Агароза получение геля

Иммунологическая количественная оценка компонентов после гель-фильтрации возможна главным образом при осуществлении несколько модифицированного метода Манчини [58]. В этом случае после гель-фильтрации проводят иммунодиффузию в геле агарозы, содержащем антитела. Существенным моментом в этой методике является создание надежного контакта геля агарозы с гелем сефадекса при сохранении полученной картины разделения. Это удается осуществить, осторожно помещая 1,5%-ный гель агарозы размером 10-10 см на слой сефадекса. По-видимому, этот метод найдет применение при количественном анализе белков, способных к образованию полимеров. На рис. 8 приведен пример количественного анализа высокомолекулярного секреторного JgA в присутствии мономера JgA [59]. [c.272]

Она широко используется как носитель для иммобилизации. Однако стоимость агарозы довольна высока, поэтому разрабатываются различные методы ее модификации с целью получения легко регенерируемых форм. При охлаждении горячего 2—6%-ного водного раствора агарозы до температуры ниже 45°С образуются прочные крупнопористые гели, представляющие собой сложную смесь из заряженных и нейтральных полисахаридов. В процессе образования геля индивидуальные полисахаридные цепи образуют двойные спирали, которые далее агрегируют с образованием узлов . При температуре около 100°С гель агарозы плавится, поэтому в отличие от сефадексов его нельзя автоклавировать. Высушивание агарозы приводит к необратимой деструкции геля, поэтому его необходимо хранить в виде водной суспензии. [c.14]

Несшитые полимерные гели. Этот способ иммобилизации основан на свойстве природных полисахаридов, таких, как крахмал, агар-агар, каррагинан и агароза, образовывать гели при охлаждении их горячих водных растворов. Методика состоит в том, что водную суспензию полисахарида нагревают до температуры 80—90°С, добиваясь его полного растворения, и полученный горячий раствор медленно охлаждают. Непосредственно перед началом гелеобразования (обычно между 30 и 50°С) в систему добавляют водный раствор фермента. При дальнейшем охлаждении образуется гель, содержащий иммобилизованный фермент. Для улучшения механических свойств иммобилизованного препарата процесс гелеобразования иногда проводят в порах вспененного полиуретана. [c.60]

По этому методу электрофорез проводят в суспензии разведенного агарозного геля. Его концентрация может варьировать от 0,12 до 0,2%. Рекомендуется выбирать концентрацию немного выше той, которая требуется для предотвращения оседания пробы. Для приготовления поддерживающего материала необходимое количество агарозы размеш-ивают в горячем буферном растворе, и эту омесь кипятят до полного растворения агарозы. Полученный раствор оставляют на ночь в закрытом сосуде при комнатной температуре. Образовавшуюся на поверхности пленку удаляют и осторожным помешиванием добиваются получения однородной суспензии. Нижний конец колонки закрывают диализной мембраной и при помощи перистальтического насоса колонку наполняют суспензией агарозы. Подлежащая разделению проба должна также содержать агарозу в той же кон- [c.52]

Приготовление геля. Взвешивают агарозу (250 мг) и добавляют к ней 25 мл электродного буфера. Суспензию нагревают на кипящей водяной бане до получения прозрачного раствора, не содержащего пузырьков воздуха. Охлаждают агарозу до 40°С и осторожно заливают в предварительно прогретую кассету прибора для электрофореза (с. 97). Оставляют при комнатной температуре на 1—2 ч для полимеризации. [c.175]

Принцип метода. Анализ включает две стадии а) электрофорез исследуемого белка в геле агарозы и б) повторный электрофорез полученных фракций в геле, содержащем антитела, перпендикулярно к направлению первого разделения. Полоску геля, содержащего фракции исследуемого белка, полученные на первой стадии, помещают на пластинку геля агарозы, содержащего [c.154]

Приготовление геля агарозы, содержащего иммунную сыворотку, и вторая стадия анализа электрофорез фракций, полученных на первой стадии). Специфическую иммунную сыворотку в соответствующем разведении смешивают с 1%-ной агарозой и наслаивают на стеклянную пластинку размером 10 хЮ см слой толщинои 1,5 мм. [c.155]

Pu . JOl. Разделение сыворотки крови человека с помощью электрофореза в геле агарозы и кривые, полученные при денситометрическом измерении электрофореграмм. Нормальная сыворотка (А) и сыворотки больных с множественной миеломой (Б), циррозом печени (В) и нефротическим синдромом (Г). [c.330]

Добавляют агарозу к однократному ТАЭ/БЭ-буферу > в количестве, необходимом для получения требуемой концентрации и толщины геля 0,5—0,7 см. Полностью растворяют агарозу при кипячении- ). [c.282]

Агароза, согласно Араки [17], является линейным полисахаридом, который построен из О-галактозы и 3,6-ангидро-Ь-галактозы и не содержит ионогенных группировок. Вследствие этого применение суспензии агарозы для гель-хроматографии представляется довольно перспективным [18]. Широкому применению агарозы препятствует в высшей степени трудоемкий процесс выделения ее из агара [17]. Правда, в последнее время предложены два новых метода ее получения. Хьёртен [19] для осаждения кислых примесей из раствора агара применил цетилпиридинийхлорид. Основную трудность при этом представляло удаление избытка осадителя. Рассел, Мид и Полсон [20] предложили выделять агарозу из агара, проводя многократное переосаждение концентрированным раствором полиэтиленгликоля. Полученный обойми способами препарат содержит немного серы, однако в нем совершенно отсутствуют ионогенные группы. В настоящее время суспензия гранулированной агарозы выпускается в продажу (см. табл. 9). [c.38]

Полиакриламидные гели низкой концентрации, применяемые при изучении, например, нуклеиновых кислот или нуклеопротеидных частиц, обладают низкой механической прочностью. Для ее повышения предложено вводить в гель агарозу [984, 1324]. Способы приготовления составных и полиакриламидных гелей практически не отличаются друг от друга. Очищенную агарозу растворяют в воде при нагревании в колбе с обратным холодильником. Полученный раствор, в котором концентрация агарозы должна быть в два раза выше, чем ее конечная концент- [c.101]

Те же авторы [359] проводили на сефадексах 0-100 и 0-200 двумерное разделение соединений, входящих в состав сыворотки крови человека. При этом в одном направлении проводили разделение методом гель-фильтрации, а в перпендикулярном направлении — разделение методом электрофореза. Моррис [360, 361] разделял на сефадексах 0-100 и 0-200 белки с молекулярной массой до 180 000. Он кондиционировал сефадекс в течение 48 ч, а затем выдерживал пластинки в про-явительной камере 18 ч для достижения равновесия. В 1962 г. Доун и Краузе [357] применили сефадекс для тонкослойного электрофореза белков. Сефадекс 0-50 ( тонкий ) смешивали с избытком буферного раствора (1 7,5) и выдерживали в нем 24 ч, после чего буферный раствор отфильтровывали и полученный гель, который был пластичным, но не жидким, переносили на стеклянные пластинки, снабженные бортиками. Фей-зелла и сотр. [362] описали разделение белков на сефадексах 0-25, 0-100 и 0-200. Сефадекс выдерживали при перемешивании 30 мин в подходящем буферном растворе, затем давали смеси отстояться и сливали жидкость. Эту операцию повторяли пять-шесть раз, с тем чтобы общее время контакта с буферным раствором было не менее 48 ч для сефадекса 0-25 и не менее 72 ч для сефадексов 0-100 и 0-200. Вендрили и сотр. [363] увеличивали твердость слоев сефадекса для электрофореза, добавляя к ним агарозу. Для этого 1,25 г агарозы растворяли в 65 мл буферного раствора и осторожно добавляли 4 г сефадекса 0-200, 5 г сефадекса 0-100 или 6,5 г сефадекса 0-75, предварительно приведенных в равновесие с буферным раствором. [c.80]

Получение иммобилизованного мономера ЛДГ. К одному объему геля агарозы, несущей иммобилизованный тетрамер ЛДГ, добавляют два объема 1,5 М мочевины. Инкубацию проводят в течение 3 ч при комнатной температуре и постоянном осторожном перемешивании, после чего агарозу промывают 10 объемами 1,5 М мочевины, а затем 0,1 М Na-фосфатным буфером (pH 7,4) до полного исчезновения белка в пробе (контролируют по поглощению раствора при 280 нм). Отсутствие в пробе мочевины контролируют с помощью реактива Несслера. В полученной суспензии определяют содержание белка, как указано выше. Измеряют удельную активность иммобилизованного мономера, определяют величины удельной активности, Кт и Утзх для субстратов реакции. Сравнивают полученные величины с соответствующими значениями, полученными для иммобилизованного тетрамера ЛДГ и нативного фермента. [c.388]

В настоящее время применяют ряд усовершенствованных методов разделения нуклеиновых кислот на фракции из суммарного препарата, полученного описанным методом. Это прежде всего хроматография на геле фосфата кальция, ионообменная хроматография (в качестве адсорбентов используют ДЭАЭ-целлюлозу, ДЭЛЭ-сефадекс и др.), ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы, хроматография по сродству на белковых носителях, фильтрация через гели агарозы и сефарозы, гель-электрофорез и др. [c.97]

