссон и Филинсон [195] разработали метод получения сферически гранулированной агарозы. Однако для этого метода требуется особое оборудование. [c.144]

Уриель и Бергес 813] предложили в качестве поддерживающей среда для электрофореза смесь полиакриламида и агарозы которая обладает совокупностью преимуществ механических и физико-химических свойств обоих гелей. Подобный смешанный гель более удобен в работе вследствие своей эластичности. Принципиально важным преимуществом является то, что полимеризация смесд может происходить в присутствии атмосферного воздуха, что упрощает процедуру приготовления геля д позволяет получать любой тип геля без ограничения его формы и размера. [c.187]

Наиболее широкое распространение среди носителей для гель-хроматографии белков получили сорбенты, приготовленные на основе декстрана (сефадексы, сефакрилы, молселекты), полиакриламида (биогели Р, акрилексы) и агарозы (сефарозы, биогели А) и др. Набухая в воде, они образуют гели. [c.106]

А. используют при приготовлении плотных бактериальных сред, применяемых для культивирования и диагностики бактерий, а также как желнрующее в-во в пищевой (особенно в кондитерской) пром-сти. Агароза-носитель в гель-хроматографии, аффинной хроматографии, гелевом электрофорезе, иммунодиффузии и иммуноэлектрофорезе. [c.28]

При фракционировании веществ с низкой скоростью диффузии время установления равновесия можно существенно уменьшить, применяя тонко измельченный гель. При этом очень важно, чтобы частицы имели стандартную сферическую форму. Предложено два способа приготовления шарообразных гранул агара и агарозы 1) в присутствии стабилизирующих агентов нагретый до 50° раствор агарозы при перемешивании специальной мешалкой в смеси бензола и толуола суспендируется в виде шариков. По охлаждении агароза застывает в правильные сферические гранулы, которые затем отделяют декантацией. При определенном содержании полисахарида (1 — 16%,) они служат в набухшем состоянии oтличн м [c.38]

АГАР (агар-агар) — продукт, получаемый из некоторых морских водорослей (агарофитов), характерным свойством к-рого является способность давать плотные гели. А. неоднороден содержит 70—80% полисахаридов, 10—20% воды, 1,5—4% минеральных в-в. В составе полисахаридов обнаружены D- и Ъ-галактозы, 3,6-ангидрогалактоза, пентозы, D-глю-куроновая кислота и пировиноерадная кислота химич. строение полисахаридов изучено мало. Получены две фракции полисахаридов агароза и амило-пектин. Агароза — линейный полисахарид, образованный из чередующихся остатков p-D-галакто-пиранозы и 3,6-ангидро а-Ь-галактопиранозы обладает ярко выраженной способностью к образованию гелей. Амилопектин является, по-видимому, смесью полисахаридов очень сложного строения, в состав к-рых входит глюкуроновая к-та и эфирно-связанная серная к-та. А. применяется в пищевой, особенно в кондитерской пром-сти, в микробиологии при приготовлении плотных сред для выращивания микроорганизмов. [c.13]

Агар-агар. Высокомолекулярный полисахарид, содержится в некоторых морских водорослях (анфельция и др.) и представляет собой смесь агарозы и агаропектина, образованных остатками В-галактозы и ее производными. Агар-агар хорошо растворяется в воде при нагревании. Водные растворы застывают в виде геля, поэтому агар-агар широко используется в бактериологии для приготовления твердых питательных сред и в кондитерской промышленности для изготовления желе, мармелада. [c.248]

Приготовление пробы. По мнению Дэвиса [281], включение исследуемой пробы в стартовый гель препятствует тепловой конвекции диффузии веществ, что приводит к более эффективному разделению. Однако некоторые белки повреждаются в результате полимеризации геля [1407] или под действием флуоресценции [975]. Кроме того, белки могут подавлять полимеризацию геля [570]. Если есть подозрение, что флуоресценция или персульфат (см. ниже) приводят к возникновению артефактов, вместо стартового геля желательно использовать суспензию сефадекса 0-200, гл1ицв рин, сахарозу или мочевину. В то же время эти материалы сам и способны при определенных условиях стать причиной артефактов. Так, сефадекс 0-200 может задерж1И1вать движение белков [173], а сахароза — взаимодействовать с 8-аминогруппой лизина [455] или боратом с образованием отрицательно заряженного комплекса. Поэтому присутствие сахарозы в боратном буфере может привести к эффекту усеченного конуса и боковому распространению белков в процессе электрофореза [759]. С другой стороны, мочевина вызывает диссоциацию белков на субъединицы, препятствует затвердению агарозы в агарозно-полиакриламидных гелях [574] и влияет на активность водородных ионов. [c.97]

Если для разделения белков в первом направлении прибегают к изоэлектрофокусированию (перекрестное иммуноэлектрофокусирование), то возникает ряд проблем. Агароза является мало подходящей средой для ИЭФ, поскольку этот метод требует среды, в которой отсутствует электроосмос (см. разд. 1.12.2). Можно, конечно, использовать для ИЭФ полиакриламидный гель, а разделение во втором направлении проводить в агарозном геле, содержащем антитела. Однако, как будет видно из дальнейшего изложения, применение разных сред также имеет ряд недостатков. Один из возможных путей решения этой проблемы заключается в приготовлении агарозы, из которой получается гель почти с нулевым зарядом (см. разд. 1.9.2). В этом случае весь анализ (изоэлектрофокусирование и последующий электрофорез в геле, содержащем антитела) можно проводить в агарозном геле. Таким способом осуществляли перекрестное иммуноэлектрофокусирование Йохансон и йертен [631], а также Вейс и др. [1392]. Первые авторы проводили электрофорез во втором направлении при pH 8,2—8,6, так как в применяемой ими среде подвижность антител при этом pH была близка к нулю. [c.255]

Рис. 7. Приготовление перпендикулярно-градиентного денатурирующего геля. А. Расположение стеклянных пластин и спейсеров. Левый рисунок представляет собой вид спереди стеклянных пластин со вставленными спейсерами для электрофореза. Обратите внимание, что передняя пластина имеет форму прямоугольника (без ушек ), а задняя пластина имеет ушки . Левый боковой спейсер помещается между пластинами так, что между ним и основанием геля образуется зазор в 3—4 см. Правый спейсер располагается между плас-стииами от вершины до самого основания геля. Верхний спейсер вставлен на 1 см ниже пластины с ушками и плотно пригнан к боковым спейсерам. Место соединения верхнего и правого бокового спейсеров смазывают небольшим количеством вакуумной смазки. Правый рисунок представляет собой вид пластин сзади. Б. Соединенные пластины и аппарат для электрофореза. Собранные пластины и спейсеры закрепляют в аппарате для электрофореза основание и правую сторону пластин заливают расплавленной агарозой. Дно заполняют, наливая 50 мл агарозы в кювету, в которой крепятся пластины. После застывания агарозы аппарат для электрофореза переворачивают на правую сторону и через отверстие в нем и зазор с левой стороны заливают

Качество электрофореза проверяют с помощью хемископа ), а затем гель фотографируют камерой Поляроид , снабженной красно-оранжевым фильтром. На рис. 5.1 показаны полностью рестрицированные и разделенные путем электрофореза образцы ДНК из разных источников. Полосы калибровочных фрагментов ДНК (ДНК фага 1, рестрици-рованная HitidWl) должны быть четкими и хорошо разделившимися (дорожка 1), чтобы при необходимости можно было бы построить калибровочную кривую. Если полосы разделяются плохо, разрешение можно повысить либо увеличив время, либо подобрав соответствующую концентрацию агарозы ") ). Препараты плазмидной ДНК, обработанной рестриктазой (дорожка 2), должны достаточно хорошо разделиться, чтобы дальнейшую работу, например приготовление проб (разд. 5.6) либо выделение определенных фрагментов (разд. 1.5), можно было бы проводить без затруднений и иметь незагрязненные препараты. При электрофорезе рестрицированной тотальной ДНК агробактерий обычно видно множество полос различной интенсивности (дорожка 3), тогда как при рестрикции геномной ДНК растительного или животного происхождения (дорожка 4) [c.283]

При приготовлении твердых сред для культивирования хемолитоавтотрофных ацидофильных бактерий к жидким средам добавляют отмытый агар, агарозу. Используют также гелевые пластинки или пластинки из полиакриламидного геля. [c.72]

Ввиду его высокой концентрации формальдегид должен быть очень чистым. Достаточно очищен формальдегид фирмы Ма1-lin kroat . Следует работать со свежеприготовленным раствором формальдегида, без следов помутнения. Нейтрализовать раствор до pH 7 можно NaOH. Для приготовления денатурирующего геля на основе агарозы формальдегид добавляют к расплавленному водному раствору агарозы при бО"" вместе с буфером. [c.139]

По вполне понятным причинам при поиске аффинных сорбентов внимание в первую очередь было обращено на субстрат рестриктаз — ДНК- В ряде случаев для очистки этих ферментов была использована колонка с однонитевой ДНК-агарозой, приготовленной смешиванием расплавленной горячей агарозы с денатурированной дезоксирибонуклеиновой кислотой тимуса теленка по методу Шеллера с сотр. [236]. Предполагалось [217], что с сорбентом преимущественно будут связываться неспецифические нуклеазы, а рестриктазы, субстратом которых является нативная ДНК, окажутся во фракции несорбировавшихся белков. Для некоторых рестриктаз это предположение, согласно утверждению Робертса [217], оправдалось и была получена хорошая их очистка. Наряду с этим было обнаружено, что некоторая часть исследованных специфических эндонуклеаз достаточно прочно связывалась с однонитевой иммобилизованной ДНК и элюировалась градиентом соли острыми пиками. В этом случае тоже наблюдалась значительная очистка этих ферментов от неспецифических нуклеаз. Хроматография на однонитевой ДНК, иммобилизованной на агарозе или целлюлозе, была применена на последней стадии очистки рестриктаз Hha I [174], Bsp I [152] и E oR I [184]. В качестве сорбента для очистки специфических эндонуклеаз нашла применение и нативная ДНК, иммобилизованная на полиакриламидном геле или целлюлозе, которые были использованы в случае Bsu I [58] и ВЬе I [c.155]

Техника работы на агарозе. Приготовление колонки. Техника упаковки агарозы в колонку не отличается от уяаковки геля сефадекса. Размер колонки может варьировать в зависимости от дели работы. Но наиболее благоприятное отношение высоты столба геяя к диаметру является 20 1. Благодаря малой вариабильности размера гранул геля колонка наполняется очень хорошо следуюш,им образом. Суснензию агарозы разводят соответствующим образом до такой консистенции чтобы из нее можно было легко удалить пузырьки воздуха. Колонку, установленную вертикально, наполняют буфером я через воронку вливают порцию суспензии геля. Гранулам геля дают осесть на дно, открывают кран для оттока буфера и медленно наполняют колонку гелем до нужной высоты. Колонку уравновешивают промыванием буферным раствором. Если в работе используют коммерческий препарат агарозы, то его нужно отмыть от содержащегося в нем азида натрия Чтобы достичь воспроизводимых результатов, важно очень аккуратно наполнить колонку. Столб геля в колонке стабилизируй ют до определенной высоты, применяя постоянное гидростатическое давление в течение 24 часов. [c.145]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология