Эксклюзионная хроматография колонки

Принцип метода. Метод молекулярно-ситовой хроматографии (гель-хроматографии, гель-проникающей хроматографии или эксклюзионной хроматографии) —это вид твердо-жидкостной хроматографии, основанный на различной способности молекул веществ, отличающихся своими размерами, проникать внутрь заполненных растворителем пор неподвижной фазы и задерживаться там на различное время. Молекулы, имеющие большой размер, не проникают совсем или проникают только в часть пор носителя и вымываются из колонки раньше, чем маленькие молекулы, вследствие чего обеспечивается разделение по размеру молекул в растворе. [c.69]

Селективность колонок в эксклюзионной хроматографии определяется их разделительной емкостью. Если набор колонок оптимизирован по диапазону разделения, то для повышения селективности приходится увеличивать число колонок, а следовательно, и продолжительность анализа. [c.52]

При работе с новым видом сорбента или с новой партией следует упаковать сначала короткую колонку (10—12 см) при относительно невысоком давлении (20—25 МПа). При хорошем результате можно попытаться упаковать более длинную (200—250 мм) колонку при высоком давлении (40—60 МПа). Если эффективность увеличится примерно вдвое одновременно с увеличением сопротивления потоку в два раза, значит сорбент прочен, его можно использовать при таких параметрах набивки. Если сопротивление потоку возрастет в 2,5—6 раз, это значит, что сорбент непрочен и разрушается, образующаяся пыль резко увеличивает сопротивление колонки, нужно снижать давление при набивке. Особую осторожность следует проявлять при выборе давления для набивки силикагелей с широкими порами (более 10 нм) и с большим объемом пор, которые находят все более широкое применение в эксклюзионной хроматографии полимеров и в анализе биологических объектов — белков, полипептидов и др. [c.118]

Ограниченный диапазон коэффициентов распределения определяет и главный недостаток эксклюзионной хроматографии — заметно меньшее, чем в других вариантах ВЭЖХ, число пиков, которые могут быть полностью разделены на колонке заданной эффективности. Однако в последнее время благодаря успехам достигнутым в технологии изготовления высокоэффективных колонок, этот метод все шире применяют и для разделения малых молекул. [c.43]

Рис. 8.30. Промежуточная стадия элюирования из колонки в эксклюзионной хроматографии

Эксклюзионную хроматографию широко используют при исследовании полимеров, определении их молекулярных масс, а также в биологии и медицине для анализа белков, крови и других объектов. Этот метод удобен для исследования образцов неизвестного состава, так как можно не опасаться нежелательных превращений веществ в колонках. Метод эксклюзионной хроматографии можно использовать и в неорганическом анализе. Например, при помощи некоторых природных цеолитов можно разделить ионы в зависимости от их размера. Гидратированные ионы или многоатомные частицы не могут проникнуть в поры цеолита, их легко отделить от ионов малого размера, проникающих в матрицу цеолита. [c.328]

В упрощенном виде механизм эксклюзионной хроматографии может быть представлен следующим образом. Неподвижная фаза — пористый материал, причем средний размер пор сопоставим с размерами молекул разделяемых веществ. Молекулы смеси в колонке, заполненной таким материалом, будут вести себя по-разному, в зависимости от размеров. Наиболее крупные молекулы, не способные диффундировать внутрь пор неподвижной фазы, могут находиться только в пространстве между частицами и, следовательно, их удерживаемый объем будет равен объему колонки минус суммарный объем частиц неподвижной фазы (Ко). Молекулы, размеры которых меньше наиболее мелких пор сорбента, способны диффундировать внутрь частиц, поэтому удерживаются в колонке дольше, чем более крупные молекулы. Объем их элюирования равен полному объему растворителя в колонке, т. е. сумме объема пор и объема между частицами (К/). Молекулы промежуточных размеров, для которых доступна та или иная доля пор сорбента, будут выходить из колонки между объемами Уо и I//. Если ввести в колонку смесь веществ с известными и в достаточной степени различающимися молекулярными массами, из хроматограммы можно получить калибровочную кривую, подобную изображенной на рис. 111.40. Следовательно основная сфера применения эксклюзионной хроматографии — фракционирование смесей в соответствии с их молекулярными массами. Калибровочная кривая эксклюзионной хроматографии в своей средней части содержит линейный участок, в котором разделяющая способность колонки и точность измерений максимальны. Эта линейная часть обычно охватывает примерно два порядка молекулярных масс. Рабочий диапазон эксклюзионной колонки зависит от размера пор и смещается в область больших масс при увеличении среднего размера пор сорбента. Поэтому для работы в широком диапазоне масс обычно последовательно соединяют две или более колонок, различающихся по размеру пор. [c.333]

Аппаратура для эксклюзионной хроматографии принципиально ничем не отличается от той, которую используют в других видах ВЭЖХ. Эксклюзионное разделение можно осуществить на любом жидкостном хроматографе, установив в него соответствующие колонки. Характеристики аппаратуры влияют главным образом на точность получаемых результатов. Специфичными для данного метода являются только некоторые детекторы и особые требования к системам обработки данных. [c.43]

В хроматографических процессах, согласно уравнению Ван-Деемтера, существует оптимальная скорость потока, при которой колонка имеет наиболее высокую эффективность. Для большинства экскпюзионных колонок с размером частиц Юмкм она составляет около 1 мл/мин. При повышении скорости потока ВЭТТ возрастает, главным образом, за счет удшения масообмена. В эксклюзионной хроматографии этот процесс выражен наиболее резко, так как коэффициенты диффузии сильно снижаются при повышении молекулярной массы. Отсюда также следует, что снижение эффективности в наибольшей степени наблюдается для высокомолекулярных фракций. [c.50]

Температура. Обычно эксклюзионное разделение проводили при 20-25°С, часто без термостатирования. Некоторые труднорастворимые полимеры (полиэтилен, полипропилен, полиамиды и др.) анализируют при 135-150°С. Повышение температуры широко применяют для снижения вязкости растворителей, так как при этом увеличиваются коэффициенты диффузии и, следовательно, эффективность колонок. В связи с тем, что этот эффект сильнее проявляется для самых высокомолекулярных фракций, даже небольшое повышение температуры анализа позволяет улучшить разделение именно в той области, где оно наименее эффективно. Поэтому целесообразно работать при повышенных температурах (40-50°С вместо комнатной температуры) и в тех случаях, когда подвижная фаза имеет низкую вязкость. Некоторые полужесткие гели для эксклюзионной хроматографии в водных средах (например, ОН-пак и ион-пак) рекомендуется использовать при 40-80°С, так как в этих условиях они имеют максимальную разрешающую способность. [c.50]

Типичные значения объема пробы в эксклюзионной хроматографии лежат в пределах 25-300 мкл. Естественно, что при большей дозе возрастает размывание полосы. Как правило, объем пробы должен быть менее 1/3 объема, занимаемого в колонке индивидуальным низкомолекулярным соединением, элюирующимся из колонки в зоне полного проникания. Этот объем легко определить по ширине его пика у основания. Однако если чувствительность детектора недостаточна и приходится увеличивать массу образца, то нужно увеличивать объем пробы, а не концентрацию, так как в этом варианте ухудшение характеристик колонки будет заметно меньше. [c.51]

В эксклюзионной хроматографии до недавнего времени широко использовали колонки, набитые сорбентами с размером зерна 40-100 мкм (например, колонки со стирогелями зернением 37-75 мкм). Внутриколоночное размывание в этих колонках было достаточно большим, и во многих случаях для получения корректных результатов анализа требовалось вводить поправку на приборное уширение. Современные колонки, заполненные сорбентами с размером зерна 5-10 мкм, имеют значительно более высокую эффективность (до 50000 - 60000 т.т./м), значение о У них мало, а приборное уширение в значительной степени определяется внеколоночным размыванием. Поэтому при работе с такими колонками нужно обращать особое внимание на минимизацию мертвых объемов во всех внеколоночных коммуникациях. [c.52]

Основной областью применения эксклюзионной хроматографии, безусловно, является исследование полимеров. Однако уникальные особенности этого метода, отличающие его от всех остальных вариантов ВЭЖХ (разделение молекул по размеру и полное элюирование всех компонентов из колонки за короткое время), обусловливают его преимущественное использование и для решения других задач. К ним, в первую очередь, относится разделение молекул, заметно различающихся по размерам. [c.57]

И наконец, эксклюзионная хроматография представляет собой наилучший метод для предварительного исследования образцов неизвестного состава. За короткое время, практически не опасаясь каких-либо нежелательных превращений вещества в колонке, можно получить ценную информацию о степени сложности анализируемой смеси и (ориентировочно) о молекулярной массе ее компонентов. Все остальные разновидности ВЭЖХ требуют достаточно больших затрат времени при выборе условий разделения. Результаты предварительного разделения часто облегчают выбор варианта ВЭЖХ, который целесообразно использовать для детального изучения состава образца. Кроме того, эксклюзионная хроматография обычно является первым этапом при исследовании сложных смесей путем сочетания различных вариантов ВЭЖХ, так как позволяет легко выделить из смеси нужную группу веществ. [c.59]

Еще большую эффективность имеет сорбент PRP-1 с размером зерен около 5 мкм. который выпускают с 1984 г. набитым в колонки размерам 150X4,1 мм, По селективности данный материал подобен обращенно-фазным сорбентам ie но работоспособен в диапазоне рН=1—13 при концентрации буферных солей до 0.5—1 М. Кроме того, его можно использовать в эксклюзионной хроматографии для разделения молекул с молекулярной массой от 2X10 до 10 , а также в ион-парной хроматографии. [c.100]

В эксклюзионной хроматографии разделение происходит на колонках, заполненных пористыми сорбентами (гелями), которые должны иметь большой объем пор, выдерживать достаточно высокие давления и не взаимодействовать с анализируемыми веществами. Эти сорбенты подразделяются на две группы, каждая из которых имеет свои достоинства и недостатки—полужесткие (органические) и жесткие (неорганические) гели. Последний не являются гелями в собственном смысле этого слова, так как их пористая структура сформирована заранее и не связана с набуханием в растворителе. Такие материалы принято называть аэрогелями. [c.102]

Первоначально для разделения полимеров применяли различные промышленные силикагели. Изучен ряд силикателей, выпускаемых в СССР, и предложен набор из четырех марок (КСК-2 КСК-1 силохром СХ-1 и МСА-2500), перекрывающий диапазон молекулярных масс от 10 до 10 . Главный недостаток промышленных силикагелей заключается в плохой воспроизводимости их характеристик за счет весьма широких допусков, которые вполне допустимы при их использовании в технике. Кроме того, существенным затруднением является необходимость размола и выделения узких фракций с требуемым размерим частиц, как описано в разд. 5.1. Поэтому были разработаны силикагели, специально предназначенные для эксклюзионной хроматографии. Первым из таких сорбентов был лихросфер. Сферические частицы сорбента имеют большой удельный объем пор, хорошие механические свойства и позволяют получить колонки достаточно высокой эффективности. [c.107]

К сорбентам для высокоэффективной эксклюзионной хроматографии белков, ферментов и других биологических объектов предъявляются значительно более жесткие требования по инертности поверхности, чем к сорбентам для разделения синтетических полимеров. Кислые силанольные пруппы силикагеля обладают высокой адсорбционной активностью, проявляют слабые ионообменные свойства и способны денатурировать белковые молекулы. Поэтому поверхность жестких сорбентов очень тщательно модифицируют прививкой монослоев нейтральных гидрофильных органических групп. К таким сорбентам относятся ц-бондагель Е и материалы, содержащие глицерильные группы. Поверхность д-бондагеля Е модифицирована алифатически-ми эфирными группами. Колонки с этим сорбентом можно использовать с любыми растворителями от пентана до буферных растворов в области pH от 2 до 8. Они характеризуются высокой разрешающей способностью, но из-за малого рабочего объема (примерно 1,2 мл на колонку) требуется особо точная подача подвижной фазы. [c.108]

Наилучшими свойствами для эксклюзионной хроматографии биополимеров обладают TSK-гели типа SW. Поверхность этих материалов покрыта гидрофильными ОН-грутопами по особой технологии, обеспечивающей исключительную инертность сорбента, практически не уступающую сефадексу. Поэтому эксклюзионное разделение, как правило, не осложняется побочными сорбционными процессами. ТЗК-гели SW выпускают с тремя размерами пор и они перекрывают диапазон молекулярных масс от 5 10 до 4 10 (по декстрану) или до 10 (по глобулярным белкам). За счет большого объема пор колонки, с этими гелями характеризуются высокой разделительной способностью, а их гарантированная эффективность составляет 16 тыс.т.т./м. Калибровочные кривые для некоторых модифицированных жестких сорбентов приведены на рис. 4.11. [c.109]

Для регенерации силикагелевых колонок рекомендуется использовать следующий ряд растворителей тетрагидрофуран, метанол, тетрагидрофуран, метиленхлорид, гексан. Ряд для обращенно-фазных колонок и нитрильных фаз вода, диметилсульфоксид, метанол, хлороформ, метанол. Ряд для аминофаз и сильных анионообменников вода, метанол, хлороформ, метанол, вода (если аминофазу используют в водных системах растворителей). Ряд для аминофаз (неполярные растворители) хлороформ, метанол, вода, метанол, хлороформ. Ряд для сильных катионитов вода, тетрагидрофуран, вода. Ряд для органических гелей — сополимеров стирола и дивинилбензола (эксклюзионная хроматография) толуол, тетрагидрофуран, 1%-ный раствор меркаптоуксусной кислоты в толуоле или тетрагидрофуране, тетрагидрофуран, толуол. Приведенные рекомендации могут дополняться и видоизменяться в соответствии с опытом, накапливаемым в процессе работы. Если в результате регенерации не удалось восстановить работоспособность колонки, следует попытаться провести ее ремонт. [c.125]

Высокая стабильность скорости потока. Точность поддержания скорости потока в колонке во многом определяет результаты как качественного, так и количественного анализа. Для основных вариантов ВЭЖХ нестабильность потока не должна превышать 0,5—1%. В эксклюзионной хроматографии при анализе молекулярно-массового распределения полимеров требования еще выше—0,1—0,3%. Кроме того, весьма желательно, чтобы насос не давал пульсации потока и имел малый рабочий объем для быстрой смены растворителя в режиме градиентного, элюирования. [c.139]

Дифференциальный рефрактометр непрерывно регистрирует изменение показателя преломления элюата на выходе из колонки. Главным достоинством этого детектора является универсальность, так как при выборе подходящего растворителя он может детектировать любые вещества. Поэтому он занимает второе место (после УФ-детектора) по частоте использования. К другим достоинствам рефрактометра относятся возможность работы с любыми растворителями в широком интервале скорости потока, невьюокие требования к чистоте подвижной фазы, надежность и удобство в эксплуатации. Некоторые модели детекторов могут работать при температуре до 150 С, что является исключительно важным для эксклюзионной хроматографии ряда синтетических полимеров. [c.153]

Наиболее целесообразно использовать предколоночный фильтр в эксклюзионной хроматографии полимеров, так как в этом случае вероятность присутствия нерастворимых частиц в анализируемых образцах гораздо выше, чем при анализе смесей индивидуальных соединений. При установке такого фильтра в систему с общей эффективностью 20000 т.т., включающую две эксклюзионные колонки длиной по 30 см, потеря эффективности составляет 10ОО—1500 т.т. [c.161]

Выделяющиеся из недегазированной подвижной фазы пузырьки воздуха приводят к нестабильности нулевой линии детектора, ухудшают эффективность колонок для эксклюзионной хроматографии, заполненных полужесткими гелями, могут вызвать окисление лабильных соединений и некоторых привитых фаз. [c.189]

Коэф. емкости к существенно влияет на величину R при изменении к от О до 10 (оптим. пределы) сильно возрастает. Значение к определяется уд. пов-стью сорбента и его кол-вом в колонке, а также константой адсорбц. равновесия (константой Генри). Коэф. селективности а определяется различием констант адсорбц. равновесия двух разделяемых компонентов. При увеличении а (от I до 5) резко возрастает, при дальнейшем увеличении а-меняется мало Селективность колонок зависит от хим. структуры пов-сти (в эксклюзионной хроматографии-геом. структуры) сорбента, состава элюента, т-ры колонки и строения разделяемых соединений. Т. к. сорбция хроматографируемых в-в в Ж. X. определяется попарным взаимод. трех осн. компонентов системы-сорбента, разделяемых в-в и элюента, то изменение состава элюента - удобный способ оптимизации процесса разделения. [c.152]

Для работы в водных системах используют главным образом жесткие сорбенты или псшужесткие гели спещ1альньЕХ типов. Затем по калибровочным кривым или данным о диапа )нс фракционирования выбирают сорбент нужной пористости с учетом имеющихся сведений о молекулярной массе образца. Если анализируемая смесь содержит вещества, отличающиеся по молекулярной массе не более чем на 2-2,5 порядка, то обычно удается разделить их на колонках с одним ра 1мсром пор. При болсс широком молскулярно-массовом диапазоне используют наборы из нескольких колонок с сорбентами различной порис-гости. Ориентировочно калибровочную зависимость в этом случае получают сложением кривых для отдельных сорбентов. Особое значение в эксклюзионной хроматографии придают линейной зависимости логарифма молекулярной массы полимера от удерживаемого объема. В этом случае можно рассматривать хроматограмму как зеркальное отображение дифференциальной кривой ММР в логарифмическом масштабе сорбента. [c.177]

Бернс и Чилтон [163] получили патент на способ, основанный на гель-хроматографии. Декстрановый гель с размером пор 40—120 мкм использовался для заполнения колонок. Кремнезем со средней молекулярной массой 6 млн. (т. е. со средним размером частиц 20 нм) разделялся по размерам во всей области молекулярных масс. Другие авторы [164] использовали шарики из пористого стекла для заполнения колонок с целью их применения в эксклюзионной хроматографии коллоидов. Применительно к условиям разделения коллоидного кремнезема толщина двойного слоя на поверхности частиц при pH 9,5 составляла 6 нм. Поэтому эффективный диаметр частиц оказался на 12 нм больше, чем истинный, а эффективный диа- [c.475]

Диаметр колонок от 1 до 10 мм, длина до 300 мм, сорбенты 70 наименований для всех видов жидкостной хроматографии обратно- и прямофазной, ионообменной, ион-парной, ионной, эксклюзионной. Каждая колонка имеет индивидуальную тест-хроматограмму и паспорт. [c.449]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология