Ультрацентрифугирование ячейки

Оценка чистоты. — Шведские химики Сведберг и Тизелиус внесли большой вклад в развитие химии белка разработкой аналитических методов, чрезвычайно удобных для характеристики этих, высокомолекулярных соединений. Метод ультрацентрифугирования Сведберга служит для определения молекулярного веса. При вращении с очень большой скоростью ячейки, содержащей раствор белка, молекулы белка под действием центробежных сил движутся от центра со-скоростью, зависящей от величины молекулярного веса. Специальная оптическая система дает возможность наблюдать и фотографировать ячейку во время центрифугирования. Молекулярный вес может быть, найден либо из определения седиментационного равновесия, либо по-скорости седиментации- Хотя теоретически первый метод точнее, для достижения равновесия требуется длительное время, и поэтому более точные значения получают, исходя из определения скорости седиментации. При применении ультрацентрифуги можно установить также гомогенность молекул (по величине и форме). Тизелиус предложил (1937) электрофоретический метод разделения молекул белка в электрическом поле молекула белка движется со скоростью, определяющейся величиной молекулы, ее формой, количеством и типом ионизированных групп. Материал, кажущийся гомогенным по растворимости, может содержать компоненты, отличающиеся по электрофоретической подвижности. Жестким критерием чистоты является профиль кривой распределения, получаемой при противоточном распределении молекул (Крейг, см. 31.29). [c.674]

В эмульсиях, подвергнутых ультрацентрифугированию, существует аналогичная ситуация, но полиэдрические газовые ячейки замещены здесь искаженными шариками масла, а водные пленки, разделяющие их, более тонки в верхнем слое эмульсии. [c.131]

При ультрацентрифугировании достаточно концентрированного раствора соли малого молекулярного веса возникает градиент плотности, причем у дна ячейки плотность раствора оказывается наибольшей. Исследуемое вещество, подвергнутое ультрацентрифугированию в таком растворе, образует слой, положение которого определяется плотностью этого вещества. Концентрацию и тип соли можно подобрать так, чтобы этот слой располагался в средней части ячейки. При исследовании, например, водных растворов ДНК их центрифугируют в градиенте плотности хлористого цезия, взятого в концентрации 7,7 М (на протяжении столба жидкости высотой 1 см плотность СзС меняется от 1,64 до 1,76 г мл). Положение слоя ДНК определяют при этом по поглощению в ультрафиолете. [c.195]

Другой тип седиментационного эксперимента — это зонное ультрацентрифугирование или неравновесное ультрацентрифугирование в градиенте плотности, предложенное для аналитических целей Виноградом с сотр. [45]. Тонкий слой раствора полимера во время разгона ротора наслаивается на более плотный растворитель необходимый для этого вкладыш седиментационной ячейки описан в работе [46], а вопросы седиментации и диффузии макромолекул в зоне рассмотрены, например, в [47]. [c.22]

Интерферограмма Рэлея имеет вид семейства параллельно смещенных кривых. Вертикальное смещение этих кривых пропорционально разнице в коэффициентах преломления, отвечающих двум секторам (раствор и растворитель) интерференционной ячейки. Число смещенных полос определяется уравнением (П1.4). Соответствующее изменение концентрации описывается уравнением (III. 1). Впрочем, обычно нет необходимости пользоваться этими уравнениями, поскольку седиментационные данные можно представлять прямо в виде числа смещенных полос или даже при помощи непосредственных измерений расстояний на фотопластинке. Это упрощение оправдано в случае равновесного ультрацентрифугирования, так как для расчетов по уравнению (VI. 2) необходимо знать лишь разность логарифмов концентраций. Несложный анализ покажет читателю, что коэффициент пропорциональности, связывающий концентрацию со смещением полос, не влияет на наклон графика зависимости In с от х , а лишь вызывает ее смещение. На фиг. 22 приведены обычно встречающиеся типы интерферограмм Рэлея. [c.102]

При равновесном ультрацентрифугировании с использованием двухсекторной ячейки для образования границы седиментации обычно уровень растворителя в одном секторе устанавливают чуть-чуть выше уровня раствора в другом секторе. Простые соли при этом распределяются в центробежном поле практически одинаково в обоих секторах, никак не отражаясь на седиментационной диаграмме, так что оптика Рэлея регистрирует только распределение концентрации исследуемого вещества. На фиг. 23 показаны фотографии седиментационных диаграмм, отвечающие схемам, приведенным на фиг. 22. Фотография, приведенная на фиг. 23, Л (результаты опыта с ячейкой для искусственного образования границы), сделана через некоторое время после наслаивания, чтобы были яснее видны интерференционные полосы в области границы. На фотографиях, сделанных сразу после ее образования, полосы были бы расположены очень тесно. В дальнейшем они расходятся за счет диффузии.) [c.104]

При анализе данных ультрацентрифугирования рекомендуется произвести проверочный расчет, с тем чтобы установить, согласуются ли измерения преломления с величинами, полученными для исследуемого раствора перед центрифугированием. Отсутствие корреляции может быть связано, например, с потерей материала за счет агрегации и выпадения его на дно ячейки. В этом случае наблюдаемая картина отвечает лишь некоторой доле помещенного в ячейку материала. [c.152]

Сь - - концентрация макромолекулярного компонента у дна ячейки для ультрацентрифугирования [c.37]

Ст — концентрация макромолекулярного компонента у мениска в ячейке для ультрацентрифугирования с,, , с,. , с- — концентрации в ячейке ультрацентрифугирования для [c.37]

Со — начальная концентрация макромолекулярного компонента в ячейке для ультрацентрифугирования [c.37]

Секториальная форма, изображенная на рис. 11.4, Б, позволяет использовать седиментацию для количественных измерений, хотя, как мы скоро увидим, значительно усложняет математическую обработку эксперимента. Ячейками для исследуемого вещества при препаративном ультрацентрифугировании по традиции служат цилиндрические пробирки отнюдь не секториальной формы. Поэтому некоторое количество молекул растворенного вещества теряется на стенках пробирок — эффект, который необходимо учитывать при [c.226]

РИС. 11.4. Схема переноса растворенного вещества в ячейках различной конфигурации при ультрацентрифугировании Показана проекция ячеек на плоскость, перпендикулярную оси вращения. А. В прямоугольной ячейке происходит соударение растворенного вещества со стенками. Такая ячейка эквивалентна цилиндрическим пробиркам, используемым в препаративных ультрацентрифугах. Б. В секториальной ячейке, используемой в аналитических ультрацентрифугах, растворенное вещество движется, не встречая препятствий, вдоль радиусов. В. В ячейке, боковые стенки которой расходятся быстрее, чем у секториальной ячейки, растворитель ударяется в стенки, отбрасывая при этом от стенок растворенное вещество. [c.227]

РИС. 11.5. Схема типичной секториальной ячейки вля ультрацентрифугирования, х — расстояние от оси вращения л- — положение мениска (в действительности соответствует верхней границе раствора, а не реальному физическому верху полости ячейки) — одно ячейки. Ось вращения проходит через л- = 0. При выводе уравнения Ламма [уравнение (11.7)) рассматривается перенос массы в зоне между х ах + с1х. [c.228]

Исследуемый раствор белка помещают в небольшую прозрачную для световых лучей ячейку, которую вставляют в специальное гнездо ротора. Молекулы белка в этой ячейке под действием центробежной силы, развиваемой при вращении ротора, постепенно оседают на дно. Фотоприставка к ультрацентрифуге позволяет делать снимки содержимого ячейки через определенные промежутки времени и определять таким образом скорость оседания белковых частиц. Определение молекулярной массы белка методом ультрацентрифугирования ведут двумя способами по скорости седиментации белковых молекул и по седиментационному равновесию. [c.36]

В предыдущих разделах речь шла о методиках центрифугирования, в которых начальный раствор содержал макромолекулы с однородным распределением по ячейке, а вся информация получалась из наблюдения продвижения границ молекул при их седиментации в центрифужной пробирке. Хотя этот метод имеет множество достоинств и идеален для аналитического ультрацентрифугирования, неудобство его состоит в том, что молекулы с различными значениями 5 никогда не отделяются одна от другой, поскольку быстро осаждаемые молекулы движутся через раствор [c.306]

Основы теории скорости седиментации 276 Оборудование для ультрацентрифугирования 277 Распределение концентрации в эксперименте по скоростной седиментации в секторной ячейке 283 Измерение распределения концентрации в аналитической ячейке 286 [c.577]

Волд и Грут (1964) показали аналогию между устойчивостью эмульсий к ультрацентрифугированию и стабильностью пен. В пенах тонкие пленки водной фазы разделяют полиэдрические газовые ячейки. Чем тоньше пленка, тем больше вероятность того, что газовые ячейки будут разрушаться. Поэтому верхние спои пен менее стабильны вследствие вытекания жидкости. [c.131]

Из-за гидродинамических взаимодейстий, носящих в замкнутом сосуде (ячейке для ультрацентрифугирования) довольно специфический характер, s зависит от концентрации и не может служить однозначной характеристикой размеров и формы молекул. Значение s, экстраполированное к бесконечному разбавлению, обычно называют константой седиментации и обозначают So. [c.423]

Ультрацентрифугирование протеинов. Определить профиль концентраций в установившемся состоянии, когда па типичный раствор альбулшна накладывается центробежное поле с силой в 50 ООО раз больше силы тяжести. Исходные данные длина ячейки — 1 см молекулярный вес альбумина — 45 000 кажущаяся плотность альбумина в растворе — ЛГд/У = 1,34 г/см мольная доля альбумина = 5 10 в при z = 0 кажущаяся плотность воды в растворе — 1 г/см температура — 23,9 °С. [c.514]

При описанном выше ультрацентрифугировании пики, наблюдаемые при помощи шлирен-системы, отвечают границам между раствором и растворителем. Первые, быстрые пики отвечают компонентам, движущимся в окружении более медленных компонентов (фиг. 8). В биохимических смесях некоторые из этих медленных компонентов (например, рибосомы при анализе бактериального экстракта) создают большую вязкость. Измеряемые коэффициенты седиментации могут при этом очень сильно отличаться от приведенного к стандартным условиям значения Поэтому полученные при помощи скоростной седиментации значения s не всегда можно непосредственно использовать при планировании и анализе данных препаративного зонального центрифугирования в градиентах плотности. При зональном ультрацентрифугировании анализируемая смесь наносится в виде слоя на раствор с увеличивающейся по направлению ко дну плотностью (что предотвращает конвекционное перемешивание) и различные компоненты седиментируют в градиенте плотности в виде отдельных зон. Для наслоения смеси можно использовать специальную аналитическую ячейку, в которой техника наслоения принципиально не отличается от обычного препаративного наслоения на градиент. Одна из таких ячеек (Be kman Instruments In .) приведена на фиг. 15. Преимущества применения такой ячейки, как отмечают Виноград и Брунер [11], состоят в том, что она требует меньше исследуемого материала, анализируемые компоненты в ней пространственно разобщены, медленные примеси отстают от быстрее движущихся зон и седиментацию последних можно осуществлять в любом растворителе, не прибегая к предварительному диализу. Растворитель должен быть более плотным по сравнению с [c.67]

Уравнение непрерывности называют также уравнением Ламма [1], или основным уравнением ультрацентрифугирования. В теории седиментации оно занимает центральное положение, так как это уравнение связывает изменения концентрации раствора во времени с величинами 5, й и со. Кроме того, и в этом уравнении учитываются также секториальная форма полости ячейки, цилиндрическая симметрия границ седиментации и негомогенность центробежного поля, т. е. его линейное возрастание с расстоянием х. Из уравнения Ламма вытекает закон радиального разбавления, с помощью которого можно рассчитать поправку, вносимую в значение площади под щлирен-пиком для приведения к истинной концентрации. Из уравнения Ламма можно вывести также равенства, содержащие молекулярную массу растворенного вещества. [c.85]

Этот метод, описанный Ла Баром [12], состоит в том, что в конце равновесного ультрацентрифугирования при малой скорости (без отрыва от мениска) на короткое время скорость вращения увеличивают, что приводит к уходу вещества из области мениска. Определение начала отсчета концентрации для концентрационной кривой на диаграмме Рэлея (в действительности кривой изменения коэффициента преломления) для низкоскоростных методов является проблемой, поскольку в этом случае на интерферограмме отсутствует область с нулевой концентрацией. Ла Бар показал, что вертикальное смещение вниз полос в области мениска за счет кратковременного вращения при большой скорости может дать недостающую информацию либо непосредственно, либо после расчета. На первый взгляд может показаться, что мы не получаем ничего нового по сравнению с методом Ифантиса (снижением концентрации вещества у мениска до нуля) [9], однако подход Ла Бара оправдан тем, что метод Ифантиса не позволяет использовать данные, относящиеся к области дна ячейки, где интерференционные полосы проходят очень круто, тогда как по Ла Бару для вычисления величины М , можно использовать интерферограмму, соответствующую любой точке раствора. Для систем, в которых происходит ассоциация частиц, этот метод также более приемлем. Высокоскоростная часть опыта кратковременна, так что эффект увеличения крутизны полос около дна ячейки несуществен до тех пор, пока это не мешает измерению их смещения. [c.114]

Чтобы уменьшить время работы ультрацентрифуги, Ифантис [41] предложил использовать ячейку с 6 отдельными камерами, что дает возможность работать сразу с тремя концентрациями образца. Эти ячейки теперь имеются в продаже, однако работать с ними труднее, чем с обычными ячейками. В статьях Ифантиса можно найти подробное описание методики работы и изложение теоретических основ данной модификации метода равновесного ультрацентрифугирования. [c.265]

При аналитическом ультрацентрифугировании за движением молекул растворенного вещества следят непосредственно во время вращения ротора с находящимся в нем небольшим количеством исследуемого материала (0,1—1 мл). Это обеспечивается оптическими системами, в которых свет проходит через ячейку с веществом параллельно оси вращения. Оптическая система может представлять собой абсорбционную систему, интерференционную систему Рэлея или шлирен-систему — те же три системы, которые упоминались ранее в разделах, посвященных диффузии. [c.226]

Чтобы преодолеть эту трудность, необходимо создать градиент плотности. Это можно осуществить и в умеренно разбавленных солевых растворах, применяемых в аналитическом ультрацентрифугировании, если исследуемый материал первоначально находится в более разбавленном растворе. Когда слой с исследуемым материалом нанесен на поверхность основного объема растворителя, из-за быстрой диффузии малых молекул образуется пологий градиент плотности (рис. 11.16, Б). Перепад плотности от мениска до дна ячейки может составлять всего так что это почти не влияет на скорости седиментации. При центрифугировании градиент остается стабильным (и даже увеличивается), поскольку молекулы соли имеют ббльшую, чем у воды, плотность. Большие силы в ультрацентрифуге могут влиять даже на небольшие ионы. Однако градиенты в разбавленных солевых растворах недостаточно стабильны вне центрифуги. Бели вы захотели бы извлечь очищенный материал соответствующей зоны, вам пришлось бы отсасывать его, пока ротор еще крутится. Это возможно, но в большинстве случаев существует более простое решение. [c.250]

В дальнейшем САФ стали проводить в ячейках, разработанных для полосового аналитического ультрацентрифугирования [4, 6] в ультрацентрифугах с фотоэлектрической абсорбционной сканирующей системой [2]. Эти ячейки позволили уменьшить необходимое количество фермента до долей микрограмма, а сканирующая система существенно упрощает обработку седиментаци-онных диаграмм. [c.176]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология