Солюбилизация белков

При хроматографии и электрофорезе белков использование органических растворителей исключается из-за их денатурирую щего действия, в результате которого белки переходят в нерастворимое сйстояние. Подобное действие могут оказывать и некоторые органические соединения. Поэтому при разделении белков необходим тщательный выбор селективных водных буферных систем. Однако необходимость солюбилизации белков, в особенности тех из них, которые ассоциированы с биологическими мембранами, привела к введению детергентов — как ионных, так и неионных, а также таких реагентов, как мочевина и гидрохлорид гуанидина, которые разрывают водородные связи и препятствуют гидрофобным взаимодействиям. Даже будучи денатурированными, многие белки остаются растворимыми в присутствии этих соединений, особенно после расщепления ди-сульфидных связей дитиотретиолом или меркаптоэтанолом. [c.105]

Такие денатурирующие агенты, как мочевина и гуанидинхлорид, нарушают ионные взаимодействия. Нативные белки, подвергающиеся воздействию высоких концентраций этих растворителей, оказываются полностью развернутыми, но ковалентные связи, в том числе дисульфидные мостики, остаются интактны-ми. При экстремальных значениях pH нарушаются ионные взаимодействия между полипептидными цепями, а детергенты и органические растворители разрушают гидрофобные связи между боковыми цепями полипептидов. Эффективность солюбилизации белков каждым из таких агентов может варьировать. Это происходит вследствие того, что взаимодействия между белками в нерастворимых включениях неодинаковы, поскольку зависят от того, какие именно белки входят в их состав [и. [c.117]

Определена также структура солюбилизированного цитохрома Ьв из микросом печени. Хотя точная функция его неизвестна, можно думать, что он играет роль, подобную роли цитохрома с, взаимодействуя с ферментативной системой эндоплазматического ретикулума, катализирующей образование ненасыщенных жирных кислот. Белок содержит 93 аминокислотных остатка, а еще 44 (преимущественно гидрофобных) отщепляются с Ы-конца в процессе солюбилизации белка. Вероятно эта Ы-концевая часть служит гидрофобным якорем, погружаемым в мембрану эндоплазматического ретикулума. Гем в цитохроме Ьв не связан ковалентно с белком, но прочно удерживается между двумя боковыми цепями гистидинов. По способу свертывания цепи этот белок совершенно не похож ни на цитохром с, ни на миоглобин. И в этом случае не видно путей переноса электрона от атома железа на поверхность молекулы [23]. [c.375]

Приготовление суспензии и солюбилизация белков (замешивание) [c.429]

Основной проблемой очистки белков является подбор детергента и оптимальных условий солюбилизации их молекул. Детергент не должен нарушать высшие типы пространственной организации белков, а лишь замещать молекулы липидов, контактирующие с гидрофобными участками белковой глобулы. Критерий максимальной солюбилизации белка — переход его молекул в надосадочную жидкость после осаждения мембран. Причем важным требованием процедуры солюбилизации является сохранение функциональной активности биополимера и его стабилизация. Для этого в исследуемую систему добавляют экзогенные фосфолипиды, глицерин, ингибиторы протеаз. Следует отметить, что получаемые при очистке белок-детергентные комплексы могут содержать значительные количества связанных фосфолипидов, что необходимо учитывать при дальнейшем разделении и характеристике получаемого препарата белка. [c.224]

Солюбилизация ферментов в обращенные мицеллы поверхностно-активных веществ в органических растворителях. К 2 мл 0,1 М раствора Аэрозоля ОТ в октане добавляют 5—150 мкл 10—50 мМ водного буферного раствора, pH 3—11 (концентрация не должна превышать 50 мМ, при наличии высокой ионной силы следует использовать буферный раствор с более низкой концентрацией). Смесь интенсивно встряхивают до образования оптически прозрачного раствора. Для ускорения процесса образования прозрачного раствора, содержащего большие количества буферного раствора, добавляют буферный раствор порциями по 2—3% (40—60 мкл). Далее добавляют 5—20 мкл водного раствора фермента и опять интенсивно встряхивают до образования оптически прозрачного раствора. Фермент можно вносить и в виде навески сухого обессоленного порошка, однако время растворения фермента в этом случае в системе обращенных мицелл с низким содержанием воды (меньше 2%) существенно увеличивается (от нескольких десятков секунд при внесении водного раствора белка до десятков минут и даже часов при внесении сухого белка). Для солюбилизации белка и определения активности включенного фермента наиболее широко используются растворы Аэрозоля ОТ в октане в концентрациях от 30 до 300 мМ. [c.151]

Наиболее широко распространенным детергентом, применяемым для солюбилизации мембран, является ДСН. В концентрации более 1% он переводит в растворимую форму, по-видимому, все мембранные белки бактериальных [613] и эукариотических [358, 755, 829, 896] клеток. При использовании ДСН в более низких концентрациях достигается лишь частичная солюбилизация мембранных компонентов [781], что позволяет фракционировать белки в соответствии с растворимостью их комплексов, образующихся при разных концентрациях ДСН [167]. Присутствие мочевины [766, 776] и обработка ультразвуком [1041] способствуют солюбилизации белков в ДСН. [c.316]

I Солюбилизация белка и гидролиз протеазой [c.345]

Нуццоло с соавторами [182] использовали при солюбилизации белков хелатирующий агент (соль алюминия). Это предотвращает окисление полифенолов в ходе экстрагирования далее они проводили осаждение посредством лимонной кислоты. Указанный процесс даст возможность получать при выходе азота 60 % светло-кремовый изолят, содержащий 95 % белков и 0,4 % полифенолов. [c.467]

Томпсон с соавторами [115], отмечая, что тот же гексамета-фосфат натрия в нейтральной или щелочной среде благоприятствует растворению белков, предложили проводить солюбилизацию белков при pH 7 в его присутствии (2%), затем разбавлять экстракт перед подкислением до pH 2,5. Этот дорогостоящий процесс дает возможность получить изолят с высоким содержанием минеральных веществ (12,2%). Указанные работы были возобновлены позднее с уменьшенной дозой гексаметафосфата при том же pH солюбилизации. Этими авторами (1982 г.) был получен изолят с содержанием минеральных веществ 0,25 % (при добавлении метабисульфита натрия) и осаждение проводилось без разбавления при pH 4. Выход экстракта по этой технологии составляет 71 %, а осадка — 63% состав изолята несколько улучшается (табл. 9.31), как и его цвет. [c.470]

Необходимо упомянуть также еще об одной области, где практическое знание закономерностей образоаания и поведения мииелляр-ных структур имеет прямое отношение к исследованиям биологических мембран. Речь идет о проблемах разборки мембран на составные компоненты с выделением из них отдельных мембранных белков и последующей реконструкции функционально активных комплексов в модельных системах. В настоящее время наиболее предпочтительным подходом к решению этих проблем является использование детергентов. При действии детергентов на выделенные препараты клеточных мембран происходит солюбилизация белков и. 1НПИД0В с образованием смешанных мицелл (рис. 291). [c.560]

Крыс обучали менять лапу при доставании пищи и затем изучали влияние этого обучения на выделенных нервных клетках контрольного участка гиппокампа. Не принималось никаких хирургических мер для того, чтобы пробудить животное заменять предпочитаемую лапу другой при доставании пищи, находящейся на дне длинной и узкой стеклянной трубки (рядом с трубкой и параллельно ей ставили стенку). Поскольку животное из-за конструкции трубки не может достать пищу предпочитаемой лапой, оно старается сделать это другой лапой и в конце концов обучается. В день крысе дают два урока. На четвертый— пятый день обучения крысы находятся еще на восходящей ветви кривой обучения. Затем из мозга крыс этого периода обучения выделяют участок гиппокампа САЗ, содержащий парамидные клетки (средние). За полтора часа до этого крысам в оба боковые желудочка мозга вводят Н-лейцин (60 X 2 мкл с радиоактивностью 1 мкКи/мкл). Берут образцы нервных клеток из участков САЗ гиппокампа, гомогенизуют и экстрагируют для солюбилизации белков солевым раствором, содержащим Тритон Х-100, как это было описано в разд 7.1.3. При разделении белков на микрогеле получаются 2 основные белковые фракции в кислой половине геля (рис. 3 Л). [c.294]

Дальнейшая работа с мембранными белками - изучение их функций, механизмов действия и пространственных структур, однако, натолкнулась на большие трудности. Оказалось, что высвобождение белковых молекул из мембраны часто сопровождается необратимой денатурацией их нативных структур и, следовательно, потерей активности. В редких благоприятных случаях при солюбилизации белков в мягких условиях и при низких концентрациях функциональные свойства не пропадают, что указывает на сохранение, по крайней мере частичное, нативных конформаций. Наиболее детальная информация о белках и липидном бислое получена при изучении плазматической мембраны эритроцитов человека, содержащих гемоглобин -немембранный белок, представленный в этих клетках в наибольшем количестве [237]. Удобство данного объекта обусловлено тем, что мембраны эритроцитов, называемые "тенями", являются единственными в Клетке и их легко выделить в чистом виде с разрывом и без разрыва и даже получить вывернутыми наизнанку. При изучении теней эритроцитов впервые удалось установить, что некоторые мембранные белки пронизывают насквозь мембранный бислой, а внешняя и внутренняя стороны мембраны являются асимметричными [238]. Исследования белков плазматической мембраны эритроцитов человека [c.57]

Берзине и др. [114] методом перекрестного иммуноэлектрофореза изучали антигены из микросом печени крысы, обладающие эстеразной активностью. Солюбилизацию белков осуществляли с помощью детергентов люброла и дезоксихолата. Вначале проводили ИЭФ (pH 3—7), а затем иммуноэлектрофорез в агарозном геле, содержавшем 10% кроличьей антисыворотки к микросомам печени крысы. Эстеразы идентифицировали по ферментативной активности согласно методу Уриэля [1323] (см. гл. II.6). В эстракте, полученном с помощью детергентов, обнаружили по меньшей мере 20 зон неспецифических эстераз, большинство из которых имели ИЭТ в интервале pH 4,5—6,5. При иммуноэлектрофорезе выявлено не менее 5 полос иммунопреципитации, обладающих выраженной микрогетерогенностью. [c.318]

При этом избыток восстановителя в расчете па S—S-группы составил 5—20%. В щелочной среде реакция идет с высокой скоростью, избирательно, почти количественно. Алкилирование образующихся SH-rpynn можно вести в присутствии восстановителя. В кислой среде реакция идет с низкой скоростью (время реакции 24—48 ч). Гомогенность среды создают добавлением 1-пропанола (до соотношения 1 1), что дополнительно способствует солюбилизации белка. Трибутилфосфин токсичен п имеет неприятный запах, работать с ним необходимо в вытяжном шкафу. Реагент и приготовлеш ые растворы рекомендуется хранить под азотом, 2%-ный (об./об.) раствор в пропаполе имеет восстановительный эквивалент 55—70 мкмоль/мл. [c.86]

Наиболее широкое применение нашел метод Лоури [225]. Возникающая окраска в основном определяется реакцией фенольного реагента (Фолина — Чикольте) с остатками Туг, но определенный вклад дают некоторые другие аминокислоты — Тгр, His и ys, а также пептидные связи. Зависимость интенсивности окраски от количества белка-стандарта не линейна. Определению мешают детергенты, используемые для солюбилизации белков. Предлолсепо много различных модификаций метода. [c.291]

XI. Отмойте монослои от ТХУ метанолом, высушите током воздуха и добавьте в каждую лунку по 100 мкл 1 н NaOH. Оставьте на ночь при комнатной температуре для солюбилизации белков. [c.290]

Для изучения иммунологических реакций на молекулярном уровне необходимо создание модельных антигенных систем, в которых молекулы-мишени с известными химическими свойствами взаимодействуют с клетками иммунной системы. В случае антигенов клеточных поверхностей модельная система может включать вместо клеток искусственные носители — липосо-мы. Поскольку мембранные белки обычно нерастворимы в воде, с ними работают только в присутствии детергентов, которые способствуют солюбилизации белков, эффективно заменяя липидное окружение. В связи с тем что детергенты токсичны по отношению к живым клеткам, перед проведением опытов на клетках их необходимо удалять. После удаления детергентов в присутствии липидов могут формироваться искусственные мембраны. Когда мембранные белки включаются в образующиеся таким образом липидные пузырьки, они имитируют клеточные антигены и эффективно стимулируют иммунные реакции. [c.150]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология