Флуоресценция время жизни, методы измерения

Среднее время жизни т возбужденной молекулы играет существенную роль при рассмотрении механизмов реакций возбужденных молекул. Импульсный метод определения т состоит в следующем. Раствор флуоресцирующего вещества облучают коротким импульсом света ( 2—4 нсек) и интенсивность флуоресценции измеряют как функцию времени. Интенсивность флуоресценции (/f)i в момент I после начала измерений связана с интенсивностью флуоресценции в начальный момент (//)о соотношением [c.62]

Другим методом измерения времени жизни флуоресценции является фазовый метод. Так как испускаемая флуоресценция запаздывает по сравнению с возбуждающим светом, то при возбуждении флуоресценции пульсирующим светом возникает сдвиг фаз а, который измеряется экспериментально и из которого вычисляют время жизни флуоресценции, связанное с v соотношением [c.63]

Ранее было замечено (стр. 121), что фосфоресценция, обусловленная триплет-синглетными переходами, обычно не наблюдается в жидких растворах, так как триплетное состояние имеет сравнительно большое естественное радиационное время жизни, и дезактивация в результате столкновений происходит чаш е, чем эмиссия. Оказалось возможным, однако, наблюдать фосфоресценцию эозина в глицерине или этаноле и измерить отношение ее интенсивности к интенсивности флуоресценции [44]. Это было сделано при помощи спектрофлуориметра и двух вращающихся секторов, один из которых служил для прерывания пучка возбуждающего света, другой — для прерывания пучка излученного света. Когда оба прерывателя находятся в одинаковой фазе, измеренная интенсивность обусловлена фосфоресценцией плюс флуоресценцией если они в разных фазах — то только фосфоресценцией. Это очень перспективный метод для определения скоростей перехода между триплетным и синглетным состояниями. По сравнению с флеш-методом он имеет то преимущество, что для облучения можно использовать монохроматический свет с различной частотой, кроме того, можно точно измерить квантовые выходы наконец, стационарная концентрация молекул в триплетном состоянии мала, и поэтому можно пренебречь триплет-триплетным тушением. С другой стороны, если естественное время жизни велико или тз шение сильно, эмиссия будет очень слабой [c.165]

Второй метод измерения основан на определении степени модуляции двух сигналов [191]. Очевидно, что чем больше время жизни флуоресценции, тем меньше степень ее модуляции. Степень модуляции в пучке возбуждающего света (ms) и в пучке флуоресценции (ш/) связаны с соотношением [c.254]

Для измерения времени жизни флуоресценции обычно используют два метода. Первый — и наиболее точный — требует применения флуорометра (см. раздел П1,М, 1—2), при помощи которого действительное время жизни то измеряется непосредственно в условиях опыта. В разбавленных растворах и в от сутствие специально добавляемого тушителя это дает сумму [c.286]

Из измерений флуоресценции невозможно определить значения kn и kg в отдельности, и для того, чтобы получить значение kg, нужно использовать как время жизни то, найденное описанными выше методами, так и эффективность образования триплетов ф , измеренную независимым методом. Тогда [c.287]

Тушение флуоресценции при столкновениях приводит к уменьшению выхода флуоресценции, которое следует закону Штерна — Фольмера [уравнение (73)]. Однако точно такая же зависимость получается и в тех случаях, когда тушитель образует с флуоресцентной молекулой нефлуоресцирующий комплекс, но сам по себе не тушит возбужденное состояние не связанной в комплекс молекулы (см. раздел II, Б, 2). Измеряя время жизни испускания, можно сделать выбор между двумя упомянутыми механизмами тушения. В случае тушения при столкновениях время жизни снижается пропорционально интенсивности флуоресценции, а в случае образования комплексов опо не изменяется. Измерения поляризации флуоресценции являются простым косвенным методом определения времени жизни и поэтому позволяют выяснить, какой из двух механизмов тушения имеет место [312]. [c.374]

Совершенно отличный от предыдущих метод измерения времени жизни флуоресценции был предложен Лордом и Рисом [120]. Флуоресценцию возбуждают светом, интенсивность которого модулирована высокой частотой (5—12 Мгц). Из-за конечного времени жизни возбужденного состояния поглощающей молекулы флуоресценция возбужденной молекулы несколько запаздывает, и поэтому возникает сдвиг фаз между модулированной флуоресценцией и модулированным возбуждающим светом. Сдвиг фаз ф можно измерить экспериментально и затем из него вычислить среднее время жизни флуоресценции, связанное с ф соотношением [c.642]

Как видно из табл. 1, измеренное нами время жизни возбужденного синглетного состояния хлорофилла заметно отличается от значений, полученных косвенными методами из поляризации флуоресценции и интеграла полосы поглощения адсорбции. [c.415]

В отсутствие тушителей выход флуоресценции Fq был определен сравнением с родамином В и оказался равным 0,024, так что [по уравнению (8.19)] kilkf = 41. Среднее время жизни (из интегрального коэффициента экстинкции) дает kf = 1,5 X X 10 сек , следовательно, /Сг = /с2+/сз = 6,1-10 сек . Из измерений флуоресценции нельзя определить порознь величины к и кз, по из опытов с применением флеш-метода по квантовой эффективности обесцвечивания в присутствии ионов железа(П) оказалось, что это величины одного порядка. [c.165]

Первый член уравнения (252) соответствует стационарному решению уравнения диффузии [т. е. оно равноценно уравнению (80)]. Второй, или переходный, член имеет малое значение для жидких растворов при комнатной температуре. Дюбуа и Ван Хе-мерт [200] измерили кд%о для нафталина, бензола и 12 алкилбензолов при тушении диацетилом, а затем вычислили то из обычного уравнения диффузии, и из уравнения (252), т. е. включая переходный член. Уравнение (252) дало несколько меньшие значения, согласующиеся со значениями то, полученными на фазовом флуорометре Ивановой и сотр. [201]. Поэтому, используя диацетил и принимая, что тушение лимитируется диффузией, из констант Штерна — Фольмера можно определить время жизни флуоресценции. Этот метод в аппаратурном отношении проще, чем измерения с помощью фазового и импульсного флуоромет-ров . [c.256]

При измерениях быстрой флуоресценции и фосфоресценции в жидких растворах не требуется точно знать скорость поглощения Бозб.уждающего света, если только определение выходов флуоресценции не производится абсолютными методами и не изучаются фотохимические изменения. Однако интенсивность некоторых типов замедленной флуоресценции пропорциональна квадрату скорости поглощения света (т. е. квантовый выход пропорционален первой степени скорости поглощения света). Кажущиеся выходы быстрой флуоресценции и фосфоресценции также могут зависеть от интенсивности в твердых средах при низкой температуре, где времена жизни триплетов велики и большая доля растворенного вещества может находиться во время облучения в триплетном состоянии. Для проведения количественных исследований в таких системах необходимо точно измерить скорость поглощения света растворенным веществом. Для этой цели возбуждающий свет фокусируется на отверстие подходящей формы и размеров так, чтобы отверстие равномерно освещалось светом. Четкое изображение отверстия фокусируется затем на ту часть образца, где наблюдается люминесценция. Затем с помощью ферриоксалатного актинометра измеряется общий поток возбуждающего света, проходящий через отверстие. Измеряют площадь изображения отверстия и вычисляют интенсивность освещения образца (эйнштейн/см ). Зная эту величину и измерив оптическую плотность на 1 см при нужной длине волны, определяют скорость поглощения света. Необходимо учитывать эффект внутреннего фильтра, используя фактор (см. раз- [c.267]

Следует также упомянуть, что времена жизни во всем указанном выше интервале можно измерить с помощью импульсного возбуждения способом, описанным для измерения времени жизни быстрой флуоресценции (раздел III, М). Этот метод имеет то преимущество, что можно измерять времена жизни много меньше 0,1 мс (с удачно подобранной импульсной лампой) и интенсивность в большом промежутке времени после вспышки. Впервые этот метод был использован в работе Бекстрёма и Сан- [c.268]

Если затухание не чисто экспоненциальное (например, в случае каскадных переходов или флуоресценции с нескольких уровней, которые имеют различные времена жизни, не слнилком отличающиеся друг от друга), для выделения различных вкладов в сигнал полной флуоресценции измерения необходимо проводить на различных частотах модуляции. Если модуляция интенсивности возбуждающего излучения не строго синусоидальная, то следует выполнить фурье-анализ сигнала флуоресценции или с помощью вычислительных машин, или посредством электронной фильтрации первой гармоники в измерительной системе. Недостатком метода фазового сдвига, особенно в связи с высокой интенс1шностью излучения лазеров, используемых в качестве источников возбуждения, является возмущение молекул лазерным полем, что может влиять на фазовый сдвиг вынужденного испускания и давать ложное время жизни спонтанного испускания [190]. [c.294]

Для измерений скорости затухания флуоресценции требуются иные методы вследствие значительно более короткого времени жизни. Предельное разрешение по времени, возможное с помощью механических фосфороскопов, ограничено примерно 10 сек при максимально достижимой скорости порядка 10 ООО о51мин. Измерение более короткого времени требует применения безынерционных затворов, основанных на использовании различных электрооптических и магнитооптических эффектов. Наилучшим известным прибором является, по-видимому, ячейка Керра с нитробензолом время срабатывания составляет примерно 10 сек. Для работы этого устройства требуется подать электрический импульс напряжением в несколько тысяч вольт. Затвор другого типа основан на создании в кювете, наполненной водой, ультразвуковой стоячей волны. Чередующиеся области высокой и низкой плотности действуют в совокупности подобно быстро перемещающейся дифракционной решетке, модулируя таким образом падающий световой пучо . В этом методе обычно используют фазочувствительный детектор, а время жизни определяют по сдвигу фазы между синусоидально модулированным возбуждающим светом и периодически изменяющейся флуоресценцией. Более подробные сведения даны в обзоре Вотерспуна и Остера [35]. [c.90]

Несмотря на большое значение, которое представляет знание длительности возбужденного светом состояния молекулы хлорофилла для изучения первичных фотохимических процессов при фотосинтезе, до настояш его времени не было проведено измерений этого времени наиболее надежными прямыми методами [1]. Время жизни х возбужденных молекул хлорофилла было оценено Перреном [2] и Ступпом и Куном [3] с помоп1 ью измерений относительной степени поляризации флуоресценции в растворителях различной вязкости. Полученные значения (3-10 и 1.5 X Х10 сек.), деленные на известный квантовый выход (приблизительно 0.25) позволяют оценить верхний предел естественного времени жизни 0 хлорофилла в растворах. Это последнее может [c.414]

Из всех экспериментальных фотолюминесцентных методов наиболее широко применяется измерение быстрой флуоресценции в жидком растворе при комнатной температуре. Этот метод является простым и быстрым, а имеющееся в настоящее время оборудование обеспечивает высокую эффективность и чувствительность во всех областях спектра. Если бы удалось создать источник света, дающий достаточно интенсивный непрерывный спектр ниже 250 нм, то в этой спектральной области можно было измерять спектры возбуждения очень разбавленных растворов. Определенные преимущества измерения флуоресценции и фосфоресценции при низкой температуре находят все более широкое признание, и в ближайшие годы область применения таких измерений должна расшириться. Долгоживущая люминесценция в жидком растворе пока еще применяется редко, и анализ следовых количеств по сенсибилизованной замедленной флуоресценции при концентрациях, которые низки, но достаточны для тушения долгоживущих триплетных молекул, имеет большие перспективы. Улучшение временного разрешения фосфориметра или усовершенствование другого простого оборудования для разрешения люминесценции с временем жизни 10 —10 с должно обеспечить дополнительные возможности, например, для использования аннигиляционной замедленной флуоресценции относительно короткоживущих триплетов. [c.476]

Перед тем как изложить результаты экспериментальных работ в области флуоресценции солей уранила, по-видимому, целесообразно дать краткие замечания относительно методика измерения интенсивности медленно затухающей флуоресценции (наиболее известным лрнмером этого процесса является флуоресценция солей уранила). В случае работы с красителями или другими органическими соединениями, флуоресценция которых прекращается почти одновременно (точнее, через 10 сек) с прекращением освещения, интенсивность флуоресценции обычно измеряют при постоянном освещении. Чтобы определить выход, количество световой энергии (или число квантов), испускаемой в секунду в установившемся состоянии, сравнивают с количеством световой энергии (или числом квантов), поглощенной за тот же период времени. С другой стороны, в опытах по медленно затухающей флуоресценции или фосфоресценции (различие между этими двумя явлениями см. ниже, на стр. 184) излучение часто возбуждают вспышкой, и мгновенную интенсивность излучения измеряют по истечении различных промежутков времени, прошедшего после вспышки, после чего проводят графическое интегрирование. Кроме того, полную энергию, выделившуюся после одной вспышки, можно опреде лить с помощью того или иного интегрирующего приспособления. В этом случае выход флуоресценции часто выражается как отношение полной световой энергии, выделившейся после вспышки, к количеству световой энергии, поглощенному при вспышке. Насколько выход, определенный этим методом, идентичен (или почти идентичен) выходу при постоянном освещении, зависит от длительности вспышки tf по сравнению с действительным, а не естественным временем жизни возбужденного состояния т. Если продолжительность вспышки велика по сравнению с указанным временем жизни типичных флуоресцирующих красителей (т <10 сек, в то время как вспышка может [c.177]