Седиментационное равновесие молекулярная масса, определени

Чем объяснить различия в значениях средних молекулярных масс, определенных диффузионным методом и методом седиментационного равновесия [c.74]

Описанный выше способ разделения высокомолекулярных соединений и определения их молекулярных масс называется методом скорости седиментации, так как в его основе лежит различие скорости движения частиц, которая определяется массой частиц. Наряду с этим существует другой способ разделения с помощью ультрацентрифугирования, называемый методом седиментационного равновесия основанный на различии в распределении частиц с разной массой в поле тяжести или в центробежном поле в условиях равновесия. [c.335]

При определении молекулярной массы по методу седиментационного равновесия знание коэффициента диффузии не является необходимым. В этом случае используют более низкое число оборотов. По сравнению с предыдущим методом, для которого необходимо гравитационное поле до 400 ООО g, здесь достаточно центробежной силы, в 10 — 15 тыс. раз превосходящей земное притяжение. Через несколько часов или через несколько суток процесс седиментации и обратной диффузии достигает состояния равновесия, при котором перемещение частиц отсутствует. Измерив градиент концентрации белка от мениска до дна ячейки, можно вычислить его молекулярную массу. Медленное установление равновесия — недостаток метода. Этого можно избежать при проведении определения по Арчибальду. В этом низкоскоростном методе для расчетов можно использовать градиент концентрации, образующийся в измерительной ячейке у мениска жидкости (до отделения белковой зоны). Метод нулевой концентрации в мениске, предложенный в 1964 г., делает возможным достижение седиментационного равновесия при высокой скорости ротора (высокоскоростной метод), в этом случае белковая зона уже отделена от мениска. Это дает возможность сократить время эксперимента до 2 — 4 ч. [c.361]

При ультрацентрифугировании раствор исследуемого полимера помещают в кювету, закрепленную во вращающемся роторе. В зависимости от применяемого метода можно получить либо среднемассовое значение молекулярной массы (метод определения скорости седиментации при больших частотах вращения - метод скоростной седиментации), либо средневзвешенное значение (метод седиментационного равновесия, осуществляемый при меньших частотах вращения). Результаты измерения получают в виде кривых распределения по константам седиментации, по которым рассчитывают молекулярную массу. [c.176]

Существует несколько физических методов абсолютного измерения молекулярных масс, в первую очередь основанных на использовании седиментации или рэлеевского рассеяния света. Они требуют существенно большего количества индивидуального биополимера, чем описанные химические и биохимические методы, проводятся путем прецизионных измерений на дорогостоящем оборудовании и применительно к задаче измерения молекулярных масс белков и нуклеиновых кислот постепенно утрачивают свое значение. Седиментационные методы основаны на использовании уравнений (7.2) или (7.3). В первом случае измерению подлежат константа седиментации биополимера и коэффициент диффузии. Во втором случае нужно достичь состояния седиментационного равновесия и измерить распределение концентрации исследуемого биополимера вдоль центрифужной ячейки, т.е. концентрацию биополимера на нескольких разных расстояниях г от оси ротора. Оба метода требуют определения парциального удельного объема, или, что то же самое, плавучей плотности биополимера в условиях, используемых для седиментации. [c.267]

Методы седиментационного равновесия и приближения к нему являются абсолютными методами определения молекулярной массы [93, 94]. Под действием сил тяготения Земли обычно не наблюдается оседание (всплывание) макромолекул с М 10 , так как силы притяжения к Земле значительно меньше сил, действующих на них со стороны растворителя. Поэтому в результате теплового движения макромолекулы равномерно распределены по всему объему. Для того чтобы макромолекулы с первоначальным равновесным распределением переходили к новому распределению, создают сильное центробежное поле с помощью ультрацентрифуг различных конструкций. [c.137]

Несмотря на принципиальную возможность определения молекулярных масс с помощью седиментационного равновесия, этот метод не получил широкого распространения, так как для проведения эксперимента требовалось сравнительно большое количество времени. Арчибальд [114] предложил другой метод (метод приближения к равновесию) для определения молекулярной массы, который не требует установления седиментационного равновесия во всей кювете. [c.147]

Метод седиментационного равновесия — наиболее точный метод определения среднемассовой молекулярной массы. [c.65]

Во-вторых, с помощью физико-химических методов, применимых. к белковым растворам, можно установить молекулярный вес. Он может быть определен несколькими различными приемами, при условии, если материал монодисперсен. К таким приемам относятся методы измерения осмотического давления, светорассеяния, седиментационного равновесия и измерения скорости седиментации и диффузии. Все эти приемы основаны на различных принципах и часто дают не вполне совпадающие результаты. Это объясняется тем, что получаемые данные зависят не только от размеров и массы, но и от. электрического заряда, формы и степени гидратации белковых молекул. При измерении скорости движения частиц (например, скорости диффузии или скорости седиментации) хорошие результаты получаются только для тех молекул, форма которых близка к шарообразной, ибо они ведут себя в соответствии с изученными закономерностями. Отклонение от сферической формы (фибриллярные белки) и гидратация молекул приводят к различным ошибкам, так как движение молекул замедляется в результате увеличения коэффициента трения или эффективного размера частиц. [c.128]

Аналитическое ультрацентрифугирование полимеров [1, 2, 4, 12] включает в себя три следующих экспериментальных метода скоростную седиментацию, изучение седиментационного равновесия и процесса приближения к нему. Скоростная седиментация позволяет определить константу седиментации и полидисперсность образца. Седиментация макромолекул в зоне (зонное ультрацентрифугирование) — ценный метод обнаружения гетерогенности высокомолекулярного образца. Метод приближения к равновесию позволяет рассчитать молекулярную массу М и получить сведения о неоднородности полимера, а изучение седиментационного равновесия (состояния, достигаемого транспортным переносом макромолекул, хотя сам метод и не является истинно транспортным) — молекулярную массу (надежнее, но с большей затратой времени, чем в предыдущем методе) различных типов усреднения. Метод центрифугирования в градиенте плотности заключается в исследовании седиментации, состояния равновесия и приближения к нему в условиях искусственно создаваемого в кювете градиента плотности это — широко используемый метод определения молекулярной массы, наличия неоднородности и ее типа, служащий и для препаративных разделительных целей. [c.14]

Существует и другой метод определения молекулярной массы — метод седиментационного равновесия. При [c.19]

Подставив уравнение (У.9) в уравнение Сведберга (I. 11), получим одну из форм уравнения для определения молекулярной массы методом седиментационного равновесия [c.89]

Седиментация макромолекул (ультрацентрифугирование). Константа седиментации. Седиментационное равновесие. Определение молекулярных масс методами ультрацентрифугирования. [c.382]

Исследуемый раствор белка помещают в небольшую прозрачную для световых лучей ячейку, которую вставляют в специальное гнездо ротора. Молекулы белка в этой ячейке под действием центробежной силы, развиваемой при вращении ротора, постепенно оседают на дно. Фотоприставка к ультрацентрифуге позволяет делать снимки содержимого ячейки через определенные промежутки времени и определять таким образом скорость оседания белковых частиц. Определение молекулярной массы белка методом ультрацентрифугирования ведут двумя способами по скорости седиментации белковых молекул и по седиментационному равновесию. [c.36]

Во втором случае измеряют концентрацию белка С1 и Сг в двух точках ячейки на расстоянии Ху и Х2 от центра ротора в тот момент, когда после определенного срока работы ультрацентрифуги в ячейке установится седиментационное равновесие, т. е. равенство между числом оседающих и диффундирующих в обратном направлении молекул белка. Расчет молекулярной массы белка ведут по формуле, вводя в нее экспериментально найденные значения Сг, и Хг [c.36]

Теория седиментационного равновесия в градиенте плотности усложняется тем, что 1) для создания градиента обычно применяют очень высокую концентрацию соли (5—7 М), что не позволяет рассматривать систему как двухкомпонентную, 2) положительно и отрицательно заряженные ионы соли распределяются в объеме неодинаково, так как они обладают разными молекулярными массами и коэффициентами диффузии, а это приводит к созданию градиента электрического потенциала, и 3) скорости центрифугирования настолько высоки, что уже нельзя пренебрегать влиянием давления. По этой причине данный метод обычно не используется для определения молекулярных масс, однако, так как его можно применять, если данные обрабатываются соответствующим образом, приведем краткое его описание. [c.331]

Оценка значения V важна при определении молекулярной массы и коэффициента седиментации. Более того, требуется высокая точность измерения у, так как диапазон значений V для биологических макромолекул (0,6—0,75) приводит к тому, что ошибка в 1% при измерении V дает ошибку около 3% в значениях М или 5 20,в- В действительности измерение V часто бывает лимитирующим фактором при определении молекулярной массы. Существует три основных метода определения д суммирование и мономерных остатков макромолекулы, использование методов измерения плотности и параллельные измерения седиментационного равновесия в изотопно меченных растворителях. [c.350]

Измерение молекулярной массы методом седиментацион ного равновесия 326 Определение молекулярной массы методом приближения к равновесию (метод Арчибальда) 328 Седиментационное равновесие в градиенте плотности 329 Измерение молекулярной массы методом седиментационного равновесия в градиенте плотности 331 Определение плотности путем седиментации в градиенте плот-ности 332 Приложение 344 [c.578]

На левой ординате отложены средневесовые значения молекулярных масс, определенные методом седиментационного равновесия, на правой ординате— коэффициенты седиментации в единицах Сведберга. Масштаб справа выбран так. что коэффициент седиментации 4, 6, 5 отвечает молекулярной массе 64 ООО. [c.224]

Средняя молекулярная масса нефракционированного полимера зависит от метода ее определения. Например, осмометрией находят среднечисловое значение, а по светорассеянию — среднемассовое. При описании молекулярно-кинетических свойств приводились некоторые методы определения молекулярных масс осмометрия, седиментация и седиментационное равновесие в центробежном поле. В дополнение к ним применяется также вискозиметрнческий метод. [c.212]

При определении молекулярных масс в ультрацентрифуге [67 — 69 различают метод измерения скорости седиментации и оавновесное центрифугирование. В то время как в первом случае измеряют скорость седиментации, во втором — определяют положение седиментационного равновесия. [c.360]

Определение молекулярной массы и размеров макромолекул. Метод С. позволяет определить мол. массу несколькими способами сочетанием С. и диффузии [с использованием первой ф-лы Сведберга (4)], методами седиментационного равновесия [ф-ла (10)] и приближения к равновесию [метод Арчибальда, ф-ла (15)]. Поскольку молярный коэфф. трения / можно выразить через [т)], мол. массу гидродинамически непротекаемых макромолекул Л/sT) можно определить по значениям [5] и [т]] по ур-нию [c.201]

Метод приближения к седиментаци онному равновесию. Этот метод является как бы промежуточным между двумя предыдущими. Очень длительная процедура достижения седиментационного равновесия здесь сокращена применением несколько больших скоростей центрифуги (что сближает его с методом седиментации). При этом не происходит седиментации, не устанавливается и седиментационное равновесие. Повторные определения концентрации позволяют путем экстраполяции вычислить молекулярную массу полимера. [c.65]

Дифференциальное уравнение Сведберга распределения концентрации при седиментационном равновесии (1.18), справедливое для любых X, в сечениях мениска и дна кюветы выполняется также и при приближении к состоянию равновесия и широко используется для определения молекулярной массы методом неустановившегося равновесия (методом Арчибальда, [57]). Практически в некоторые моменты времени фиксируют концентрацию С и ее градиент d lax в точках мениска или дна кюветы (см. рис. 1.4, б). Точность определения величины [c.28]

Для определения среднечисловой молекулярной массы Л1 применяют методы, пользуясь которыми можно измерить коллигатииные (зависящие от числа частиц) свойства растворов— оомометрию, эбуллиоскопию, криоскопию, изотермическую перегонку, измерение тепловых эффектов конденсации, количественное определение концевых групп. Величины среднемассовой молекулярной массы М можно определить методами светорассеяния и приближения к седиментацион-ному равновесию (ультрацентрифугальный метод). [c.14]

Ультрацентрифугу (фиг. 2, А и 3,Л) хорошо знают во многих лабораториях мира, и большнство седиментационных диаграмм, публикуемых в научных журналах, получено с помощью именно этой ультрацентрифуги. Ее ротор подвешен на гибкой струне, и для уравновешивания ячеек достаточна точность 0,1 г. Ротор находится в вакуумной камере и приводится во вращение электромотором через редуктор с передаточным числом 1 или 6,3. Скорость вращения вала привода сравнивается со скоростью вращения вала, приводимого в движение синхронным мотором коробки передач, что позволяет выбирать различные скорости вращения ротора. В последнее время применяется более точный электронный контроль скорости, особенно важный при малых скоростях, необходимых для определения молекулярных масс методом седиментационного равновесия. [c.26]

В настоящее время отдают предпочтение двухлучевой системе, хотя она очень дорога. В этом случае в нижней части ультрацентрифуги Be kman размещается монохроматор. Система фотоэлектрического сканирования, работающая на принципе раздвоенного луча, позволяет сравнивать раствор исследуемого вещества и чистый растворитель, находящиеся в разных секторах двухсекторной ячейки (фиг. 12 и 16). Такая ячейка аналогична двум кюветам (образец и контроль), используемым в обычной спектроскопии. Перед каждым сканированием регистрируются калибровочные сигналы, охватывающие диапазон оптических плотностей от О до 1 или от О до 2. Сканирование можно проводить с тремя различными скоростями, а поглощение, отвечающее растворителю, автоматически вычитается из показаний для раствора. Эта система позволяет также получить производную от кривой изменения концентрации. Сканирующую систему можно использовать для определения молекулярной массы методом седиментационного равновесия с хорошей точностью при малых концентрациях, что особенно важно для получения экстраполированных к нулевой концентрации идеальных значений. [c.42]

Кональбумин и лактоферрин изучены в меньшей степени, чем трансферрин. Наиболее точная оценка молекулярной массы кональбумина, определенная по его способности связывать железо, дала значение около 76 000 дальтон [42]. Методом седиментационного равновесия для коровьего лактоферрина получена молекулярная масса 77 100 [29], для лактоферрина человека исследованием связывания железа получено значение 80 000 [43], а методом определения скорости седиментации при ультрацентрифугировании [И] — значения 95 000 [11] и 82 000 [14]. [c.337]

Определение молекулярных масс осмотические методы - теория - среднечисловая молекулярная масса — экспериментальные методы — светорассеяние - средневесовая молекулярная масса — ультрацентрифугирование -кянстанты диффузии - седиментационное равновесие - характеристические вязкости - молекулярно-массовые характеристики - средневязкостная молекулярная масса и полидисперсность - ИК и ЯМР полимеров -гель-фильтрационная хроматография. [c.378]

На практике коэффициенты седиментации можно определить достаточно точно. Определение же коэффициентов диффузии гораздо более трудоемко. Поэтому метод седиментационного равновесия, который не требует определения коэффициента диффузии, намного удобнее и более широко используется для установления молекулярных масс белков. В этом методе ультрацеитрифугирование продолжают до тех пор, пока не будет достигнуто равновесное распределение изучаемого белка по всей длине ячейки. При равновесии не происходит видимого перемещения белка в ячейке, поскольку его движение ко дну ячейки под действием центробежной силы полностью уравновешивается движением вверх, обусловленным диффузией. Такое равновесное распределение характерно для каждого белка и зависит от его молекулярной массы. После дости- [c.129]

Пример 11-3. Измерение изменений величины мутантного фермента. Многие методы, применяемые для определения молекулярных масс ферментов, требуют образцов с высокой степенью очистки (например, метод седиментационного равновесия, который будет описан позже) или при использовании не очень чистых образцов дают массы субъединиц (например, ДСН-гель-электрофорез, гл. 9). Использование зональной седиментации позволяет определить молекулярную массу активного фермента непосредственно в неочищенном лизате при применении в качестве метода контроля анализа ферментативной активности. Например, ДНК-полимераза I Е. oli седиментирует при 5 = 5,4. Зоны полимери-зующей и 5 —З -экзонуклеазной активности, связанные с этим белком, седиментируют вместе, поэтому для локализации фермента в градиенте сахарозы можно использовать любую из них. Мутантная форма фермента не обладает полимеразной активностью, однако сохраняет 5 —З -экзонуклеазную. Как следует из рис. 11-26, мутантный фермент обладает значением s = 2,8. Поскольку данная мутация является терминирующей цепь белка, пониженное значение 5 указывает на то, что данный фермент является лишь небольшим фрагментом белка дикого типа и имеет только 0,4% активности. [c.314]