Природа пористого материала. Перед использованием в молекулярноситовой хроматографии пористый материал должен набухнуть и впитать жидкую фазу, чтобы образовалась наполненная растворителем губка , в которую молекулы могут диффундировать. Поскольку молекулярно-ситовая хроматография проводится с различными жидкими фазами, начиная от воды и кончая углеводородными растворителями, то необходим большой набор различных пористых материалов — от гидрофильных, которые набухают в воде, до липофильных, которые впитывают неполярные органические растворители. Наиболее широко используемым гидрофильным материалом является искусственно сшитый полисахарид, полученный при обработке декстрана (природного полимера глюкозы) различными количествами эпихлоргидрина для получения определенной степени сшитости между цепями. Существует по крайней мере восемь различных степеней сшитости между цепями самый плотный гель будет исключать соединения с молекулярными массами свыше 700. Для полного исключения соединений на большинстве открытых гелей их молекулярные массы должны быть свыше 200 000. Пределы ситового исключения других пористых материалов, включая полиакриламид (имеющий десять различных степеней пористости) и гели агарозы, достигаются для соединений с молекулярными массами до 150000 000. Могут быть также использованы твердые , жесткие материалы, такие как стеклянные зерна с контролируемой пористостью. Молекулярно-ситовую хроматографию, в которой пример няют водную подвижную фазу, иногда называют гель-фильтрационной хроматографией. [c.597]

В — рехроматография фракции 12—22, полученной в опыте Д. на колонке (2,5X40 см) с 4%-ным гелем агарозы. Элюент 0,05 М фосфатный буферный раствор с pH 7,5. Скорость подачи 25 мл/ч. Объем фракций 4 мл. [c.314]

В табл. 8.11 отсутствует сополимер этилена с малеиновым ангидридом, потому что из-за высокого содержания карбоксильных групп он постепенно все реже используется в аффинной хроматографии, а также для получения иммобилизованных ферментов, как это следует из табл. 11.1. Из табл. 11.1 также ясно видно, что столь же относительно редко используются полиакриламидные гели. Они действительно обладают рядом хороших свойств, но их устойчивость в щелочной среде плохая. При щелочном гидролизе и в сильно кислых средах образуются свободные карбоксильные группы. По-видимому, и.меются очень хорошие перспективы для применения оксиалкилметакрилатных гелей их производство все еще не развито в полной мере, однако с ними накоплен ценный опыт. Использование декстрановых гелей уменьшилось в связи с расширением применения гелей агарозы (за исключением некоторых специальных случаев) в настоящее время гели агарозы являются наиболее широко применяе мыми, как об этом можно судить по данным табл. 11.1. Поэтому в этой главе им уделено большое внимание. [c.228]

Гели декстрана и агарозы подвержены действию микроорганизмов (бактерий и плесени), вызывающих деградацию геля и изменение его хроматографических свойств. Кроме того, если хроматографирование ведется на инфицированном геле, выход разделенных соединений (биополимеров) уменьшается и в элюате появляются примеси. Хотя чисто синтетические гели, например полиакриламид, полиметилметакрилат, полистирол, сами и не разрушаются микробами, эти микробы могут расти в той среде, в которой суспендирован гель, а также на поверхности геля. В результате этого в элюате, полученном на гелях этого типа, также появляются примеси. [c.376]

Грабб [492] применил иной подход для получения агарозы, в которой не возникало бы электроосмотического тока. Он ввел в нее положительные заряды, обработав ОНЕг-активированную агарозу 2-аминоэтилтриметиламмонийбромидом (гидроброми-дом). Степень замещения зависела от количества использованного СМВг. Производное агарозы с положительным электроосмосом можно смешать с необработанной агарозой и получить гель с нулевым электроосмосом. [c.59]

Наиболее часто для определения фенотипа трансферрина используют электрофорез в крахмальном геле. Разделение проводят в боратном буфере Смитиса [1199] или в неоднородной трис-цитратной системе Паулика [1028]. Для установления фенотипа трансферринов животных применяют и другие буферные системы, в частности систему Аштона и Брейдена [65]. Спунер и Бакстер [1221] использовали буфер трис-какодиловая кислота (pH 7,45). Кроме того, с этой целью проводят электрофорез в полиакриламидном геле в трис-глициновом буфере при pH 8,8 [960] или при pH 9,3 [1275]. Наличие в сыворотке человека того или иного вариантного трансферрина обнаруживают также с помощью электрофореза в агаровом геле [630], а для подтверждения полученных результатов осуществляют во втором направлении иммуноэлектрофорез [424]. Однако в этом случае картина оказывается менее четкой, чем при электрофорезе в крахмальном или полиакриламидном геле. В последнее время стали применять другой подход вначале сыворотку подвергают изоэлектрофокусированию в геле из специальной марки агарозы (лишенной электроэндосмоса), а затем проводят электрофорез в геле, содержащем антитела [492, 631]. [c.346]

Ранее был описан активированный перйодатом сефадекс (0-50 или 0-75) [6]. После присоединения иммуноглобулина и восстановления шиффовых оснований полученные иммуноадсорбенты характеризовались очень низким неспецифическим связыванием, но гели оказались механически весьма неустойчивыми и быстро забивались. Кроме того, гели имели очень низкую емкость, потому что антитела исключались из внутреннего объеме шариков. Хотя агароза имеет больший размер пор, этот гель активируется периодатным окислением в незначительной степени, так как реакция протекает только по концам цепей полисахаридных молекул. Однако периодатным окислением может быть активирована поперечно-сшитая агароза. В результате побочной реакции, сопровождающей процесс поперечной сшивки с эпихлорогидрином, на геле образуются гликоли. Периодатное окисление этих гликолей приводит к альдегидам, которые могут реагировать с аминогруппами белка. Образовавшиеся шиффовы основания могут быть далее восстановлены, как описано для других матриц. Иммуносорбенты, полученные таким путем, характеризуются очень хорошими хроматографическими свойствами, сочетая жесткость агарозных шариков с химической стабильностью и низким неспецифическим связыванием. Могут быть достигнуты высокие скорости потока даже при использовании таких хаотропных агентов, как 6,0 М солянокислый гуанидин [7]. [c.68]

Иммобилизация растительных лектинов на агарозе. После активации 40 мл агарозы бромоцианом NBr (6 г) добавляют к гелю 60 мл ледяного 0,1 М фосфата натрия (pH 7,4), содержащего конканавалин А (500 мг) и а-метил-о-маннопиранозид (0,1 М). Через 16 ч при 4 С добавляют глицин (2 г) и продолжают инкубацию в течение 8 ч при комнатной температуре. Полученный адсорбент содержит 5,5 мг белка/мл геля. Аналогично присоединяют к активированной агарозе агглютинин проростков пшеницы (1,4 мг/мл) в присутствии 0,1 М N-ацетил-о-глюкозамина на 1 мл геля присоединяется 1,1 мг белка. [c.150]

Иммобилизация гепарина на носителе осуществляется с помощью конденсирующего агента ЭЭДХ через шестиуглеродную вставку. Последняя присоединяется к носителю после активации и поперечной сшивки шариков агарозы эпихлорогидрином. Полученный комплекс чрезвычайно устойчив даже в присутствии сильных диссоциирующих агентов. 1 мл геля содержит 4—б мг иммобилизованного гепарина с активностью 600—900 USP Е/мл. [c.151]

При мечении с использованием олигонуклеотидной затравки, как и в случае других методов получения проб с высокой удельной активностью, используют фрагменты ДНК, отделенные от вектора с помощью обработки рестриктазами и электрофоретического разделения в агарозе. Однако большое преимущество мечения с использованием олигонуклеотидов перед другими методами заключается в том, что перед мечением ДНК не требуется элюировать из агарозного геля. Вместо этого полосу, содержащую известное количество нанесенной на гель ДНК, локализуют с помощью хемископа и вырезают из геля. Кусочек геля взвешивают, рассчитывают в нем количество ДНК и аликвоту, в которой содержится только 10 нг ДНК, используют непосредственно в реакции. Перед мечением кусочек агарозы расплавляют на кипящей водяной бане (при этом ДНК одновременно денатурирует и выходит нз агарозы), затем его охлаждают до 37 °С и аликвоту, содержащую 10 нг ДНК, вно- [c.297]

Готовят гель, расплавив ) агарозу ) в НгО, охлаждают до 60 °С и добавляют lOXMOPS до получения однократного раствора и формальдегид до конечной концентрации 2,2 М. Например, на 100 мл 1,5 о/о-ного геля [c.384]

Смотреть страницы где упоминается термин Агароза получение геля: [c.196] [c.249] [c.248] [c.219] [c.351] [c.378] [c.308] [c.222] [c.232] [c.237] [c.18] [c.165] [c.276] [c.157] [c.59] [c.353] [c.196] [c.196] [c.101] [c.180] [c.174] [c.197] [c.63]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология