Фотоинактивация

Индуцируемые длинноволновым УФ-светом повреждения ДНК обусловливают инактивирующий, летальный и мутагенный эффекты при действии этого излучения на трансформирующую ДНК, бактериофаги и микроорганизмы. Сильная зависимость фотобиологических эффектов от О2, а также отсутствие фотореактивации позволяют считать, что основными летальными фотопродуктами являются одноцепочечные разрывы ДНК, а не пиримидиновые димеры, как это имеет место в случае действия коротковолнового УФ-излучения. Роль разрывов в инактивирующих эффектах длинноволнового УФ-света подтверждается данными о совпадении спектров действия фотоинактивации биологических объектов со спектром действия образования разрывов в ДНК. [c.447]

Итак, именно фотолиз триптофана и цистина имеет первостепенное значение в фотоинактивации белков. Учитывая это, рассмотрим механизмы первичных УФ-индуцированных процессов в этих аминокислотах. [c.448]

Что касается фотоионизации триптофановых остатков в белке при физиологических условиях, то она осуществляется, вероятно, только по одноквантовому механизму с участием синглетных возбужденных состояний молекул. В пользу этого свидетельствуют, в частности, экспоненциальные зависимости от дозы УФ-света как фотолиза триптофановых остатков, так и фотоинактивации белков. Предполагают, что возникающий в белках под действием УФ-света катион-радикал триптофана диссоциирует на протон и нейтральный радикал, который, взаимодействуя с соседними группами полипептидной цепи, образует межмолекулярную ковалентную сшивку — стабильный фотопродукт [c.450]

Рассмотренный механизм прямого фотолиза триптофана — не единственная причина повреждающего действия УФ-излучения на белки. Второй механизм фотоинактивации белков связан с фотосенсибилизированными реакциями при участии сольватированного электрона. Последний, будучи сильным восстановителем, активно реагирует с различными соединениями, обладающими высоким сродством к электрону, и прежде всего — с растворенным О2, образуя О2 и гидроперекисный радикал ПО2 [c.450]

Однако реакции с участием молекулярного кислорода вносят незначительный вклад в процесс УФ-инактивации белков. Так, фотоинактивация трипсина проходит примерно с одинаковым квантовым выходом в присутствии кислорода (0,026) и в вакуу-мированных растворах (0,028). Наибольшее значение имеет взаимодействие сольватированного электрона непосредственно с аминокислотными остатками белковой [c.450]

Дисульфидные группы белка могут разрушаться не только за счет фотосенсибилизированных реакций, но и вследствие прямого фотолиза. Наиболее эффективной в этом процессе является спектральная область, где максимально поглощает свет цистин, т.е. короче 260 нм. УФ-свет этих длин волн (например, 254 нм) особенно активен в инактивации белков, поскольку квантовый выход фотолиза цистина на порядок превышает таковой для триптофана. В соответствии с приведенными выше данными процесс фотоинактивации белков можно представить в виде общей схемы (рис. ХХХ.5). [c.451]

Природа отмеченных изменений исследована в экспериментах с изолированными плазматическими мембранами. Оказалось, что наиболее чувствительным к УФ-облучению компонентом является АТФаза, связанная с трансмембранным ионным транспортом, причем ее фотоинактивация происходит в результате прямого поглощения квантов УФ-света. В пользу этого свидетельствует тот факт, что чувствительность АТФазы к УФ была одинаковой при облучении как мембран, так и раствора очищенного фермента. Па основании снятого спектра действия УФ-инактивации мембранной АТФазы предполагают, что ее хромофором является триптофан. [c.453]

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФОТОИНАКТИВАЦИИ БЕЛКОВ [c.248]

Роль хромофоров в фотоинактивации белков [c.249]

Если за фотоинактивацию действительно ответственны только кванты света, поглощаемые триптофаном и цистином, то поперечное сечение инактивации белка (огб) должно быть равно сумме поперечных сечений фо- [c.250]

Мак Лареном и Лузом для некоторых (но не всех) белков было получено удовлетворительное совпадение расчетных и экспериментально определенных значений квантовых выходов (ф) фотоинактивации из соотношения ф=а/х, где 5 — поперечное сечение поглощения. Уязвимым местом в подобном подходе является произвольное предположение об одинаковой значимости фотолиза любой аминокислоты для инактивации макромолекулы и совпадении поперечных сечений поглощения и фотолиза аминокислот в свободном состоянии и в составе белка. [c.251]

Триптофановая фотоинактивация белков в растворе и в пленке при облучении УФ-светом с длиной волны 260—320 нм осуществляется по одноквантовому, одноударному механизму. В пользу этого свидетельствуют экспоненциальный характер дозных кривых и взаимозаменяемость интенсивности и времени облучения (соблюдение закона Бунзена — Роско). Триптофановая инактивация белков инициируется не триплетными, а синглетными электронно-возбужденными состояниями хромо- [c.256]

Различные механизмы фотоинактивации белков могут быть суммированы в виде следующей схемы [c.266]

Ранее уже отмечались различия в фоточувствительности ферментов и комплексов фермент — субстрат, фермент — гормон, а также температурных А и В конформеров белков. При конформационных перестройках в белках, индуцированных ионами и малополярными растворителями, также изменяются квантовые выходы их фотоинактивации. [c.267]

Зависимость фотоинактивации белков от конформационного фактора (наряду со своим прямым значением для фотобиологии) позволяет характеризовать структурное состояние белка по уровню его фоточувствительности не только в растворе, но и в клетке. [c.267]

ОСОБЕННОСТИ ФОТОИНАКТИВАЦИИ БЕЛКОВ В СОСТАВЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН [c.268]

Для того чтобы получить воспроизводимые спектры флуоресценции нерастворимых белков, необходимо начинать с полностью открытой кюветы. Микрокювету 4 с диском 5 (рис. 9.5) с помощью пастеровской пипетки наполняют гелем белок—агарозы (максимальный объем геля 100 мкл, но обычно достаточно 50 мкл) и гель немедленно покрывают 100 мкл буфера, пригодного для элюирования. Тефлоновый адаптер 3 соединяют с микрокюветой и ячейку частично собирают (части 3—7). Наконец, ячейку вставляют в кюветодержатель и помещают в спектрофлуориметр вместе с верхней частью (1). Затем с помощью перистальтического насоса через гель пропускают элюирующий буфер. Используют скорости потока 0,2—0,5 мл/мин. Все спектры записывают после того, как гель промывают в течение 10—15 мин буфером. Гели белок— сефарозы 4В облучают только в течение времени, необходимого для записи спектров излучения, для того чтобы фотоинактивация геля была минимальна. Образцы геля с присоединенным белком можно использовать повторно, если работать по описанной методике, причем показано, что фотоинактивация образцов белка незначительна. Легко можно получить спектры флуоресценции примерно для 0,2—300 мкг белка, ковалентно связанного с сефарозой 4В. [c.254]

Как уже упоминалось, ультрафиолетовое излучение приводит к изменению или потере биологической активности нуклеиновых кислот. Добавление в раствор нуклеиновой кислоты перед облучением небольших количеств (10- —М) акридинового оранжевого профлавина 303,304 атебрина, акрифлавина или акридина , образующих комплексы с нуклеиновыми кислотами, приводит к значительному снижению степени фотоинактивации. Установлено, что акридиновые красители ингибируют вызываемую ультрафиолетовым излучением фотодимеризацию пиримидиновых звеньев [c.687]

Область длин волн от 180 до 90 нм, эквивалентная энергии фотонов от 155 до 310 ккал./моль, представляет пограничную область между обычным ультрафиолетом и рентгеновским излучением ( Х-лучи ). Большинство биологических объектов и структур в этой спектральной области имеют коэффициенты поглош ения более высокие, чем в обычных спектральных участках. Фотохимическая эффективность в вакуумном ультрафиолете также выше, квантовый выход реакций близок к единице, например для фотоинактивации фермента [1]. Фотолиз ароматических аминов, аминокислот и азотистых оснований ваккумным ультрафиолетом, который мы изучаем в газовой фазе с помош ью масс-спектромет-рии, показал существование трех главных фотопроцессов [2]. [c.391]

Из этих уравнений можно найти значения двух искомых величин тПтри и тцис-С помощью этого подхода показано, например, что в трипсине разрушение одного остатка триптофана (из четырех) и одного остатка цистина (из шести) приводит к фотоинактивации фермента. В пепсине существенным для фотоинактивации оказалось разрушение только одного остатка триптофана. [c.448]

Фотодинамические эффекты наблюдаются и при облучении биологических систем видимым светом без добавленных сенсибилизаторов. Недавно такой эффект подробно исследован на дрожжевых клетках. На основании изучения спектра действия фотоинактивации клеток, обнаружившего близкое сходство со спектром поглощения порфирина, выделенного из плазматических мембран дрожжей, сделано заключение, что этот пигмент выполняет роль эндогенного фотосенсибилизатора. Показано также, что основным инициатором фотодеструктивных реакций, приводящих к нарушению барьерной функции плазматических мембран, является фотогенерируемый порфирином. Как установлено в экспериментах с изолированными плазматическими мембранами, фотосенсибилизированное изменение их проницаемости обусловлено главным образом процессом перекисного фотоокисления липидов. На основании зарегистрированного методом ЭПР ограничения подвижности спинового зонда (5-доксилпальмитат) сделан вывод о том, что перекисное фотоокисление липидов сопровождается увеличением вязкости мембраны. [c.456]

По мнению большинства исследователей, в основе биологического действия УФ-излучения лежат фотохимические превращения биомолекул — белков, нуклеиновых кислот и структурных липидов, участвующих в образовании биомембран эти превращения могут привести к поражению наследственного аппарата или мембранных образований. Ингибирование деления, мутации и гибель клеток в результате облучения в большинстве случаев относят за счет тех или иных повреждений ядра клетки. Описаны нару-н1ения в структуре ДНК в результате прямого (образования димеров) или опосредованного действия УФ-излучения [Копылов, Королькова, 1973 Самойлова, 1975]. Вместе с тем зти явления могут быть сопряжены и с повреждениями иных клеточных структур [Армап и др., 1971]. Основные эффекты воздействия УФ на клеточные мембранные структуры — увеличение их проницаемости для неорганических ионов и подавление активности отдельных мембранных ферментов и ферментативных комплексов [Рощупкин, 1973 Владимиров, Рощупкин, 1975]. Наиболее важным следует считать ослабление функции пассивного барьера для неорганических ионов, которое наблюдается нри небольших дозах облучения, когда фотоинактивация ферментов еще не наблюдается. Нарушение барьерной функции мембран, даже в незначительной степени, может привести к гибели клетки. Кроме эффекта отдаленной гибели клеток УФ-излучение в зависимости от дозы и спектра, а также [c.46]

Конечным результатом действия ультрафиолетового света на белки является их инактивация, т. е. потеря ферментативной, регуляторной, гормональной, транспортной и иммунологической активностей. Фотоинактивация белков представляет собой одноквантовый, одноударный необратимый процесс, о чем свидетельствует экспоненциальный характер зависимости ферментативной активности от дозы облучения и взаимозаменяемость интенсивности и времени облучения. На одноударность процесса указывает также линейная зависимость скорости инактивации от интенсивности света, выполняющаяся даже при таких его интенсивностях, когда количество квантов, падающих в секунду на единицу объема, сравнимо с количеством молекул белка в нем. [c.248]

Квантовые выходы инактивации различных белков характеризуются достаточно низкими значениями, находящимися в пределах 10" —10 . Это означает, что только один удачно поглощенный квант инактивирует макромолекулу, в то время как поглощение остальных 99—999 квантов не приводит к функционально существенным повреждениям. Квантовый выход фотоинактива-ции белков не зависит от содержания кислорода. Следовательно, инактивация не обусловлена фотоокисле-нием хромофоров. Скорость фотоинактивации белков практически не зависит от температуры (Рю 1), во всяком случае для тех интервалов положительных температур, при которых конформация белка остается неизменной. Квантовый выход инактивации возрастает в области предденатурациониых температур и уменьшается в 3—4 раза при охлаждении образцов до —196° С. Эффективность фотоинактивации контролируется концентрацией водородных ионов (pH) и ионной силой среды, зависит от состава используемого буфера, а также от присутствия в растворах мочевины, гуанидина и детергентов. Перевод белка из раствора в твердую собст- [c.248]

Вклад фотохимии цистина проявляется в увеличении поперечпого сечения инактивации богатых цистином белков в области 250 нм (рис. 48), где парциальное поглощение цистина сравнимо с поглощением ароматических аминокислотных остатков. По данным Сетлоу, при облучении различных белков светом с длиной волны 250 нм соблюдается прямая пропорциональность между содержанием в них цистина и величиной квантового выхода фотоинактивации. Тем не менее даже в белках, богатых цистином, при длинноволновом облучении (270—310 нм) преобладает триптофановая фотоинактивация, только при коротковолновом (240—260 нм) — цистиновая . В соответствии с этим белки, инактивированные коротко-и длинноволновым УФ-облучением, судя по данным се-диментационного анализа, различаются конечным конформационным состоянием. [c.250]

Реакция 2, судя по спектрам поглощения, не сопровождается разрывом индольного кольца, а приводит к образованию ковалентной связи (сшивки) между имин-ным азотом индола и соседними группами белковой макромолекулы. В пользу этого свидетельствуют исчезновение полосы поглощения >ЫН-группы в инфракрасном спектре у глицил-триптофана и тушение флуоресценции (фотовыцветание). Однако этот конечный стабильный фотопродукт триптофана, который, по-видимому, приводит к фотоинактивации белков, не выделен и его химическая природа пока не ясна. [c.258]

Если существенный триптофанил находится вне активного центра, то сшивка изменяет баланс водородных, гидрофобных и других слабых сил (множественные разрывы связей), поддерживающих нативную конформацию макромолекулы. В результате инициируется кооперативный процесс денатурации, которая и приводит к потере ферментативной активности. В большинстве случаев непосредственной причиной инактивации являются конформационные изменения макромолекулы. Действительно, фотоинактивации белка сопутствуют конформационные перестройки и оба эти эффекта наблюдаются при одинаковых дозах УФ-света. УФ-индуцированные конформационные перестройки в белках зарегистрированы с помощью методов седиментации, электрофореза, вискозиметрии, полярографии, электронной микроскопии, люминесценции, оптического вращения, осмометрии, кондуктометрии, измерений поверхностного натяжения, растворимости, скорости дейтериевого обмена, устойчивости к протеолитическим ферментам и теплу, количества титруемых кислых, основных и 5Н-групп, изучения иммунологических свойств. [c.262]

По-видимому, фотоденатурация (локальная или генерализованная) белков может осуществляться и нефотохимическим путем, минуя стадии лабильных и стабильных фотопродуктов при тепловой диссипации энергии электронно-возбужденных состояний триптофанилов (около 100 ккал/моль), ведущей к множественным разрывам водородных и иных связей. Так, было обнаружено, что аргиназа и уреаза, обладающие, как и другие белки, способностью к существованию в двух дискретных функционально активных конформациях в области физиологически умеренных температур (кооперативный переход Ач В), разяйчаются по квантовым выходам фотоинактивации температурных конформеров А и В. Однако скорости фотолиза триптофанилов и цистина, а также природа конечных стабильных фотопродуктов (данные люминесценции) у температурных конформеров оказались одинаковыми. Отсюда следует, что различия в фоточувствительности конформеров могут быть связаны с дополнительной нефотохимической инактивацией макромолекулы. [c.263]

Скорее всего по этой же причине происходит уменьшение акт фотоинактивации (Я=254 нм) трипсина после дейтерирования, соответствующее, по данным ИК-спек-троскопии, разности энергии N—Н- и N—О-колебаний. Иными словами, у дейтерированного трипсина облегчен разрыв водородных связей энергией, поглощенной цистином. Сходным образом может быть объяснено уменьшение квантового выхода фотоинактивации трипсина на фоне постоянной скорости фотолиза триптофанилов при изменении вязкости и ионного состава среды, амилазы при образовании фермент-субстратного комплекса, а также гексокиназы при ее комплексировании с регуляторным гормоном инсулином. [c.264]

У белков, в состав которых входит металл, играющий существенную роль в каталитической активности, к фотоинактивации приводит его выбивание из макромолекулы. Такая ситуация имеет место при УФ-облучении карбоксипептидазы, теряющей в результате разрушения существенного триптофанила атом цинка. Наконец, Л. П. Каюшиным было обнаружено, что свет, поглощаемый триптофаном, может сенсибилизировать разрыв пептидной связи. [c.266]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология