Нуклеотиды олигонуклеотиды

Для синтеза таких олигонуклеотидов используют два метода. Одни из них, так называемый фосфодиэфирный , основан на конденсации нуклеотида (I) с защищенной гидроксильной группой с нуклеозидом [c.366]

НУКЛЕОТИДЫ И КОРОТКИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ [c.319]

Изучение проблем, связанных с синтезом нуклеотидов, олигонуклеотидов, коферментов-нуклеотидов и, в еще большей степени, нуклеиновых кислот и фосфатидов (фосфолипидов), привело к накоплению обширного научного материала значительно обогащающего и химию органических соединений фосфора рядом новых препаративных методов, в том числе наиболее тонких. К таким методам относится фосфорилирование дибензилхлорфосфатом — метод, [c.27]

Разделение меченых олигонуклеотидов проводят в растворителе, содержащем произвольную смесь немеченых нуклеотидов (продукты гидролиза РНК). В ходе проявления пластинки немеченые нуклеотиды становятся на место исследуемых меченых нуклеотидов и перемещаются вдоль пластинки на расстояния, примерно соответствующие их размерам. [c.171]

Следующая стадия, инициация, требует наличия субстратов РНК-полимеразы, нуклеозидтрифосфатов и заключается в образовании первых нескольких звеньев цепи РНК- Первый нуклеотид входит в состав цепи, сохраняя свою трифосфатную группу, а последующие присоединяются к 3 -ОН-группе предыдущего с освобождением пиро юсфата. На стадии инициацни РНК-продукт связан с матрицей и РНК-полн.меразой непрочно и с высокой вероятностью может освобождаться из комплекса. В этом случае РНК-полимераза, не покидая промотора, снова инициирует РНК- Такой синтез ДИ-, три- и более длинных олигонуклеотидов называют абортивной инициацией в противоположность продуктивной (т.е. завершающейся образованием полноценного РНК-продукта) инициации. Когда РНК-продукт достигает критической длины (от 3 до 9 нуклеотидов на разных промоторах), абортивная инициация полностью прекращается, транскрибирующий комплекс стабилизируется и уже не распадается до тех пор, пока синтез. молекулы РНК не будет доведен до конца. Примерно в этот же мо.мент, который считается концом инициации и началом элонгации, ог РНК-полимеразы отделяется а-субъединица. [c.138]

Рис. 5.1. Химический синтез олигонуклеотида. После п циклов образуется одноцепочечный фрагмент ДНК из я -Ь 1 нуклеотида.

В области биологически важных проб наряду с белками определенную роль играют также нуклеотиды, олигонуклеотиды и фрагменты ДНК. Такого рода пробы в КЭ до настоящего времени разделяли методом МЭКХ, а также полиакриламидгелевым КЭ. Покрытия на основе линейных полиакриламидов в сочетании с макромолекулярными буферными добавками можно привлечь для разделения фрагментов радикалов ДНК в широкой области. [c.76]

РИС. 2-37. Двумерная нуклеотидная карта, полученная в результате частичного гидролиза Р-олигонуклеотида, отщепленного от кольцевой копии ДНК, синтезированной иа цепи глобниовой мРНК (гл. 15, разд. Ж.4). Олигонуклеотид обрабатывали экзонуклеазой из змеиного яда (фосфодиэстера-зой, табл. 2-11), отщепляющей нуклеотиды последовательно с З -конца. Самое верхнее пятно соответствует нуклеотиду неизвестного состава каждое следующее расположенное ниже пятно содержит иа одно нуклеотидное звено больше. По относительной подвижности промежуточных продуктов (см. текст) была восстановлена последовательность (5 )- [c.172]

Разработаны методы синтеза полинуклеотидов — простейших моделей нуклеиновых кислот. Эти методы послужили основой для синтеза олигонуклеотидов с заданной последовательностью нуклеотидов. Использование химических и биохимических методов синтеза дали возможность Каране получить полинуклеотид, соответствуюший активному фрагменту дезоксирибонуклеиновой кислоты. Все эти достижения в области исследования строения, функций и синтеза биополимеров позволили на другом, новом—молекулярном уровне подойти к изучению жизненных процессов. Есть все основания предполагать, что в ближайшее время нас ждут большие и интересные открытия в мире познания самых сложных и тонких областей жизнедеятельности организма (деятельности нервной системы, межклеточного взаимодействия, явлений иммунитета и т. д.). [c.54]

Во избежание циклизации образующихся олигонуклеотидов в реакци-онную смесь добавляют определенное количество регулятора молекул лярной массы (см. с. 150) — нуклеотида с защищенной, например ацети-лированной, гидроксильной группой. Такой нуклеотид как бы обрывает реакционную цепь наращивания олигонуклеотидов и делает невозможной ее циклизацию. Таким образом были синтезированы различные олигонуклеотиды со степенью полимеризации 15. При конденсации не мононуклеотида, а ди- или тетрануклеотидов различного строения получаются блоколигонуклеотиды , построенные из блоков, каждый из которых содержит различные нуклеотиды. [c.366]

ДНК-аза яда кобры известна как ингибитор роста опухолевых клеток. Эта же эндонуклеазная ДНК-аза, а также РН1 -аза и экзонуклеазная фосфодиэстераза широко применяются для определения последовательности нуклеотидов в нуклеиновых кислотах и олигонуклеотидах (Zeller, 1966). [c.190]

К числу таких веществ относятся нуклеиновые основания, нуклеотиды и олигонуклеотиды, а также фенилтиогидантоиновые производные аминокислот (ФТГ-АК). Удобно наблюдать не само поглощение, а ослабление флюоресценции добавленного в сорбент флюорогена в местах расположения пятен вещества, пр исходящее в результате поглощения ими коротковолнового УФ-света, которым освещают пластинку. При визуальном наблюдении или на фотографии в лучах видимого света вещества обнаруживаются в виде темных пятен на светлом флюоресцирующем фоне. Метод позволяет обнаруживать до 0,5 мкг олигонуклеотидов в пятне и широко исполь- [c.480]

Фракционирование олигонуклеотидов в тонком слое играет центральную роль в некоторых методах секвенирования нуклепновых кислот, особенно тРНК, где из-за высокого уровня содержания модифицированных нуклеотидов методы секвенирования с использованием электрофореза в ПААГ наталкиваются на серьезные трудности. [c.496]

Таким образом, продвигаясь сверху вниз, по картине относительного сдвига пятен непрерывно удлиняющихся на одно звено фрагментов можно расшифровать всю первичную структуру олигонуклеотида. Здесь надо сделать два дополнительных замечания. Во-первых, мы ничего не узнаем таким образом о природе 5 -концевого нуклеотида, но его легко определить рассмотренными ранее методами ТСХ нуклеотидов. Например, после исчерпывающего гидролиза фосфодиэстеразой змеиного яда только этот нуклеотид будет представлен иуклеозиддифосфатом вида pNp. Во-вторых, метод не позволяет обнаружить модифицированные (минорные) нуклеотиды. Их приходится идентифицировать также методами ТСХ нуклеотидов нли нуклеозидов после исчерпывающего ферментативного гидролиза, как описано выше, где, в частности, приводилась и методика, используемая в цитируемой работе. [c.505]

Рис. 173. Определение последовательности нуклеотидов в олигонуклеотиде методом блуждающего пятна (см. текст) [Silberklang et al., 1977]

Далее проводили фосфорилирование всех олигонуклеотидов по 5 -концам радиоактивным фосфором за счет [7- PlATP с помощью Т4-полинуклеотидкпназы. Смесь меченых олигонуклеотидов разделяли электрофорезом в ПААГ, получая лестницу полос, как было описано при рассмотрении электрофореза [Остерман, 1981]. В отличие от методов секвенирования ДНК здесь каждой полоске ( перекладине лестницы ) соответствует фрагмент, укороченный точно на один нуклеотид по сравнению с фрагментом предыдущей полоски. Как и при секвенировании ДНК, меченые гидролизаты наносили в параллельные треки со сдвигом по времени в 4, 8 и И ч, а весь электрофорез проводили в течение 14 ч, с тем чтобы лучше разрешить разные по длине фрагментов участки лестницы . [c.508]

Олигонуклеотиды несут большой отрицательный заряд, поэтому они с успехом могут быть разделены на слабых крупнопористых анио-нообменниках. Для этой цели используют колонки, заполненные ДЭАЭ-сефадексом, ДЭАЭ-целлюлозой, Эктеола-целлюлозой и др. Нуклеотиды элюируются с колонки в градиенте концентрации Na l в порядке увеличения их молекулярной массы. Для подавления неспецифической сорбции нуклеотидов на полисахаридных матрицах хроматографию проводят в присутствии 7 М мочевины. [c.177]

Сделаны попытки применения твердофазных методов, разработанных 8 химии белка, для сщпеза олигонуклеотидов [38]. Однако обеспечить высокие выходы на каждой стадии соединения нуклеотидов труднее, чем при соединении пептидов, поэтому длина ц.епй, которую можно надежно синтезировать с помощьй твердофйЗиых методов, очень ограничена. [c.427]

После снятия 5 -защитной диметокситритильной группы возможно присоединение след, нуклеотида. Окисление межнуклеотидных фосфитных групп проводят после завершения синтеза олигонуклеотида. [c.300]

В ходе Р. рост цеш1 осуществляется благодаря взаимод. дезоксирибонуклеозидтрифосфата с З -ОН концевым нуклеотидом уже построенной части ДНК при этом отщепляется ш1рофосфат и образуется фосфодиэфирная связь. Рост полинуклеотидной цепи (рис. 2) идет только с ее З -конца, т. е. в направлении 5 3 (см. Нуклеиновые кислоты). Фермент, катализирующий эту р-цшо,-ДНК-полиме-раза (см. Полидезоксирибонуклеотид-синтетазы)-пе способен начать матричный синтез на одноцепочечной ДНК, если нет хотя бы олигонуклеотидного биспирального участка (т. наз, затравочного ол ггонуклеотида) комплементарного матрице затравочным олигонуклеотидом во мн. случаях является не ДНК, а РНК. [c.252]

В 1958 г. Хорана предложил для последовательной деструкции цоли-дезоксирибонуклеотидов использовать избирательный ферментативный гидролиз. Были найдены два специфических фермента, которые избирательно расщепляли 3 -5 -связь дизамещенного эфира по месту связи Ссз)—О или С сз)—С ("5) — О. Фосфодиэстераза селезенки расщепляла эту связь по месту С(5)—О, оставляя С (з)-фосфат, диэстераза змеиного яда — связь С (3) —О, оставляя С (5)-фосфат. Так как в полимерной цепи ДНК или соответствующего олигонуклеотида с одного края всегда находится нуклеотид со свободной С (3)-гидроксильной группой, а с другой стороны цепь заканчивается нуклеотидом со свободным С (Г)-гидроксилом, то, очевидно, можно, действуя тем или иным ферментом, последовательно разрушать цепь с одного из ее концов, идентифицируя отщепляющиеся мононуклеотиды с помощью бумажной хроматографии. [c.254]

Деметилирование (39) пиридином с последующей обработкой деметилированной соли фосгеном приводит к (37). Последовательная реакция (37) с двумя различными спиртами дает несимметричный фосфодиэфир (вероятными интермедиатами являются пятивалентные производные). Катализируемое гидроксид-ионом отщепление диметилацетоинового остатка от триэфира происходит по крайней мере в 10 раз быстрее, чем гидролиз триметилфосфа-та. Поскольку реагент (37) был применен лишь для синтеза модельных фосфодиэфиров, предполагали, что его можно использовать для получения олигонуклеотидов [49]. Однако реагент (37), подобно всем тетраэфирам пирофосфорной кислоты, очень чувствителен к действию воды и может быть использован только в абсолютно безводных условиях. Это значительное неудобство в области нуклеотидов, где субстраты часто лишь с трудом растворяются в безводных растворителях. [c.159]

С появлением приборов для автоматического химического синтеза ДНК (ДНК-синтезаторов) получение одноцепочечных олигонуклеотидов длиной <50 звеньев стало более или менее рутинной процедурой. Основным компонентом любого ДНК-синтезатора является система клапанов и насосов, с помощью которых в реакционную смесь по строго заданной программе вводятся нуклеотиды и реагенты, обеспечивающие присоединение нужных мономерных единиц к растущей цепи. В отличие от биологического, в ходе химического синтеза ДНК каждый новый нуклеотид можно присоединять к 5 -гидроксильному концу цепи. Все реакции осуществляются последовательно в одной реакционной колонке, а продолжительность каждой из них и время отмывания контролируются с помощью компъютера. [c.80]

Как иллюстрировалось выше, синтез нуклеотидов и олигонуклеотидов можно проводить в отсутствие кислот или оснований с использованием реакций окислительно-восстановительной конденсации [81]. Смесь трифенилфосфина и ди(пиридил-2)дисульфида может действовать как конденсирующий агент в синтезе олигонуклеотидов. Реакция сопровождается образованием трифенил-фосфиноксида и 2 экв. пиридинтиона-2. Эти реагенты превращают Также нуклеозид-2 (3 )- и -5 -фосфаты в соответствующие циклические фосфодиэфиры. Постулировано, что взаимодействие между трифенилфосфином и дисульфидом приводит к образованию фос-фонневой соли (47), которая далее реагирует с фосфоноэфиром, давая фосфороксифосфониевую соль (48) (схема (50) . Реакции [c.167]

Идея использования твердофазной подложки в последовательном синтезе полимера с определенной последовательностью была развита Меррифильдом для работы с пептидами (см. гл. 23.6). Ранние попытки применить эту идею и сходную технологию для синтеза олигонуклеотидов были сравнительно безуспещны [1]-. Попросту говоря, растущий олигонуклеотид, по-видимому, образует клубок вблизи полимерной подложки, что делает его конец недоступным для дальнейщего удлинения выходы значительно снижаются прежде, чем количество нуклеотидов достигает двузначной цифры. Эта ситуация, по-видимому, была преодолена, когда обратились к новому типу полиамидной подложки, которая [c.183]

Меченые ДНК-зонды можно получить разными способами. Один из них, называемый методом случайных праймеров, основан на применении смеси синтетических олигонуклеотидов (олигомеров), содержащих все возможные комбинации из шести нуклеотидов. Некоторые из этих олигонуклеотидов оказываются комплементарными последовательностям ДНК-мище- [c.65]

Рис. 4.12. Получение меченого ДНК-зонда методом случайных праймеров. К денатурированной двухцепочечной ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, которую предполагается использовать в качестве зонда, добавляют гексануклеотиды (смесь всех возможных комбинаций из шести нуклеотидов) и отжигают смесь. Некоторые из олигонуклеотидов гибридизуются с немеченой денатурированной ДНК, и в присутствии фрагмента Кленова и четырех с1НТР (один из которых меченый [ ]) служат затравкой для синтеза комплементарной цепи. После денатурации синтезированной ДНК получают смесь меченых фрагментов ДНК, которые вместе составляют практически полноразмерную исходную ДНК-матрицу.

Смотреть страницы где упоминается термин Нуклеотиды олигонуклеотиды: [c.368] [c.326] [c.199] [c.283] [c.286] [c.319] [c.449] [c.501] [c.503] [c.504] [c.506] [c.425] [c.250] [c.171] [c.137] [c.326] [c.142] [c.170] [c.184] [c.570] [c.664]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология