Рибонуклеаза выделение

Нативная рибонуклеаза не чувствительна к действию трипсина и химотрипсина. Поэтому сначала проводили окисление рибонуклеазы (остатки цистина при. этом окислялись до остатков цистеиновой кислоты) и окисленный препарат подвергали затем действию протеолитических ферментов. При помош,и хроматографии на дауэкс 50-Х-2 [82] из триптического гидролизата было выделено 15 пептидных фрагментов [82], а из гидролизата после действия химотрипсина — 32 фрагмента [83]. Для количественного определения аминокислотного состава выделенных пептидов и для достижения их чистоты необходимо использовать достаточное количество исходного материала (200 мг). Фракции, содержащие более одного компонента, подвергают повторному фракционированию в несколько измененных условиях. Расщепление с помощью пепсина [6], хотя оно и не столь селективно, позволяет, однако, получить другие пептиды, которые помогают воссоздать полную структуру рибонуклеазы. [c.415]

Тринадцать основных пептидов, выделенных при гидролизе рибонуклеазы, содержат все аминокислотные остатки, входящие в состав этого фермента исследование осколков позволило точно определить количество остатков двух аминокислот [152]. Порядок соединения пептидов между собой в исходном белке был установлен по результатам исследования пептидов, полученных из рибонуклеазы под действием химотрипсина [154]. [c.191]

Рибонуклеаза — фермент, выделенный из поджелудочной железы, печени, селезенки и т. д. Вызывает деполимеризацию рибонуклеиновой кислоты. Молекулярный вес 13 500. Содержит 124 аминокислотных остатка. Строение изучалось в основном двумя группами исследователей — Муром с сотрудниками и Аффинсеном с сотрудниками. Представляет одну полипептидную цепь. Восемь цистеиновых остатков образуют [c.528]

Окисленная рибонуклеаза. Действие химотрипсина на рибонуклеазу менее специфично, чем действие на этот субстрат трипсина. Об этом свидетельствуют более низкие выходы полипептидов при разделении гидролизата методом ионообменной хроматографии [154]. В выделенных полипептидах установлено наличие 151 аминокислотного остатка, в то время как в полипептидах, полученных в результате расщепления трипсином, обнаружено всего 124 остатка. По-видимому, это объясняется тем, что некоторые участки полипептидной цепи появляются более чем в одном из пептидных обломков. О более сложном составе гидролизата можно судить по небольшим количествам примесей (как правило, не выше 15%), присутствующих в большинстве основных фракций. Эти примеси не мешали определению аминокислотного состава фракций, но их присутствие еще раз подчеркивает трудности, которые встречаются при фракционировании смесей пептидов, полученных менее специфическими методами гидролиза. Гидролизаты рибонуклеазы были получены инкубированием в течение 24 час с ферментом при pH 7. При более кратковременном инкубировании гидролизат содержал дополнительно [c.204]

Солеобразование между катионами и сильно сшитыми гелями сефадекса в дистиллированной воде использовалось при выделении различных белков. Очень небольшие количества рибонуклеазы и лизоцима [128, 129], а также трипсина и сывороточного альбумина быка [129] количественно удерживались гелем в дистиллированной воде, а затем полностью вымывались [c.193]

Быстрые методы определения последовательности не решают всех задач, стоящих перед исследователем первичной структуры нуклеиновых кислот, поскольку они не дают информации о Положении и природе минорных компонентов нуклеиновых кислот- Такие задачи встречаются при изучении структуры тРНК. В этих случаях сохраняют свое значение старые методы определения последовательности, заключающиеся в исчерпывающем нли частичном гидролизе рибонуклеазами, выделении индивидуальных олигонуклеотидов, определении их клеотидного состава и идентификации минорных компонентов [c.329]

Выбор того или иного метода для выделения ДНК в каждом конкретном случае определяется природой использованного биологического материала. С подробным описанием методов выделения ДНК из животных и растительных тканей и из бактерий можно познакомиться в другой работе [9]. При работе с микроорганизмами одним из наиболее подходящих является метод Мармура [10]. Он сводится к разрушению клеток, денатурации клеточных остатков и удалению РНК при помощи рибонуклеазы с последующим избирательным осаждением ДНК изопропанолом. С целью предотвращения загрязнения ДНК двувалентными ионами металлов и разрушения ее дезоксирибонуклеазой добавляют хелирующие агенты и додецилсульфат натрия. [c.63]

Аффинная хроматография 5-пептида и 5-белка, образованных в результате протеолитического расщепления бычьей панкреатической рибонуклеазы, обсуждалась в разд. 4,4. Хроматография может даже быть использована для очистки синтетических аналогов 5-пептидов (см. табл. 11.1). Выделение пептидов, содержащих свободную 5Н-группу, рассматривалось в разд. 6.6. [c.130]

Очистка Б. часто включает обработку ферментами, разрушающими другие типы Б. (напр., протеазами и рибонуклеазой при выделении дезоксирибонуклеиновой к-ты). Далее следует фракционирование полученной смеси Б., обычпо сначала грубое (осаждение солями, органич, растворителями и др.), а затем хроматографическое. Очень часто используют методы гель-фильтрации, электрофореза и ионообменной хроматографии, т, к. многие Б. обладают свойствами к-т или оснований. [c.129]

Из различных источников были получены разнообразные формы рибонуклеаз (РНК-азы). Лучше всего изучена панкреатическая РНК-аза (РНК-аза, выделенная из поджелудочно железы). [c.84]

ВЫХ нуклеозид-З -фосфатов легко расщепляются до нуклеозид-З -фосфатов XI, а соответствующие производные нуклеозид-2 -фосфа-тов не затрагиваются ферментом. Следовательно, в РНК — природном субстрате панкреатической рибонуклеазы — также существует 3 —б -фосфодиэфирная связь Такой вывод был подтвержден далее выделением нуклеозид-З -фосфатов при расщеплении РНК под действием фосфодиэстеразы селезенки, причем при этой реакции промежуточного образования циклического фосфата XII не происходит и миграция фосфорильной группы исключена [c.43]

Различного рода рибонуклеазы были обнаружены во многих животных тканях и в растениях [2, 3]. К числу наиболее изученных относится рибонуклеаза (К. Ф., 3.1.4.8) из такадиастазы (получаемой из культур Aspergillus oryzae) [24]. Этот фермент специфически гидролизует межнуклеотидные связи РНК между З -ГМФ и 5 -гидроксильными группами соседних нуклеотидов. Рибонуклеазы, выделенные из растений, и рибосомная рибонуклеаза из Е. соИ гидролизуют РНК до нуклеозид-З -фосфатов [25]. [c.88]

S-PHK используют для образования полилизина в белоксинтезирующей системе, содержащей лизин, меченный тритием, и поли-А в качестве источника информации. После определенного периода инкубации экстрагируют фенолом s-PHK с прикрепленным к ней полилизином и обрабатывают этот комплекс рибонуклеазой. Выделенный лизиновый полипептид содержит некоторое количество меченого аденозина, который может быть отщеплен с помощью щелочи [81]. [c.279]

Фермент рибонуклеаза из поджелудочной н<елезы быка — хорошо охарактеризованный белок, полная структура которого теперь уже известна (см. стр. 94)— расщепляет нолинуклеотидную цепь аналогичным способом. Этот фермент представляет собой эндонуклеазу, т. е. он атакует внутри-нуклеотидные связи. При этом для действия его необходимо, чтобы фосфатная группа, участвующая в образовании чувствительной к расщеплению Р — 0-связи, была присоединена в положении 3 пиримидинового нуклеозида. Первая стадия расщепления, т. е. образование циклических фосфатов из полинуклеотидов, по-видимому, обратима. Того же типа расщепление (по положению Ь) вызывают фосфодиэстеразы, выделенные из различных источников растительного происхождения (например, из растений гороха, табака или райграса). Все эти фосфодиэстеразы относительно неспецифичны в том смысле, что для их действия безразлична природа оснований, входящих в состав чувствительных нуклеотидов. Известен, однако, фермент, выделенный из Ba illus subtilis, который, по-видимому, обладает специфичностью, дополняющей специфичность панкреатического фермента (т. е. рибонуклеазы, выделенной из поджелудочной железы). Он катализирует по преимуществу гидролитическое отщепление остатков, соседних с З -пурино-выми остатками. Еще более высокой специфичностью обладают ферменты, выделенные из неочищенных препаратов такадиастазы. Один из них — рибонуклеаза Т1 — катализирует расщепление только тех межнуклеотидных связей, в образовании которых участвуют З -гуаниловые нуклеотиды, а второй — рибонуклеаза Т2 — расщепляет только связи, образованные с участием З -адениловых нуклеотидов. [c.129]

Человек в течение длительного времени потреблял белки, выделенные главным образом из растений и животных. В последние ]1,есятилетия ведутся работы по искусственному получению белковых веществ (синтезированы инсулин, рибонуклеаза). Э го очень важная проблема, так как эксперты Всемирной организации здравоохранения считают, что примерно половина населения земного шара находится в состоя ши белкового голодания, а мировая нехватка пищевого белка составляет около 15 млн. г в год при норме потребления белка в сутки взрослым человеком 115 г. [c.260]

Неоспоримое преимущество этого метода по сравнению с классическими методами синтеза пептидов состоит в том, что ни на одной из стадий он не требует выделения растущей полипептидной цепи. В силу чрезвычайно низкой растворимости аддукт пептида и полимера легко отмывается после каждой реакции от побочных продуктов, растворителей и избытка реагентов без потери пептида, после чего аддукт готов к следующей реакции- В настоящее время метод автоматизирован, и запрограммированные аминокислотные синтезаторы без труда могут присоединить шесть аминокислот к растущей полипептидной цепи за 24 ч. Эти приборы добавляют реактивы в падлен<ащей последовательности, меняют условия реакций, обеспечивают необходимое время реакции, отмывают побочные продукты, после чего начинают всю операцию сначала. При помощи метода ТФСП были синтезированы инсулин и фермент рибонуклеаза, состоящий нз 124 аминокислот. [c.406]

При эгом они основывались на специфическом действии ферментов. В пептидах, образовавшихся в результате трипсинного гидролиза, С-концевыми аминокислотами являются аргинин и лизин. Пептиды, выделенные из гидролизата рибонуклеазы химотрипсином, содержат основном в качестве концевых С-аминокислот остатки тирозина и фенилаланина. [c.524]

Установление строения рибонуклеазы позволило показать, что ее активность сосредоточена вблизи карбоксильного конца цепи. Пользуясь субтилизином и аминопептидазой, можно отщепить до 20 аминокислотных остатков со стороны аминной группы, и при этом активность фермента не изменится. Еще ярче это выражено у фермента, выделенного из дынного дерева —папаина. В нем можно удалить до 120 остатков из 180, не нарушая его действия. [c.528]

В период между 1944 н 1954 гг. развивались аналитические исследования по выделению, очистке и определению строения пептидов с высокой биологической активностью, а также методические разработки в области синтеза, например в 1950 г. был разработан метод смешанных ангидридов (Виланд, Буассона, Воган). Эти успехи сделали возможным химический синтез природных пептидов, обладающих биологической активностью. В 1953 г. дю Виньо удалось синтезировать первый пептидный гормон — окситоцин. Эта работа была удостоена Нобелевской премии за 1955 г. В следующие годы наступило бурное развитие синтетической пептидной химии, было предложено несколько новых защитных групп, эффективные методы кои-деисаш1и и иовые методические варианты, такие, как разработаниь й Меррифилдом в 1962 г. пептидный синтез иа полимерных носителях. Химический синтез инсулина и рибонуклеазы ознаменовал переход к белковому синтезу. [c.100]

Из ферментов, катализирующих гидролитический распад РНК, наиболее изучены рибонуклеазы I. Они гидролизуют фосфодиэфирные связи внутри молекулы РНК. Выделенная из поджелудочной железы многих животных РНКаза состоит из 124 аминокислотных остатков во всех случаях, хотя ферменты несколько различаются последовательностью аминокислотных остатков выяснена также третичная структура ряда РНКаз (см. главу 4). Получен в гомогенном состоянии из плесневого гриба рода Aspergillus фермент гуанилрибонуклеаза, катализирующая эндонуклеолитическое расщепление РНК. [c.499]

Основные научные работы Мура, которые он проводил совместно с У. X. Стайном, посвящены исследованию строения белков. Они разрабатывали точные аналитические методы для определения аминокислотного состава белков. Развили (1951) метод ионообменной хроматографии, который применили для выделения и очистки рибонуклеазы. Благодаря сочетанию хроматографических методов анализа, разработанных Муром и Стайном, с предложенным ими фотометрическим нингидринным методом и их же автоматическим коллектором фракций они создали методику, позволяющую анализировать белковый гидролизат в течение двух недель. Применение синтетических ионообменных смол (сульфокатионитов) позволило им сократить (1950-е) это время до недели. Затем (1958) процесс ими был автоматизирован, а время анализа уменьшено до нескольких часов. Мур и Стайн установили [c.347]

Хотя на данном этапе методы химического гидролиза не позволяют сделать выбора между 3 —5 - и 2 —5 -межнуклеотидными связями, доказательства, по-видимому, исключительного присутствия 3 —5 -структуры были получены на основании исследований ферментативного гидролиза рибонуклеиновых кислот и простых нуклеотидных производных. Из различных источников был выделен ряд нуклеаз, которые катализируют гидролиз нуклеиновых кислот на более мелкие фрагменты. Панкреатическая рибонуклеаза [93] — один из группы ферментов, обнаруживающих высокую специфичность к рибонуклеиновым кислотам,— была тщательно изучена и дано объяснение механизма ее действия. Ранние исследования показали, что фермент действует по пиримидиннуклеозидным звеньям, так как крупные педиализуемые остатки после ферментативного расщепления рибонуклеиновой кислоты значительно обогащены пуринами [94] кроме того, выделяются пиримидиновые мононуклеотиды, но не обнаружено свободных пуриновых мононуклеотидов [75, 95, 96]. Дальнейшие исследования кислотного или щелочного гидролиза продуктов, полученных в результате последовательной обработки рибонуклеиновой кислоты рибонуклеазой и фосфомоноэстеразой предстательной железы, привели к заключению, что специфичность рибонуклеазы такова, что нуклеиновые кислоты расщепляются ею с образованием смеси пиримидиновых мононуклеотидов и пуриновых олигонуклеотидов, содержащих в качестве концевой единицы пиримидиновый нуклео-зид-2 (или 3 )-фосфат [75, 97]. [c.377]

Следующим примером является одностадийное выделение пептидов, несущих аффинную метку, из активного центра нук-леазы стафилококка и панкреатической рибонуклеазы [49]. [c.416]

Этот новейший метод нашел применение при выделении панкреатической рибонуклеазы цыпленка на фосфоцеллюлозе [35] и фруктозо-1,6-дифосфатазы печени кролика на карбоксиме-тилцеллюлозе [36]. Эффективность этого метода видна из следующего примера при очистке глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы путем элирования фермента с СМ-сефадекса 2 мМ раствором глюкозо-6-фосфата выход фермента составил 91%, а удельная активность увеличилась в 51 раз [37]. [c.10]

В некоторых других видах РНК также обнаружено формирование спиральных структур. Сообщалось, например, что комплементарная РНК (стр. 237), получаемая ферментативным путем in vitro на ДНК (как на матрице), выделенной из бактериофага Т2, содержит при определенных условиях высокоупорядоченную двойную спиральную структуру, сходную с таковой ДНК [74]. Однако это, по-видимому, не относится к информационной РНК, присутствующей в полисомах (стр. 281). Форму двойной спирали имеют также РНК различных вирусов, в том числе РНК реовируса раневой опухоли и репликативных форм вируса полиомиелита [36, 74, 75], вируса Сендай [76] и вируса эпцефаломиокардита [77]. Об этом свидетельствуют результаты, полученные при определении относительного содержания комплементарных оснований и при изучении тепловой денатурации о том же говорят и устойчивость к панкреатической рибонуклеазе и отсутствие реакции с формальдегидом, а также данные рентгеноструктурного анализа 178, 95]. [c.59]

С другой стороны, РНК-зависимая РНК-полимераза, выделенная из клеток животных, по своим свойствам значительно отличается от ДНК-зависимого фермента [136]. В опытах с экстрактами из асцитных опухолей Кребс II количество включенного рибонуклеотида увеличивалось линейно по мере возрастания количества затравочной РНК и не зависело от источника использованной затравки [137]. Ферментные препараты этих экстрактов содержат некоторое количество РНК. Если эту эндогенную затравку разрушить рибонуклеазой, которую затем можно удалить с помощью бентонита, то активность изучаемого фермента оказывается сильно ингибированной, в то время как активность ДНК-зависимой РНК-полимеразы в этих условиях не меняется. Добавление же дезоксирибонуклеазы не действует на РНК-зависнмую РНК-поли-меразу, но угнетает ДНК-зависимый синтез. Более того, обе ферментные системы отличаются по оптимуму pH и потребности в различных ионах. ДНК-зависимая ферментная система имеет оптимум pH около 7,5 при этом ее действие усиливается добавлением меркаптоэтанола и ионов марганца. РНК-зависимый фермент активнее всего при pH 9,5, но в этих условиях ионы марганца м меркаптоэтанол подавляют его активность. [c.246]

В настоящее время при помощи хроматографии производят полное удаление солей из воды (получение дистиллированной воды без перегонки), разделение сложных смесей аминокислот и гидролизатов белков (см. рис. 56), разделение сложных смесей фосфоса-харидов, пуриновых и пиримидиновых оснований (рис. 57), фракционирование белков (цитохрома, рибонуклеазы, инсулина и др.), фракционирование нуклеиновых кислот и различных полимеров, отделение пепсина, трипсина, алкогольдегидрогеназы, очистку антител, выделение стрептомицина, хлортетрациклина, полимиксина и других антибиотиков, а также алкалоидов, гормонов, антигиста-минных веществ. Большой интерес представляет также терапевтическое использование ионообменных смол для регулирования состава ионной среды в желудочно-кишечном тракте и для диагностических целей. [c.116]

РИБОНУКЛЕАЗЫ (РНК-азы) — ферменты, катализирующие гидролитич. расщепление рибонуклеиновых к-т на олиго- и мононуклеотиды. Р. широко распространены в природе и присутствуют во всех исследованных тканях. Наиболее изучена панкреатическая Р., секретируемая поджелудочной железой [систематич. название полирибонуклеотид — 2-олиго-нуклеотидо-трансфераза (циклизующая) шифр 2.7.7.16 — см. Номенклатура и классификация ферментов]. Р., выделенная в кристаллич. виде из поджелудочной железы быка экстракцией разведенной серной к-той с последующим фракционированием (NH4)2S04 — белок основного характера (р/ 7,8) с мол. в. 13 ООО. Установлена природа и последовательность аминокислотных остатков, входящих в состав Р., и выяснены существенные детали ее пространственной структуры, что дало возможность воссоздать трехмерную модель этого белка. Молекула панкреатич. Р. представляет собой одинарную полипептидиую цепь, состоящую из 124 аминокислотных остатков N-концевой аминокислотой в молекуле Р. является лизин, С-концевой — валин. [c.337]

Для того чтобы выделить фермент и дать возможно более полную характеристику его физических, химических и каталитических свойств, прежде всего следует выбрать объект, отличающийся высоким содержанием исследуемого фермента. Сейчас известно, например, что бобы канавалии содержат много уреазы, что батат богат р-амилазой, ячменный солод — а-амилазой, млечный сок папайи — папаином, клубни картофеля — фосфорилазой, листья сахарной свеклы — инвертазой, в щитке семян кукурузы содержится много рибонуклеазы и т. д. Для экстрагирования фермента необходимо разрушить цитоплазматическую мембрану клетки, а возможно, и клеточную оболочку. С этой целью применяют обработку материала с помощью пресса или в гомогенизаторе, растирание в ступке с песком, встряхивание при высоких скоростях с песком или стеклянными шариками, замораживание и оттаивание, а также высушивание ацетоном. При выделении [c.98]

Особые преимущества и.меет выделение рибонуклеиновых кислот из гомогенатов тканей млекопитающих, микроорганизмов и вирусов экстракцией фенолом и водой при комнатной температуре, так как при этом белки и дезоксирибонуклеиновые кислоты выпадают в осадок, активность рибонуклеазы подавляется и высокополимерные продукты могут быть получены с хорощими выходами [11—14]. Прямая экстракция дрожжей водным раствором фенола была применена для препаративного получения транспортных РНК [15]. В примененных условиях экстракции высокомолекулярный материал почти не экстрагировался. Комбинирование экстракции с быстрой очисткой РНК на анионитах ЭКТЕОЛА- [16] или ДЭАЭ-целлюлозе [17, 18] дает возможность получать относительно чистую транспортную нуклеиновую кислоту в больших количествах. [c.365]

Смотреть страницы где упоминается термин Рибонуклеаза выделение: [c.297] [c.79] [c.130] [c.146] [c.163] [c.191] [c.142] [c.120] [c.361] [c.129] [c.385] [c.130] [c.405] [c.219] [c.254] [c.31] [c.87] [c.24] [c.192] [c.321] [c.22]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология