Рестриктазы одноцепочечные ДНК

Рис. 4.8. Встраивание чужеродной ДНК в плазмидный вектор. Плазмидную ДНК, обработанную рестриктазой и щелочной фосфатазой, смешивают с рестрицированной донорной ДНК, содержащей нужный ген, и добавляют ДНК-лигазу. Два из четырех одноцепочечных разрыва при этом устраняются, и конструкция оказывается стабильной благодаря образовавшимся фосфодиэфирным связям. После введения гибридной ДНК в клетку-хозяина происходит ее репликация и образуются новые кольцевые молекулы уже без разрывов.

Универсальные рестриктазы для одноцепочечных ДНК [c.54]

Рис. 4. Расщепление одноцепочечной ДНК универсальной рестриктазой

Для получения линкеров синтезируют олигомеры, которые представляют собой палиндромные одноцепочечные нуклеотидные последовательности, спаривающиеся (гибридизующиеся) между собой. Линкеры содержат сайты узнавания для рестрицирующих эндонуклеаз, что позволяет осуществлять с их помощью клонирование фрагментов ДНК (рис. 5.8, А и Б). Короткий дуплекс длиной 6-12 пар нуклеотидов лигируют по тупым концам с ДНК-мишенью (обычно кДНК). Разрезают новую молекулу нужной рестрицирующей эндонуклеазой и получают фрагменты с выступающими одноцепочечными концами (липкими концами), с помощью которых встраивают ДНК-мишень в соответствующий вектор. Прежде чем проводить встраивание, рестрицированную смесь фракционируют для отделения ДНК с липкими концами от лишних линкерных молекул. Вектор тоже обрабатывают рестриктазой, отжигают его с фрагментами ДНК с липкими концами и сшивают с помощью ДНК-лигазы фага Т4. ДНК-мишень не должна содержать сайтов рестрикции, присутствующих в линкерной последовательности, в противном случае она также будет расщепляться ферментом. [c.85]

Рис. 9.10. Образование рекомбинантных молекул ДНК. При действии одной рестриктазы на различные молекулы ДНК образуются фрагменты с комплементарными одноцепочечными концами. Соединение таких фрагментов в разных сочетаниях может приводить к образованию рекомбинантных молекул ДНК. Под действием ДНК-лигазы формирование рекомбинантных молекул завершается установлением ковалентных связей.

Гель-электрофорез использовали для изучения нуклеотидной последовательности ДНК генома до тех пор, пока не были открыты рестриктазы. К настоящему времени выделены сотни таких ферментов, каждый из которых узнает специфическую нуклеотидную последовательность длиной от 2 до 8 пар оснований и расщепляет двухцепочечную молекулу ДНК лишь в этом участке [108]. Точки расщепления обеих цепей ДНК могут находиться либо на одинаковом расстоянии от одного из концов молекулы (т. е. располагаться строго напротив друг друга), либо быть смещены относительно друг друга на несколько звеньев. В первом случае образуются фрагменты с тупыми концами, содержащие только спаренные нуклеотидные остатки, а во втором — с липкими , которые представляют собой небольшие участки одноцепочечной ДНК. Используя рестриктазы различной специфичности, можно расщепить высокомолекулярную ДНК на отдельные фрагменты, размеры большинства из которых находятся в диапазоне, приемлемом для разделения этих фрагментов с помощью электрофореза в полиакриламидном или агарозном геле [107]. Таким способом были получены уникальные фрагменты ДНК генома, которые затем были встроены в рекомбинантные ДНК-векторы [109]. Этот раздел посвящен разделению таких фрагментов. [c.184]

Разрезание рестриктазой, после которого остаются липкие концы (короткие одноцепочечные [c.218]

Первым этапом анализа ДНК является экстракция ДНК из любой ткани, содержащей ядерные клетки с последующей ее очисткой. Далее геномную ДНК анализируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или подвергают расщеплению ферментами рестрикции — рестриктаза-ми, распознающими специфические последовательности нуклеотидов и гидролизующими ДНК на ряд фрагментов рестрикции . Последние могут быть разделены методом электрофореза или подвергнуты денатурации нагреванием до однонитевых фрагментов, которые затем переносят на нейлоновый фильтр или нитроцеллюлозную мембрану. Таким образом сохраняется пространственное расположение фрагментов ДНК относительно друг друга. Полученный материал анализируется с помощью ДНК-зонда, представляющего собой фрагмент одноцепочечной ДНК, как правило, помеченный радиоактивным изотопом Р и содержащий специфическую последовательность оснований, комплементарную участку ДНК, который необходимо обнаружить. В качестве зонда можно использовать как нативную ДНК, специфичную гену (геномные зонды), так и синтетическую ДНК, полученную на основе РНК гена (комплементарная ДНК). Если анализируемая последовательность присутствует во фрагментах рестрикции, то зонд гибридизуется с ними, что можно обнаружить с помощью авторадиографии. [c.528]

ДНК используют экзонуклеазную реакцию. После расщепления плазмиды рестриктазой в одной точке ее обрабатывают экзонуклеазой, разрушающей одну из цепей ДНК с ее свободного конца (3 или 5 ). Реакцию можно вести так, чтобы удалить желаемое число нуклеотидов ДНК. Затем нуклеазой S1 удаляют одноцепочечные хвосты и лигируют концы ДНК- [c.69]

Первый этап создания генно-инженерных организмов — выделение и идентификация отдельных генов (соответствующих фрагментов ДНК или РНК), которые собираются перенести другим организмам. Для этого из организмов, обладающих такими генами, с помощью специальных химических методов выделяют нуклеиновые кислоты и разрезают их на отдельные фрагменты, используя наборы ферментов — рестриктаз. Первые рестриктазы выделил в 1970 году Г.Смит (США). Оказалось, что разные рестриктазы способны производить разрывы молекулы ДНК в строго определенных последовательностях нуклеотидов (из 4 — 6 пар). Наибольшее значение имело выделение рестриктаз, которые дают фрагменты с так называемыми липкими (комплементарными) концами. В случае их использования разрывы ДНК происходят в местах, расположенных наискось на концах каждого из полученных фрагментов остаются короткие одноцепочечные хвосты из нескольких нуклеотидов (табл. 2). [c.23]

Небольшие делеции в окрестностях сайтов рестрикции можно получать быстрее удалением липких концов линеаризованной плазмидной ДНК после рестрикции с последующим замыканием линейной ДНК в кольцо лигированием по образовавшимся тупым концам. В этом случае размер делеции соответствует размеру одноцепочечных липких концов в сайтах рестрикции. Кроме того, такой метод допускает простую проверку наличия мутаций в требуемом участке ДНК, так как в результате мутации происходит потеря уникального сайта рестрикции. Для получения вставок коротких или протяженных последовательностей нуклеотидов в исследуемые участки клонируемых генов также разработаны эффективные и надежные методы. В простейшем случае такая задача решается путем расщепления исследуемого гена рестриктазой по уникальному сайту рестрикции и встраивания по этому сайту фрагмента природной ДНК или синтетического двухцепочечного олигонуклеотида, который фланкирован соответствующими липкими концами. Лигирование может проводиться и по тупым концам. В таком случае последовательности нуклеотидов на концах вставки уже не имеют существенного значения для встраивания этого фрагмента по сайту рестрикции. [c.289]

При конструировании клонотеки пептидов прежде всего синтезируют два комплементарных друг другу олигонуклеотида, образующих после отжига двухцепочечную молекулу, центральная часть которой кодирует собственно пептиды (рис. 46, а), а выступающие по концам одноцепочечные участки комплементарны липким концам вектора, получающимся под действием соответствующей рестриктазы (рис. 46, б). [c.340]

Денатурация и ренатурация мини-хромосомы или продуктов ее расщепления рестриктазами вызывают изменение электрофоретической картины, поскольку левая и правая половины одноцепочечных молекул, образовавшихся из центрального фрагмента, комплементарны и, следовательно, могут гибридизоваться сами на себя. Благодаря тому что две комплементарные половины входят в состав одной и той же молекулы, они гибридизуются друг с другом намного быстрее, чем с другими молекулами. Гибридизация сама на себя приводит к тому, что наблюдаемый размер молекулы уменьшается в 2 раза. Таким образом, не разрезанная рестриктазой хромосома после денатурации и ренатурации уменьшается в размере с 21 до 10,5 т. п. н. Аналогичным [c.384]

Плазмиду рестрицируют Ваш HI и образовавшиеся линейные молекулы смешивают с фрагментами чужеродной ДНК, полученными также под действием этой рестриктазы. Одноцепочечные комплементарные концы этих молекул могут соединиться различными способами, прежде чем под действием лигазы возникнут ковалентные связи. Во-первых, концы линейной молекулы ДНК плазмиды могут соединиться друг с другом при этом восстановится исходная кольцевая плазмида с интактным геном tet. Возможно, однако (именно это и требуется), что перед превращением линейной молекулы ДНК плазмиды в кольцевую, между ее концами встроится фрагмент чужеродной ДНК при этом целостность гена tet нарушится. Полученной in vitro смесью молекул ДНК трансформируют клетки Е. соИ, предварительно обработанные ио- [c.278]

Такими комплементарными последовательностями могут быть, в частности, одноцепочечные участки, образующиеся прн расщеплении ДНК какой-либо рестриктазой. На схеме б представлен пример образования лнпких концов при расщеплении ДНК рестриктазой ЕсоК1. Со значительно меньшей скоростью, но все же достаточно эффективно фермент соединяет между собой полностью двуспиральные фрагменты ДНК с З -ОН- и б -РО -груп-пами (схема в). [c.353]

Наиболее распространенный метод состоит в использовании рестриктаз, вносящих ступенчатые разрывы с образованием коротких комплементарных одноцепочечных липких концов. Классический пример такого фермента-рестриктаза ЕсоЫ, разрывающая каждую из цепей двухцепочечной ДНК, но в разных точках. Эти точки располагаются по обе стороны от короткого палиндрома, входящего в состав сайта узнавания фермента. [c.238]

Ферменты рестрикции позволяют вырезать любые произвольные фрагменты ДНК и комбинировать из них in vitro рекомбинантные (или химерные) молекулы. Это оказывается возможно, поскольку многие рестриктазы разрезают двойную спираль так, что место разреза одной цепи сдвинуто относительно второй, в результате чего образовавшиеся фрагменты обладают комплементарными одноцепочечными концами (см. табл. 9.1). Эти концы могут соединяться посредством образования водородных связей между комплементарными основаниями, причем сшиваться таким образом могут различные фрагменты ДНК, как это показано на [c.275]

Первые неожиданности такого рода были выявлены после определения нуклеотидной последовательности генома фага фХ174, генетическая структура которого была рассмотрена в гл. 7. Полная нуклеотидная последовательность одноцепочечной ДНК фХ174, а также соответствующие аминокислотные последовательности кодируемых белков приведены на рис. 12.6. Показаны также сайты узнавания для ряда рестриктаз, использованных при определении последовательности ДНК. В целом наблюдается хорошая корреляция между нуклеотидной последовательностью (рис. 12.6) и генетической картой (рис. 7.5) фага. Однако можно отметить и три случая отклонения от такой корреляции. Во-первых, имеет место расхождение между рекомбинационными частотами и физическими расстояниями, особенно в области гена А. Во-вторых, [c.83]

Для обнаружения таких участков ДНК проводят мягкое разрушение клеток, не сопровождающееся разрушением ядер. Аликвоты ядерной фракции подвергают действию возрастающей дозы нуклеазы типа ДНКазы I, которая вносит одноцепочечные разрывы в двухцепочечную ДНК. После этого из каждой аликвоты выделяют ДНК и подвергают ее расщеплению определенной рестриктазой. Полученные препараты анализируют с помощью электрофореза и гибридизации по Саузерну [c.221]

Щелочные фосфатазы бактерий (ВАР) и кишечника теленка ( IAP) катализируют удаление 5 -фосфатных групп ДНК или РНК, а также расщепление макроэргических связей рибо- и дез-оксирибонуклеозидтрифосфатов. Их используют при подготовке фрагментов нуклеиновых кислот к введению З -концевой радиоактивной метки З2р а также для предотвращения лигирования векторных молекул ДНК самих на себя. Как уже упоминалось выше, ДНК-лигаза способна образовывать фосфодиэфирные связи в одноцепочечных разрывах лишь при наличии в них 5 -концевого фосфата. Удаление 5 -концевых фосфатных групп молекул вектора, линеаризованных с помощью одной рестриктазы во время подготовки его для клонирования соответствующего фрагмента ДНК, предотвращает образование кольцевых молекул вектора (без вставки), а также его олигомеров во время лигирования с клонируемой последовательностью. Необходимые для лигирования со вставкой фосфатные группы содержатся в самих клонируемых фрагментах ДНК, а остающиеся в результате неполного лигирования два одноцепочечных разрыва репарируются in vivo после введения вектора со вставкой в бактериальные клетки. Гены секретируемых щелочных фосфатаз находят применение и в качестве высокочувствительных генов-репортеров при исследовании функционирования регуляторных элементов различных генов в прокариотических и дрожжевых системах экспрессии, а также в клетках млекопитающих [91]. [c.65]

Многие рестрицирующие иуклеазы вносят разрывы в две цепи ДНК со смещением на несколько нуклеотидов, так что на концах фрагментов образуются короткие одноцепочечные участки. Эти одноцепочечные концевые участки обладают способностью образовывать комплементарные пары оснований с любым другим одноцепочечным участком, полученным с помощью того же фермента, и потому их называют липкими концами (рис. 4-63). Липкие концы, образованные рестрикционными ферментами, позволяют легко соединить два любых фрагмента ДНК воедино при условии, что эти фрагменты образовались после действия одной и той же рестрицирующей нуклеазы (рестриктазы) (либо иной нуклеазы, которая создает такие же липкие концы). Таким образом, фрагмент ДНК любого происхождения можно встроить в очищенную ДНК автореплицирующегося генетического элемента, которым, как правило, является плазмида или бактериальный вирус. Бактериальный клон, содержащий такую плазмиду или вирус, можно сравнить с фабрикой по производству этого фрагмента ДНК. Исходный фрагмент может происходить прямо из геномной ДНК, или из к ДНК (комплементарной ДНК), т. е. из ДНК, полученной копированием матричной РНК. Эти методы детально обсуждаются в гл. 5. [c.231]

Методы, используемые нами для синтеза равномерно меченных и меченных по концам одноцепочечных ДНК-зондов, очень похожи. Принцип их проиллюстрирован на рис. 10. Фрагмент ДНК, который предстоит исследовать, клонируется в репликативной форме бактериофага или в плазмидном векторе, продуцирующем одноцепочечные кольцевые молекулы только одной ориентации. Две наиболее распространенные системы такого типа — бактериофаг М13 и плазмиды, несущие точки начала репликации фага М13. Олигонуклеотидный праймер реассоциируют с одноцепочечной кольцевой молекулой так, чтобы он инициировал синтез ДНК на матрице тестируемой вставки в направлении от 5 - к З -концу. Для равномерно меченных зондов один из используемых при синтезе dNTP метится изотопами Р или в альфа-положении. Для зондов с концевой меткой олигонуклеотид метят по 5 -концу [y- PjATP, а для синтеза ДНК используют холодные dNTP. По окончании синтеза ДНК обрабатывается рестриктазой, расщепляющей кольцевую молекулу у конца вставки, противоположном сайту реассоциации с олигонуклеотидным праймером. В результате такой реакции получается линейный фрагмент ДНК, состоящий частично из двухцепочечного и частично из одноцепочечного участков. Денатурируя ДНК и проводя препаративный электрофорез в поли- [c.167]

После того как обработанная рестриктазами ДНК разделена путем электрофореза в агарозном геле, следующий эта заключается в переносе (блоттинге) разделенных фрагментов-ДНК на соответствующий фильтр. Впервые метод блоттинга-описан Саузерном [7]. Незначительно видоизменив сам метод многих лабораториях заменили нитроцеллюлозный фильтр, используемый в оригинальной методике, на более прочные-найлоновые фильтры. Кроме того, что они более прочные, эти-фильтры повышают чувствительность гибридизации и их можно использовать многократно, причем чувствительность пр этом не снижается (см. примечание ж в разд. 5.5.3). В любом случае ДНК необходимо вначале перенести с геля на подложку. Фрагменты ДНК большего размера обычно переносятся неочень эффективно, и в связи с этим ДНК частично апуринизи-руют, обрабатывая кислотой, чтобы раздробить молекулы-ДНК на фрагменты меньших размеров [9]. Затем ДНК в геле-денатурируют in situ, обрабатывая концентрированной щелочью, и перед переносом нейтрализуют, чтобы не повредить, фильтр. В результате этого процесса ДНК становится одноцепочечной. При использовании нитроцеллюлозных, но не найло-новых фильтров это абсолютно необходимо для закрепления ДНК и вне зависимости от типа подложки обеспечивает эффективность гибридизации. С появлением найлоновых подложек изменился и традиционный метод капиллярного переноса, разработанный Саузерном. Данный метод в настоящее время можно заменить электропереносом, который гораздо быстрее капиллярного (1—2 ч по сравнению с 12—16 ч), но приводит к некоторому снижению чувствительности [4]. После переноса ДНК должна быть зафиксирована на фильтре. В оригинальном методе Саузерна это осуществляется путем прогревания нитроцеллюлозного фильтра в течение нескольких часов-при 80°С. Для найлоновых мембран данная процедура заменена ультрафиолетовой сшивкой, что занимает несколько минут. Сшивка ультрафиолетом главным образом приводит к повышению чувствительности найлоновых фильтров, а также повышает-и чувствительность гибридизации на обычной нитроцеллюлозе-[4]. К сожалению, на практике эта стадия вызывает некоторые затруднения, поскольку неизвестно, какая доза ультрафиолетового облучения требуется для каждого из известных в настоящее время типов найлоновых фильтров. В связи с этим в- [c.287]

На основе рестриктаз, узнающих асимметричные последовательности нуклеотидов, разработана система, позволяющая расщеплять молекулы одноцепочечных ДНК (оцДНК) в любой заданной точке. С этой целью синтезируется олигонуклеотид, 5 -концевая часть которого содержит сайт, узнаваемый такой рестриктазой, а последовательность нуклеотидов З -концевой части комплементарна участку ДНК, в который необходимо внести эндонукле- [c.54]

В экспоненциальной фазе реакции (нижняя часть рисунка) рестриктаза BsoBl вносит одноцепочечный разрыв (обозначен треугольником) в верхнюю цепь ДНК, синтез которой был инициирован с праймера S], но не в НИЖНЮЮ цепь, поскольку последняя содержит в сайте рестрикции модифицированный остаток d MP (7) наличие одноцепочечного разрыва позволяет ДНК-полимеразе (обозначена звездочкой) инициировать синтез ДНК в этом месте и построить новую цепь ДНК, вытеснив дочернюю из дуплекса, при этом происходит восстановление немодифицированного сайта рестрикции, который по-прежнему остается измененным в нижней цепи (8-10), что дает возможность образованному дуплексу вступить в новый цикл синтеза ДНК, а вытесненная цепь также используется в качестве матрицы вначале с праймерами В2 и 2, а затем В и S], что обеспечивает экспоненциальный характер амплификации [c.245]

В фазе экспоненциальной амплификации рестриктаза ВзоВ вносит одноцепочечный разрыв в верхнюю цепь ДНК, в которой сайт рестрикции был создан праймером 8] и не содер- [c.246]

Мутагенизируемую ДНК полностью метилируют Ват-метилазой и используют в качестве матрицы в ПЦР с праймерами, содержащими требуемую мутацию (помечена) по завершению ПЦР, в которой образуется неметилиро-ванная ДНК, родительскую ДНК убирают с помош ью рестриктазы (/), а продукт ПЦР очиш ают электрофорезом (2) после фосфорилирования концов ДНК в одноцепочечных разрывах и их лигирования, метилирования (5) и освобождения от неполностью метилированных молекул с помош ью рестриктазы (4) проводят ПЦР с новыми мутагенизирующими праймерами [c.292]

Фермент рестрикции 8аиЗА узнает последовательность —ОАТС— и расщепляет цепь ДНК на 5 -стороне (слева) от О (поскольку верхняя и нижняя цепи большинства сайтов рестрикции читаются одинаково в направлении от 5 - к З -концу, только одна цепь этого сайта может быть показана для иллюстрации). Одноцепочечные концы, возникающие при расщеплении рестриктазой 8аиЗА, идентичны концам, возникающим при расщеплении рестриктазой ВатН1 (рис. 5-38), что позволяет им соединяться при инкубации с ДНК-лигазой. (Полезно нарисовать структуру продукта, образующегося в результате такого сшивания, чтобы убедиться в том, что она правильна.) [c.42]

Из культур, в которых произошло переключение, выделял ДНК, обрабатывали ее рестриктазой, нагревали, чтобы цеш ДНК разделились (плавление), и затем медленно охлаждащ чтобы цепи ДНК опять соединились (гибридизация). Затем молекулы ДНК изучали с помощью электронной микроскопии. Примерно 5% молекул содержали глазок, образованный двум равными по длине сегментами одноцепочечной ДНК глазо находился в одном и том же месте вблизи одного из концов. Дв( такие молекулы показаны на рис. 10-9. [c.172]

Смотреть страницы где упоминается термин Рестриктазы одноцепочечные ДНК: [c.58] [c.74] [c.7] [c.219] [c.48] [c.138] [c.183] [c.184] [c.50] [c.52] [c.54] [c.55] [c.56] [c.58] [c.289] [c.294] [c.330] [c.341] [c.444] [c.30]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология