Изоэлектрическое осаждение белков

Однако для белков такое соотношение не обязательно выполняется, поскольку они могут связывать и другие, помимо протонов, ионы, которые вносят вклад в общий баланс зарядов (при условии нейтральности молекулы белка). Можно ожидать, что белки в изоэлектрической точке обладают меньшей растворимостью, чем при меньших или больших значениях pH, и это действительно имеет место. Поскольку в изоэлектрической точке молекула белка не обладает избыточным зарядом, в этих условиях белок легче агрегирует и осаждается. Далее, поскольку аминокислотный состав разных белков различен, для каждого белка существует характеристическое значение р/е. Это свойство является основой метода очистки белков путем изоэлектрического осаждения (осаждения в изоэлектрических условиях) pH смеси белков доводится до значения, равного значению р/ искомого белка, так что последний осаждается из смеси. Значение р/г аминокислот с нейтральной боковой цепью равно 5,6 0,5 для аминокислот, содержащих кислые группы, р/ ниже, а для аминокислот с основными группами в боковых цепях — выше. В то же время для белков р/ может меняться от О до И. Вывод формул для расчета р/ аминокислот имеется в большинстве учебников биохимии. [c.32]

Удобен следующий прием медленного добавления сульфата аммония при изоэлектрическом высаливании белков в забуференный рас твор белка опускают целлофановый мешочек с твердым сульфатом аммония, электролит диффундирует через мембрану и вызывает осаждение белка. Осадок белка, содержащий неорганическую соль, диали-зуют (дистиллированная вода) сульфат аммония удаляется и белок переходит в раствор. Для переосаждения используют описанный выше прием. Кристаллизации белка можно достичь после подходящего числа повторений этого процесса. Другой удобный метод переосаждения и иногда кристаллизации — добавление этилового спирта к раствору белка в изоэлектрической точке и охлаждение. [c.689]

Из всех физических свойств природного белка растворимость наиболее легко изменяется, причем эти изменения удобно наблюдать. Нагревание белка в водном растворе или в солевых растворах при изоэлектрической точке приводит к полному осаждению. Если же денатурация белка происходит в присутствии растворяющего агента, например в присутствии кислоты или основания, то денатурированный белок остается в растворе и осаждение происходит лишь после установления pH изоэлектрической точки. Денатурированные белки не могут быть [c.439]

Электропроводность. Ввиду того, что белки содержат одновременно аминогруппы и карбоксильные группы, они являются амфотерными электролитами и могут образовать соли как с кислотами, так и с щелочами. Поэтому, в зависимости от концентрации водородных ионов, белковый ион может существовать или в виде аниона или в виде катиона. При некотором значении pH ионы белка могут быть разделены на равные количества катионов и анионов. Такое значение pH носит название изоэлектрической точки при pH, соответствующем этой точке, белок подвергается наиболее легкому осаждению. [c.420]

При высаливании структура белка не повреждается. После удаления соли белок вновь приобретает гидратную оболочку и растворяется. Денатурация белка — практически необратимый процесс. Белок, осажденный кипячением при изоэлектрической точке, после остывания смеси обычно не растворяется. [c.32]

Наиболее эффективно высаливание при pH, равном изоэлектрической точке осаждаемого белка. В этом случае белок не только теряет гидратную оболочку, но и лишается заряда, что приводит к его полному осаждению. [c.12]

Изоэлектрический белок содержит положительно и отрицательно заряженные группы в равном количестве и суммарный сводный заряд, равный нулю. В таком состоянии растворимость белков минимальна, а осаждение максимально. Это обусловлено взаимным притяжением положительно и отрицательно заряженных групп соседних молекул. Растворимость белков зависит от pH и от концентрации солей в растворе. Различные концентрации нейтральных солей оказывают неодинаковое действие низкие концентрации препятствуют осаждению и повышают растворимость. Ионы нейтральных солей нейтрализуют противоположно заряженные ионные группы на поверхности белка, устраняют тем самым причину агрегации белковых частиц. [c.49]

Осадок белка, образовавшийся в его изоэлектрической точке, как. правило, можно вновь растворить, если сдвинуть pH в ту область, где этот белок растворим [878, 1344]. В некоторых случаях добавление к белковой смеси тиоловы соединений в концентрации около 10 М также. препятствует денатурации и осаждению белков [1361]. [c.133]

Если белок достаточно стабилен при выбранных условиях, следует проанализировать его растворимость. Выпадение белка в осадок в зоне изоэлектрической точки будет нарушать электрическую проводимость в колонке, и осадок может просто осесть на дно. Однако приборы, подобные тому, который показан на рис. 5.22, работают даже лучше, если белок осаждается в его изоэлектрической точке. Следует подчеркнуть, что белок вряд ли будет осаждаться вблизи его изоэлектрической точки, а поскольку выпадение в осадок — явление, связанное с растворимостью, достаточно высокая концентрация белка, вызывающая его осаждение, вероятно, будет создаваться только в самой [c.228]

Заряд белков обусловлен в первую очередь остатками аспартата и глутамата, имеющими при нейтральном и щелочных значениях pH отрицательный заряд, и остатками лизина и аргинина, имеющими при слабоосновных и тем более при нейтральном и кислых pH положительный заряд. По мере повышения pH заряд белков проходит от положительных к отрицательным значениям и в изоэлектрической точке (см. 3.1) оказывается равным нулю. Вблизи этой области белок оказывается лишенным ионной атмосферы и его молекулы могут беспрепятственно сближаться до радиуса действия ван-дер-ваальсова притяжения. В ряде случаев это приводит к выпадению белка в осадок. Такой способ выделения белков из раствора называют изоэлектрическим осаждением. [c.234]

Изоэлектрическое осаждение. Поскольку растворимость большинства белков вблизи их изоэлектрической точки оказывается минимальной, можно подобрать такое значение pH, при котором нужный белок выпадет в осадок, а болыиинство загрязняющих белков останется в растворе. [c.80]

Обычный способ получения белков из растворов, очищенных диализом, состоит в осаждении нейтральными солями — сернокислым аммонием или натрием в твердом состоянии или в насыщенном растворе (после предварительного установления pH раствора, соответствующего изоэлектрической точке белка). Согласно более новому способу, белок осаждается этанолом (Кон Эдсалл). [c.417]

Следует остановится на исторически самых старых методах разделения и очистки белков, основанных на фракционном осаждении и соосаждении, т. е. на разнице в растворимости различных белков. В некоторых случаях, когда разница в растворимости белков может быть очень велика, методы осаждения весьма эффективны и сохраняют свое значение и сейчас. Такой случай представляется, например, когда мы выделяем термостабильный белок, не денатурируемый при нагревании из смеси других белков. Мы прибегаем к нагреву смеси и переводим все белки в малорастворимое денатурированное состояние. Подгоняя pH среды к изоэлектрической точке большинства белков, мы осаждаем все термолабильные белки, и в растворе остается лишь термостабильный белок. Так поступают при выделении рибонуклеазы, миокиназы и ряда других белков. Этот прием позволяет избавиться одним ударом от массы балласта и обогатить раствор нужным компонентом во много раз. [c.132]

Ремоцианин [98] — дыхательный пигмент многих ракообразных и моллюсков [99] — предсгавляет собой белок, соединенный с медью. По своим свойствам гемоцианины напоминают глобулины. Они могут быть получены в кристаллической форме осаждением сернокислым аммонием или путем диализа [100, 101]. Изоэлектрическая точка различных гемоцианинов лежит между pH 4,5 и 5,0. При соединении с кислородом гемоцианин переходит в окисленную форму, характеризующуюся синей окраской и содержащую 1 молекулу кислорода на 2 атома меди [102]. При понижении давления кислород отщепляется от гемоцианина, синий цвет которого переходит при этом в желтый. Медь находится в гемоцианине, вероятно, в закисной форме [103]. При действии на гемоцианин синильной или соляной кислот происходит отщепление меди [103, 104]. Гемоцианин представляет собой белок, обладающий видовой специфичностью. Это следует из того, что кристаллы гемоцианина, получаемые от животных различных [c.240]

Белки, высаливание — обратимое осаждение белков нейтральными солями (МаС1, ЫН4.С1, N32804, (N114)2804). Соли подавляют диссоциацию остатков аминокислот, входящих в состав белка. Такое воздействие способствует переходу белка в изоэлектрическое состояние и потере гидратной оболочки. При снижении концентрации солей (разбавлением, диализом) белок переходит в растворенное состояние. [c.13]

Следует помннть, что, во-первых, осаждение белка должно производиться в изоэлектрической точке (pH = 4,5), так как в этих условиях осаждение бывает наиболее полным (белок арахиса и шерсть имеют очень близкие значения изоэлектрических точек) и, во-вторых, при экстракции белка во избежание окрашивания раствора веществами, извлекаемыми из шелухи ореха, pH раствора не должен превышать 8,5. Получаемый белок представляет собой порошок светло-кремового цвета, состоящий почти целиком из арахина и коиарахина й выпускается под торговым названием ардеин. [c.250]

Если церулоплазмин подкислить до pH ниже, чем его изоэлектрическая точка, или обработать цианидом [42], из него можно удалить медь и получить бесцветный белок. Однако при добавлении к такому белку ионов меди реставрировать исходный фермент не удается. Обратимое удаление меди из церулоплазмина достигается при обработке его диэтилдитиокарбаматом (ДТК) [43]. Предварительно медь (И), содержащаяся в белке, восстанавливается цистеином при pH 5,0 и высокой ионной силе. Образующийся затем коллоидальный комплекс ДТК с вышедшей из белка медью с помощью ультрацентрифуги отделяют от раствора апофермента. Последний может быть очищен от всплывающих примесей путем осаждения сульфатом аммония, повторного растворения и диализа. В замороженных растворах апофермент устойчив в течение нескольких месяцев. При добавлении к такому апоферменту ионов меди(1) и реокисления на воздухе из него можжо вновь получить синий церулоплазмин, который по всем своим свойствам неотличим от исходного. В процессе перевода церулоплазмина в его апофермент и обратно не было обнаружено никаких форм, в которых содержание меди было бы промежуточным, т. е. отличным от содержания ее в апоферменте и холоферменте [44]. [c.368]

Белки яичного белка фракционируют осаждением этанолом (различные концентрации), изменением ионной силы (/), изменением величины рИ и температуры методом, аналогичным методу Кона для белков плазмы [16]. Конечную надосадочную жидкость (pH 4,6, температура —15°, I = 0,04, фракция, полученная при 0,11 М насыщении этанолом), содержащую овомукоид, концентрируют, диализуют и сушат вымораживанием. Полученный белок авторы не анализировали, и впоследствии было показано, что он содержит примесь гликопротеина (13,6% гексоз, 13,8% гексозамина и 3% сиаловой кислоты), который но обладает ингибирующей активностью по отношению к трипсину [17]. Этот гликопротеин был выделен методом хроматографии на геле фосфата кальция он оказался сходен с овомукоидом по изоэлектрической точке, константе седиментации и растворимости и, вероятно, мог присутствовать в препаратах овомукоида, по.лучепных другими методами. [c.25]

Разделение с помощью органических растворителей. Белки можно фракционировать с помощью осал дения органическими растворителями, например этанолом, ацетоном. Белки, склонные к агрегации, осаждают сульфатом аммония в присутствии нро-нанола [51]. Органические растворители снижают раствори-люсть белков благодаря изменению диэлектрической проницаемости среды. Поскольку причина осаждения состоит в агрегации молекул вследствие электростатического взаимодействия, что аналогично осаждению в изоэлектрической точке, pH в данном случае более важный фактор, чем при осал<дении солями. Следовательно, с помощью органических растворителей можно разделить очень близкие в структурном отношении белки, имеющие разные изоэлектрические точки. Например, при pH 6,5 парваль-бумины II, III и IV были разделены путем осаждения ацетоном [163]. Белок IV выпадал в осадок при концентрации ацетона 55—60%, белки III и IV — при концентрации 60—65%, белки III и II — при концентрации 65—70%, наиболее кислотные ком-коненты смеси с изоточками р/( —4 выпадали в осадок при концентрации ацетона 70—80%. [c.50]

Есть еще одно, специфическое для данного метода обстоятельство— опасность выпадения белков в осадок вблизи их изоэлектрической точки. Вертикальное расположение колонки и жидкая среда придают этой опасности особое значение. Дело не в том, что выпавший в осадок белок может сильно повлиять на электропроводность окружающего его раствора амфолитов— для этого осадок должен быть слишком плотным. Опасно другое белковые осадки могут постепенно оседать на дно колонки, нарушая плавность градиента pH и загрязняя лежащие ниже зоны. На ранних этапах очистки белков, когда их содержание в исходной смеси невелико, такая ситуация вполне реальна именно она может оказаться решающей для выбора полярности электродов. Фокусирование нужных белков может пройти вполне успешно несмотря на образование осадков, если зона фокусирования окажется лежащей выше области осаждения. Правда, в этом случае во избежание загрязнения очищаемого белка частицами осадка элюировать колонку лучше не через нижний сливной канал, а через верхний отросток, используемый для ее заполнения. С этой целью концентрированный раствор сахарозы подают от насоса через слнвиой канал в нижнюю часть колонки. [c.71]

Белки агрегируют без денатурации не только под действием солей и органических растворителей. Полсон и др. [32] иссле-довали способность различных высокомолекулярных нейтралЬ ных водорастворимых полимеров осаждать белки плазмы. Хотя некоторые из них эффективно осаждали белки, высокая вязкость растворов полимеров препятствует их практическому использованию. Единственным исключением является полиэтилен-гликоль различной степени полимеризации. Растворы этого полимера при концентрации до 20% (вес/объем) имеют не очень большую вязкость, и многие компоненты плазмы осаждаются полиэтиленгликолем до того, как его концентрация достигает 207о (вес/объем). Наиболее эффективным является полиэтиленгликоль с мол. массой 4000 и выше для осаждения белков обычно используют полиэтиленгликоль двух типов — с мол. массами около 6000 и 20000. Поведение белков в растворах полиэтиленгликоля довольно сходно с их поведением в процессе осаждения органическими растворителями. Действительно, молекулу полиэтиленгликоля (ПЭГ) можно рассматривать как полимерный органический растворитель, хотя для получения нужной степени осаждения требуются более низкие его концентрации. При добавлении ПЭГ первым из плазмы выпадает в осадок фибриноген — довольно крупный белок, имеющий сильно асимметричные молекулы и обладающий наименьшей растворимостью в плазме. Затем (при нейтральном pH, близком к изоэлектрической точке) осаждаются у-глобулины, а вслед за ними и другие компоненты. Как и в органических растворителях, растворимость белков в растворах ПЭГ возрастает по мере удаления pH от их изоэлектрической точки. [c.81]

Агрегацию, а следовательно, и осаяадение белковых молекул можно вызвать добавлением к раствору белка солей, например сульфата аммония. Молекулы белка и неорганические ионы при гидратации конкурируют за молекулы воды, и по достижении определенной концентрации соли взаимодействия белок — белок начинают преобладать над взаимодействиями белок — вода, что приводит к агрегации, а затем и осаждению белка. Этот метод широко применяется на начальных стадиях очистки белков. Различия в изоэлектрической точке разных белковых молекул используются при разделении белков с помощью электрофореза. [c.24]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология