Спектрофлуориметрия

Рис. 9.1-16. Схема типичного спектрофлуориметра.

Общая схема спектрофлуориметра [c.149]

В спектрофлуориметрах селекция монохроматических лучистых потоков осуществляется монохроматорами, а источником возбуждающего излучения служит ксеноновая дуговая лампа высокого давления, испускающая сплошной спектр в УФ-, видимой и ближней ИК-области. Спектрофлуориметры позволяют регистрировать как спектры флуоресценции, так и спектры ее возбуждения. Для получения спектра возбуждения вторичный монохроматор излучения настраивают на частоту (длину волны), соответствующую максимуму флуоресценции, а первичным меняют частоту (длину волны) возбуждающего излучения. Для получения спектров флуоресценции первичный монохроматор излучения настраивают на частоту (длину волны), соответствующую максимуму возбуждения, а вторичным меняют частоту (длину волны) флуоресценции. Существуют модели спектрофлуориметров, у которых первичным анализатором излучения является светофильтр. Такие приборы могут регистрировать лишь спектры флуоресценции. [c.512]

Интенсивность флуоресценции однокомпонентного раствора постоянной концентрации пропорциональна величине IoЩf Поэтому, если интенсивность возбуждающего света (/о) остается постоянной при изменении длины волны возбуждения, интенсивность флуоресценции будет пропорциональна произведению еср/. График зависимости еф/ от длины волны или частоты возбуждающего света называется истинным спектром возбуждения флуоресценции. Для большинства веществ в растворах квантовый выход флуоресценции (ф/) не зависит от частоты возбуждающего света (закон Вавилова). Таким образом, истинный спектр возбуждения флуоресценции разбавленного раствора, содержащего одно поглощающее вещество, будет пропорционален коэффициенту поглощения, т. е. он является просто спектром поглощения этого вещества. Следовательно, с помощью спектрофлуориметрии можно измерять спектры поглощения флуоресцирующих веществ при концентрациях, гораздо ниже тех, которые требуются для измерения спектров поглощения с помощью спектрофотометра. Очень важным преимуществом спектрофлуориметрии является то, что возбуждая смесь веществ, одно из которых флуоресцирует, можно получить спектр его поглощения, регистрируя флуоресценцию. [c.154]

Общая схема спектрофлуориметра. Люминесцентные исследования основаны на измерении спектров люминесценции. На рис. 29 приведена принципиальная схема установки для измерения люминесценции. В качестве источника возбуждения целесообразно использовать источник с непрерывным спектром (например, ксеноновая лампа ДКСШ-200). Однако в сочетании со светофильтрами могут применяться также источники с линейчатыми спектрами (например, ртутные лампы ДРШ). [c.63]

Описано определение микроколичеств фосфора с использованием комплекса алюминия с морином. Комплекс алюминия с морином обладает наибольшей интенсивностью флуоресценции и устойчивостью во времени. Гашение флуоресценции этого комплекса фосфатами выражено наиболее резко. При уменьшении pH раствора от 4,5 до 2,7 максимум флуоресценции сдвигается от 510 до 490 нм. Наиболее резкое гашение флуоресценции комплекса Л1 с морином фосфатами наблюдается при pH 5,5. Чувствительность определения 0,5 мкг Р04 . Флуоресценцию измеряют на спектрофлуориметре при 510 нм, pH контролируют рН-метром. [c.80]

Спектры хемилюминесценции малоинтенсивны и состоят из широких бесструктурных полос. В ряде случаев их удается зарегистрировать с помощью коммерческих спектрофлуориметров. Для регистрации слабоинтенсивных спектров хемилюминесценции часто применяют специальные ячейки. На рис. 14.4.89 и 14.4.90 показаны схемы ячеек для измерения хемилюминесценции и термолюминесценции. Схема проточной кюветы для проведения воспроизводимых измерений хемилюминесценции с высокой чувствительностью приведена на рис. 14.4.91. [c.519]

Система третьего типа (монохроматор/монохроматор) наиболее селективна и универсальна, поскольку длина волны как возбуждающего, так и измеряемого вторичного излучения может быть произвольно выбрана оператором В некоторых слу- эях с помощью спектрофлуориметра удается детектировать [c.105]

Имея подобный стандарт, F легко рассчитать из относительных измерений [11, 12]. Интенсивности флуоресценции двух растворов в одинаковых условиях определяют как функцию частоты при помощи спектрофлуориметра, градуировочную кривую для которого получают при использовании лампы накаливания известной цветовой температуры. Таким образом, можно [c.158]

Ранее было замечено (стр. 121), что фосфоресценция, обусловленная триплет-синглетными переходами, обычно не наблюдается в жидких растворах, так как триплетное состояние имеет сравнительно большое естественное радиационное время жизни, и дезактивация в результате столкновений происходит чаш е, чем эмиссия. Оказалось возможным, однако, наблюдать фосфоресценцию эозина в глицерине или этаноле и измерить отношение ее интенсивности к интенсивности флуоресценции [44]. Это было сделано при помощи спектрофлуориметра и двух вращающихся секторов, один из которых служил для прерывания пучка возбуждающего света, другой — для прерывания пучка излученного света. Когда оба прерывателя находятся в одинаковой фазе, измеренная интенсивность обусловлена фосфоресценцией плюс флуоресценцией если они в разных фазах — то только фосфоресценцией. Это очень перспективный метод для определения скоростей перехода между триплетным и синглетным состояниями. По сравнению с флеш-методом он имеет то преимущество, что для облучения можно использовать монохроматический свет с различной частотой, кроме того, можно точно измерить квантовые выходы наконец, стационарная концентрация молекул в триплетном состоянии мала, и поэтому можно пренебречь триплет-триплетным тушением. С другой стороны, если естественное время жизни велико или тз шение сильно, эмиссия будет очень слабой [c.165]

Спектрофлуориметр для ис- Нева следования спектров возбуждения и флуоресценции твердых и жидких тел [c.235]

Рассмотренный метод лазерной флуориметрии может быть применен не только к водной среде, но и к экстрактам. Методика приготовления ацетоновых экстрактов пигментов фитопланктона подробно описана в работе [16]. Там же показано, что, используя лазерный спектрофлуориметр, можно вести измерения концентраций хлорофилла а и феофитина в исходных пробах природной воды и в экстрактах с погрешностью меньше 20% в районах с крайне низким содержанием фитопланктона. Чувствительность лазерной флуориметрии при зондировании хлорофилла а в пробах воды 0,1 мкг/л, в экстрактах 0,002 мкг/л. При этом для приготовления экстракта достаточно фильтровать только 2 л природной воды (стандартные методы потребовали бы более чем столитрового объема). [c.182]

Измерение фосфоресценции обычно проводят в твердой фазе при температуре жидкого азота, поскольку в жидких растворах фосфоресценция интенсивно тущится ничтожными количествами примесей. Для разделения обычной флуоресценции и фосфоресценции или замедленной флуоресценции необходимо периодически прерывать пучок возбуждающего света и регистрировать испускание только в течение темпового периода, т. е. когда короткоживу-щая флуоресценция оказывается полностью затухшей. В большинстве современных спектрофлуориметров это достигается тем, что при измерении спектров фосфоресценции вокруг образца вращается полый цилиндрический стакан, имеющий вырезы в боковой стенке. При вращении стакана вокруг его оси образец освещается возбуждающим светом, проходящим через вырезы, и долгоживущая люминесценция регистрируется через те же самые вырезы. Для измерения общей люминесценции вращающийся стакан надо удалить. Поскольку при использовании стакана с вырезами поглощается только некоторая доля возбуждающего света, то для определения полной скорости испускания долгоживущей люминесценции наблюдаемую интенсивность надо разделить на коэффициент фосфориметра, равный отношению светового периода к сумме времени светового и темпового периодов. Это справедливо, если время затухания долгоживущей люминесценции достаточно велико по сравнению со временем светового и темпового периодов, поскольку уменьшение интенсивности за воемя темпового периода будет [c.67]

Дальнейшим развитием флуориметрии стал метод спектро-флуориметрии. Взаимосвязь этих методов такая же, как методов колориметрии и абсорбционной спектрофотометрии. В методе спектрофлуориметрии используют более сложное оборудование, что дает возможность регистрировать спектр флуоресценции. Кроме того, можно селективно выбрать определенную длину волны флуоресценции. [c.368]

Исследование кинетики замедленной флуоресценции. Для сравнения замедленной флуоресценции активационного и анниги-ляционного типа проводят измерения спектров и кинетики замедленной флуоресценции эозина и антрацена в глицерине или полиэтиленгликоле. Концентрация растворов эозина 10 , антрацена 10— моль/л. Для измерения спектров замедленной флуоресценции используют спектрофлуориметр с вращающимся цилиндром с прорезями. Определяют зависимость интенсивности замедленной флуоресценции от интенсивности возбуждающего света, используя градуированные ослабительные сетки. Данные по кинетике затухания замедленной флуоресценции представляют в координатах gl-t. [c.115]

Этот результат лежит в основе спектрофлуориметрии. Рис. 4.6 показывает часть спектра поглощения (а) 1,2-бензантрацена в этаноле и спектр возбуждения флуоресценции (б) гораздо более разбавленного раствора. Очевидно, эта техника позволяет получать спектры поглощения очень сильно разбавленных растворов (типичные значения концентрации составляют 10 моль/дм ) такая высокая чувствительность спектрофлуориметрии делает ее весьма полезным аналитическим инструментом. Необходимо отметить, что структура спектров флуоресценции в конденсированной среде в отличие от спектров возбуждения флуоресценции часто бывает недостаточно специфичной для проведения молекулярной идентификации. [c.98]

Органических молекулах энергетическая структура колебательных уровней практически одинакова во всех трех низших состояниях (5о, Д, и 51). Сдвиг полосы (0,0) в спектрах поглощения (Г - 5о) и излучения относительно велик (500 см ), что является следствием слабых конформационных отличий основного и возбужденного состояний. Поэтому энергии триплетов, рассчитываемые при единственном предположении о максимуме полосы (0,0) в излучении, только частично представляют энергетику спектров поглощения. Хорошие спектры поглощения переходов 71-<-5о трудно получить с помощью обычной техники, но слабость поглощения дает возможность использовать спектры возбуждения фосфоресценции для определения спектров поглощения (эта методика называется спектрофосфориметрией ср. с спектрофлуориметрией в разд. 4.3). [c.101]

Для выполнения флуориметрического анализа используют спектрофлуориметры, принцип работы которых заключается в следующем свет от ртутно-кварцевой лампы через первичный светофильтр и конденсор падает на кювету с раствором испытуемого вещества последнее начинает флюоресцировать. Квднты возбужденного света проходят через вторичные светофильтры и падают на фотоэлемент, соединенный с чувствительным гальванометром, отмечающим количество поступающего на фотоэлемент света. [c.46]

Количественная оценка 1,4-бенздиазепинов, извлеченных из биосубстратов и подвергнутых тонкослойной хроматографии, включает в себя различные по сложности и точности приемы хроматографию [2581, флуоресценцию [2711, спектрофотометрию, полярографию, спектрофлуориметрию и радиоиндикацию. Для уменьшения потерь при количественном определении бенздиазепинов используется денситометрия пятен непосредственно на пластинках [2891. [c.226]

Из других методов идентификации следует отметить элементный анализ, требующий от 200 до 1000 мкг вещества, полярографию (0,01 мкг вещества), спектрофлуориметрию-,(0,05 мкг вещества) и, наконец, спектральный анализ в УФ- и видимой областях (0,1 мкг). [c.173]

Приборы для измерения молекулярной флуоресценции можно разделить на флуориметры (флуорометры) и спектрофлуориметры. У флуориметров селекция монохроматических лучистых потоков осуществляется с помощью простейших анализаторов излучения — светофильтров. Использование светофильтров обеспечивает высокий уровень возбуждающего излучения и эффективную регистрацию флуоресценции. При флуориметрических измерениях существенное значение имеет выбор светофильтров. Первичный светофильтр должен пропускать поглощаемое образцом излучение и не пропускать излучение флуоресценции. Вторичный светофильтр должен пропускать излучение флуоресценции, но возбуждающее излучение должно им полностью поглощаться. Подбирая такую пару светофильтров, следует добиваться их хорошей скрещен-ности сложенные вместе, они вообще не должны пропускать электромагнетное излучение. Источниками возбуждения у флуориметров являются ртутные лампы низкого давления. [c.512]

Спектрофлуориметры часто комплектуются фосфороскопами. Полученный в результате объединения спектрофлуориметра и фосфороскопа прибор называют спектрофосфориметром. Принцип действия фосфороскопов заключается в кратковременном возбуждении люминесцендаи и регистрации ее через некоторый промежуток времени. Задержка между возбуждением и регистрацией свече1шя позволяет выделить фосфоресценцию из общего спектра люминесценции и рассеянного возбуждающего излучения. [c.512]

Дяя измерения спектров люминесценции кристаллофосфоров используют как спектрофлуориметры, так и спектрофосфориметры. Спектрофлуориметры приме- [c.517]

Загрязненность фильтрата частицами перлита ОйределяЛи с помощью отечественного спектрофлуориметра КФЛ-2-1, имеющего измерительную и эталонную кюветы длй жидкостей. Угол светорассеяния в приборечсоставлял 90". Эталоном загрязненной жидкости служила стабилизированная формалином суспензия каолина в дистиллированной воде концентрацией 0,01 г/л. Порции фильтрата помещались в измерительную кювету. В ходе экспериментов на приборе КФЛ-2-1 обновление суспензии каолина в эталонной кювете достигалось периодическим перемешиванием суспензии в этой кювете. [c.13]

По сравнению со спектрофлуориметрами и спектрофосфориметрами установки со светофильтрами являются более простыми в работе и более дешевыми. К тому же, поскольку абсорбционные или интерференционные светофильтры обладают большей светосилой, чем монохроматор, флуориметр или фосфориметр со светофильтрами обеспечивают большую чувствительность количественных определений. Широко используются оба типа люминесцентных спектрометров. Конечно, приборы со светофильтрами не применяются для получения информации [c.658]

Дайте определение следующих терминов разрешающая способность, светосила, коэффициент пропускания светофильтра, микрофотометр, фотографическая эмульсия, фотолиз, колориметр, определяемое вещество, спектрофотометр, флуориметр, фосфориметр, спектрофлуориметр, раствор сравнения, коллимирование, люминесценция, резонансная флуоресценция, внутренняя конверсия, интеркомбинационная конверсия, колебательная релаксация, триплетное состояние и эффект внутреннего фильтра. [c.670]

Несмотря па большие потенциальные возможности метода квазилинейчатых спектров и разнообразие методических приемов, используемых в настоящее время, число определяемых индивидуальных соединений в сложных смесях в к-парафиновых матрицах при 77 К невелико. Список соединений, которые удается идентифицировать методом квазилинейчатых спектров в сочетании со спектрофлуориметрией в условиях эффекта Шпольского, приведен в [5. К нему следует добавить доказанную возможность определения в сложных смесях некоторых гетероциклических соединений [12, 16]. Трудности обусловлены, с одной стороны, недостаточно тонкими приемами подготовки образцов к анализу, с другой — отсутствием структурных спектров у многих типов соединений в -парафинах при 77 К. Это, однако, не снижает достоинств метода, который широко используется для анализа ряда полициклических ароматических углеводородов в продуктах природного и техногенного происхождения. Дальнейший прогресс в этой области исследований будет связан, по-видимому, с использованием гелиевых температур и лазерной техники при одновременном совершенствовании методов подготовки образцов к анализу. [c.91]

После заполнения колонку в течение 1 ч промывают бензолом со скоростью подачи 2,5 мл/мин. Рабочая скорость подачи 0,1 мл/мин. В процессе набивки колонку, смеситель и резервуары термостатируют (35 °С). Выход колонки соединяют с проточной ячейкой спектрофлуориметра Раггапё. Поскольку в большинстве случаев интенсивность флуоресценции слишком велика, то в систему вводят насос для отбора части элюата. Избыток элюата отбрасывают или же анализируют методом тонкослойной хроматографии. Можно, конечно, работать при пониженной чувствительности прибора или же непрерывно разбавлять элюат ацетоном или метилцеллозольвом. Спектрофлуори-метр работает в следующем режиме 340 нм, Яетн 500 нм. [c.375]

Для того чтобы получить воспроизводимые спектры флуоресценции нерастворимых белков, необходимо начинать с полностью открытой кюветы. Микрокювету 4 с диском 5 (рис. 9.5) с помощью пастеровской пипетки наполняют гелем белок—агарозы (максимальный объем геля 100 мкл, но обычно достаточно 50 мкл) и гель немедленно покрывают 100 мкл буфера, пригодного для элюирования. Тефлоновый адаптер 3 соединяют с микрокюветой и ячейку частично собирают (части 3—7). Наконец, ячейку вставляют в кюветодержатель и помещают в спектрофлуориметр вместе с верхней частью (1). Затем с помощью перистальтического насоса через гель пропускают элюирующий буфер. Используют скорости потока 0,2—0,5 мл/мин. Все спектры записывают после того, как гель промывают в течение 10—15 мин буфером. Гели белок— сефарозы 4В облучают только в течение времени, необходимого для записи спектров излучения, для того чтобы фотоинактивация геля была минимальна. Образцы геля с присоединенным белком можно использовать повторно, если работать по описанной методике, причем показано, что фотоинактивация образцов белка незначительна. Легко можно получить спектры флуоресценции примерно для 0,2—300 мкг белка, ковалентно связанного с сефарозой 4В. [c.254]

Наконец, крупным достоинством метода флуоресцентного анализа является относительная простота и дешевизна приборов. Для простого обнаружения флуоресцирующих веществ необходим флуори-метр — прибор не сложнее фотоэлектроколориметра, использующегося для определения мутности и плотности растворов. Для более сложных исследований — измерений интенсивности люминесценции, квантового выхода, спектра люминесценции, спектра поляризации люминесценции — нужны спектрофлуориметры и флуорометры — приборы немногим сложнее спектрофотометров. [c.289]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология