Ферменты рестрикции рестриктазы

Первым этапом анализа ДНК является экстракция ДНК из любой ткани, содержащей ядерные клетки с последующей ее очисткой. Далее геномную ДНК анализируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или подвергают расщеплению ферментами рестрикции — рестриктаза-ми, распознающими специфические последовательности нуклеотидов и гидролизующими ДНК на ряд фрагментов рестрикции . Последние могут быть разделены методом электрофореза или подвергнуты денатурации нагреванием до однонитевых фрагментов, которые затем переносят на нейлоновый фильтр или нитроцеллюлозную мембрану. Таким образом сохраняется пространственное расположение фрагментов ДНК относительно друг друга. Полученный материал анализируется с помощью ДНК-зонда, представляющего собой фрагмент одноцепочечной ДНК, как правило, помеченный радиоактивным изотопом Р и содержащий специфическую последовательность оснований, комплементарную участку ДНК, который необходимо обнаружить. В качестве зонда можно использовать как нативную ДНК, специфичную гену (геномные зонды), так и синтетическую ДНК, полученную на основе РНК гена (комплементарная ДНК). Если анализируемая последовательность присутствует во фрагментах рестрикции, то зонд гибридизуется с ними, что можно обнаружить с помощью авторадиографии. [c.528]

Затем следует построить карту ДНК. Для этого ДНК разрывают в определенных точках, расстояние между которыми можно точно измерить. Такие точные разрывы возможны благодаря рестриктирующим ферментам (ферменты рестрикции, рестриктазы), мишенью которых служат короткие специфические последовательности ДНК. Карта ДНК, полученная в результате локализации точек разрыва, называется рестрикционной картой. Она представляет собой линейную последовательность сайтов, в которых определенные рестриктирующие ферменты специфически узнают свои мишени. Расстояние между сайтами рестрикции измеряют прямо в нуклеотидных парах ДНК (сокращенно п. н. для коротких отрезков и т. (п.) н. тысяча (пар) нуклеотидов для длинных отрезков). [c.43]

В основе этих методов лежит способность ферментов рестрикции (рестриктаз) расщеплять ДНК на отдельные, довольно короткие нуклеотидные последовательности. В гл. 3 мы уже обсуждали использование рестриктаз для составления физической карты ДНК и получения фрагментов ДНК, нуклеотидная последовательность которых может быть определена непосредственно. Таким образом, если исследователь располагает участком ДНК, соответствующим, например, определенному гену, то определение его нуклеотидной последовательности сейчас уже представляется вполне рутинной, чтобы не сказать рядовой, процедурой. Используя эти данные, с помощью некоторых химических и биохимических методов можно разрывать молекулу ДНК и снова восстанавливать ее целостность практически в любом месте. [c.236]

В клетке межнуклеотидные связи в ДНК и РНК расщепляются нуклеазами — обширным классом ферментов, представители которого различаются по механизму действия и специфичности (табл. 1), Среди нуклеаз, приведенных в таблице, нужно особо выделить эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы). ферменты (их функции рассмотрены в гл. VI) узнают в молекулах ДНК не отдельные нуклеотидные остатки, а нуклеотидные последовательности из четырех, пяти или шести остатков и поэтому расщепляют любую ДНК на сравнительно небольшое число строго определенных фрагментов. [c.13]

Широкое распространение обмена ДНК между бактериями ставит перед ними задачу сохранения собственного генома. Далеко не всегда проникшая в клетку чужеродная ДНК.способна оказаться полезной. Более того, посторонний генетический материал может быть губительным для клетки, особенно если принадлежит бактериальному вирусу, бактериофагу. Для того чтобы бороться с чужеродной ДНК, нужно уметь отличать свою ДНК от чужой. Бактерии достигают этого те.м, что метят свою ДНК с помощью специального модифицирующего фермента. Практически все виды бактерий имеют метилазы, модифицирующие аденин или цитозин в определенной, характерной для данного вида последовательности ДНК- Другой специальный фермент, эндонуклеаза рестрикции (рестриктаза), узнает ту же последовательность и разрезает ее, если она не модифицирована, т. е. попала в клетку извне. Таким путем бактерии ограничивают возможности попадания в них постороннего генетического материала. [c.129]

Один из подходов к решению проблемы деградации хозяйской ДНК гетерологичными эндонуклеазами рестрикции состоит в клонировании и экспрессии в реципиентном организме как гена фермента рестрикции, так и гена соответствующего модифицирующего фермента. Однако клонирование обоих этих генов в одном микроорганизме технически затруднено, если они расположены на хромосоме донорного организма далеко друг от друга. Кроме того, чтобы не допустить расщепления хозяйской ДНК эндонуклеазами рестрикции, метилирующий фермент после трансформации должен синтезироваться еще до начала синтеза рестриктазы. [c.248]

Рекомбинантными плазмидами трансформируют клетки Е. соИ НЕ 101 и выращивают их в жидкой среде, а затем инфицируют бактериофагом X. Если в хозяйской клетке экспрессируется ген фермента рестрикции, то она оказывается устойчивой к литическому действию фагов типа X, ДНК которых активно расщепляется синтезируемой рестриктазой. [c.248]

Ферменты, используемые для получения рекомбинантных молекул,— рестриктазы II типа. Основной характеристикой таких рестриктаз является то, что у них сайты узнавания и места рестрикции совпадают. Обычно рестриктаза II типа узнает определенную последовательность на ДНК и гидролизует ее внутри последовательности сайта рестрикции. Сайты рестрикции рестриктаз II типа представлены симметричными при повороте на 180° последовательностями — палиндромами [c.26]

При метилировании бактериальной ДНК в соответствующих сайтах она становится иммунной к рестрикта-зам (рис. 34.1). Такая защита необходима для предотвращения деградации ДНК клетки под действием ее собственных рестриктаз. Однако этот способ защиты не распространяется на любую чужеродную ДНК, входящую в клетку. Она имеет немодифицированные сайты-мишени и поэтому атакуется ферментом рестрикции. Следовательно, комбинация модификации и рестрикции позволяет клетке отличать чужеродную ДНК от своей собственной. [c.432]

Известно три основных типа ферментов рестрикции. Рестрицирующие эндонуклеазы (рестриктазы) первого типа узнают определенную последовательность нуклеотидов и разрезают двухцепочечную молекулу ДНК неподалеку от этой последовательности, но само место разреза не строго специфично. Эндонуклеазы рестрикции второго типа узнают определенную последовательность и разрезают двойную спираль в определенной фиксированной точке внутри этой последовательности. Эндонуклеазы рестрикции третьего типа узнают нужную последовательность и разрезают двойную спираль, отступив определенное число нуклеотидных пар от ее конца. Мы в основном сосредоточимся на обсуждении свойств эндонуклеаз второго типа, поскольку именно они позволяют, во-первых, получать препараты ДНК, содержащие фрагменты с одинаковыми последовательностями нуклеотидов и, во-вторых, конструировать химерные молекулы ДНК, состоящие из фрагментов, взятых из разных геномов. [c.267]

Ферментам рестрикции в клетке всегда сопутствуют идентичные по субстратной специфичности модифицирующие метилазы, защищающие внутриклеточную ДНК от действия сопряженной рестриктазы. Учитывая близкую функциональную взаимосвязанность ферментов рестрикции-модификации следовало бы их рассматривать совместно. Однако, метилтрансферазы этого типа подробно рассмотрены в обзоре, опубликованном в 23 томе серии Молекулярная биология. Итоги науки и техники . [9]. В настоящей работе сведения об модифицирующих метила-зах, являющихся компонентами систем рестрикции-модификации, будут представлены только в той мере, в которой это будет необходимо для характеристики рестриктаз. [c.5]

История открытия ферментов рестрикции, детальная характеристика их биологической роли, энзиматических и структурных особенностей детально рассмотрена в большом количестве обзоров [49, 58, 59, 62, 263, 309, 417]. Учитывая направленность настоящего обзора на рассмотрение одного из известных типов рестриктаз, в этом его разделе ограничимся лишь описанием некоторых общих вопросов, призванных в первую очередь определить место специфических эндонуклеаз (рестриктаз II типа) среди других обсуждаемых ферментов. [c.6]

Уже сейчас разнообразие нуклеотидных последовательностей, узнаваемых специфическими нуклеазами, представлено большим числом вариантов. Работа по поиску рестриктаз далеко не завершена. С каждым годом появляются ферменты с новой субстратной специфичностью и пока не видно признаков снижения темпов роста их числа (см. табл. 2). Вариабельность структуры узнаваемых последовательностей в настоящее время уже такова, что кажется вполне вероятным со временем обнаружить рестриктазу для любой последовательности нуклеотидов, по меньшей мере являющейся производным типов, представленных в табл. 8. Интенсивное развитие работ по поиску новых ферментов рестрикции позволяет надеяться, что со временем будет получен ответ и на этот вопрос. [c.41]

Учитывая большой и все нарастающий ассортимент ферментов рестрикции, перманентный поиск и выделение все новых рестриктаз, является очевидным, что усовершенствованию методов их выделения постоянно уделяется внимание. Появление методов высокоэффективной жидкостной хроматографии [c.160]

Обработка образца ДНК определенной рестриктазой всегда дает один и тот же набор фрагментов - при условии, что расщепление происходит по всем сайтам узнавания. Если использовать несколько ферментов рестрикции и сначала обработать ДНК каждой из рестриктаз в отдельности, а затем их комбинациями, можно построить физическую карту данной ДНК, т. е. установить порядок следования сайтов рестрикции вдоль молекулы. Определив размер полученных фрагментов с помощью гель-электрофореза, можно найти положение рестрикционных сайтов (дополнение 4.1). На рис. 4.4,А указаны размеры фрагментов, полученных в результате расщепления ДНК разными рестриктазами и их смесью. Из этих данных следует, что данный участок ДНК имеет по два сайта для ВатШ и ЕсоШ. [c.53]

Развитие технологии рекомбинантных ДНК было бы невозможно, если бы в распоряжении исследователей не было нужных эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз). В настоящее время в продаже имеется более 300 различных рестриктаз. Эти ферменты синтезируются самыми разными микроорганизмами аэробными, анаэробными, фотосинтезирующими, диазотрофными. [c.247]

Г оворя о молекулярном уровне организации таких систем, следует отметить участие в них ферментов, обладающих замечательными свойствами узнавать последовательности или структурные особенности ДНК. Ферменты рестрикции связываются со специфическими последовательностями ДНК, что дает нам дополнительную информацию о природе взаимодействия белков с нуклеиновыми кислотами. Некоторые рестриктазы связываются с ДНК в одном сайте, а разрезание производят в другом, достаточно удаленном это свидетельствует о способности белков перемещаться вдоль двухцепочечной ДНК. По-видимому, репарирующие ферменты узнают поврежденные сайты в ДНК из-за искажения в этом участке молекулы правильной структуры. Ферменты, участвующие в рекомбинации, могут связывать две молекулы ДНК, стимулируя спаривание между ними. [c.431]

Практически все виды бактерий синтезируют но одному или по несколько типов специфических к определенной нуклеотидной последовательности эндонуклеаз, которые делают разрезы в двухцепочечной ДНК. Эти эндонуклеазы называются рестрицирующими ферментами (или рестриктаза-ми), поскольку их основная функция состоит, но-видимому, в ограничении присутствия инородной ДНК в бактериальной клетке (рестрикция буквально означает ограничение). ДНК клеток, синтезирующих ферменты рестрикции, защищена от их действия, потому что клетки синтезируют также модифицирующие ферменты, видоизменяющие структуру сайтов ДНК, узнаваемых ферментом рестрикции. Если клетка с действующей системой рестрикции и модификации инфицируется фагом с заранее не модифицированной ДНК, то вероятность того, что ДНК такого фага инициирует инфекцию, на несколько порядков меньше, чем для фага с модифицированной ДНК. Немодифицированная ДНК фрагментируется, число фрагментов зависит от числа сайтов узнавания в соответствующей молекуле ДНК, а затем фрагменты расщепляются экзонуклеазами. Изредка ферменты клетки-хозяина модифицируют фаговую ДНК до того как ее атакуют рестриктазы. В этом случае фаговая инфекция приводит к лизису клетки. Все потомки такого фага содержат тоже модифицированную ДНК и способны с высокой эффективностью заражать другие бактериальные клетки (с такой же системой рестрикции и модификации). Изучение закономерностей фаговой инфекции и привело к открытию систем рестрикции и модификации ДНК и разработке методов получения чистых препаратов соответствующих ферментов. [c.266]

Ферменты рестрикции позволяют вырезать любые произвольные фрагменты ДНК и комбинировать из них in vitro рекомбинантные (или химерные) молекулы. Это оказывается возможно, поскольку многие рестриктазы разрезают двойную спираль так, что место разреза одной цепи сдвинуто относительно второй, в результате чего образовавшиеся фрагменты обладают комплементарными одноцепочечными концами (см. табл. 9.1). Эти концы могут соединяться посредством образования водородных связей между комплементарными основаниями, причем сшиваться таким образом могут различные фрагменты ДНК, как это показано на [c.275]

Большинство рестриктаз класса II узнают на ДНК последовательности, содержащие от 4 до 6 нуклеотидных пар, обладающих осью симметрии второго порядка. В 1973 г. американские И1-следователи X. Смит и Д. Натане предложили номенклатуру для обозначения ферментов системы рестрикции — модификации. В соответствии с этой номенклатурой, которая сегодня является общепринятой, первая буква рода и две первые буквы вида образуют состоящие из трех букв сокращения источника выделения фермента. Эндонуклеазы обозначают символом R, метилазы — М. Если из одного типа клеток выделены два или больше ферментов рестрикции, то их нумеруют соответственно римскими цифрами. Исходя из этой номенклатуры рестриктазы Е. oli [c.139]

Для создания же полных специфических библиотек требуется всего лишь 10 000—20 000 клонов, так как количество независимых клонов эквивалентно числу рестрикционных фрагментов, полученных при использовании данного фермента рестрикции. Так например, для рестриктазы Notl, которая отщепляет приблизительно по 1000 т. п. н. в геноме человека, таких фрагментов должно быть всего лишь около 3000. Поэтому библиотеку из 10000 клонов для прыжков по Not 1-сайтам можно считать практически полной. Очевидным недостатком таких библиотек является то, что их нельзя использовать, когда стартовая точка прыжка не примыкает к редко встречаюш,емуся сайту рестрикции. К сожалению, это довольно частое явление, препятствуюш ее быстрому распространению данного метода. Если же все-таки удается идентифицировать клон, примыкающий к редко встречающемуся сайту рестрикции, использование специфических библиотек для прыжков по хромосоме может оказать неоценимую помощь. [c.99]

В некоторых случаях встречаются фрагменты с такими близкими значениями Rf, что их нельзя разрешить на картине фореза. Тогда полезно повторить эксперимент с использованием другого фермента. При этом имеет место перетасовка рест-риктов ГВР, что дает нам лишний шанс разделить сомнительные полосы. Когда используется фермент рестрикции, узнающий четырехнуклеотидную последовательность, эффект перетасовки обычно едва заметен, особенно для высокомолекулярных фрагментов, так как вклад в величину этих фрагментов фланкирующих последовательностей (содержащих сайты узнавания для рестриктаз) невелик, независимо от того, какой фермент используется. Тем не менее некоторые полосы можно идентифицировать благодаря тому, что их подвижность по другим ферментам будет лишь немного изменена. Для достижения эф- [c.199]

Рестриктазы, впервые открытые благодаря их действию nat чужеродную ДНК, попавшую в бактериальную клетку, пред ставляют собой основной рабочий инструмент молекулярного-биолога. К настоящему времени охарактеризованы многочисленные ферменты рестрикции, но наибольшее внимание уделяется ферментам типа II, поскольку именно они узнают определенные последовательности нуклеотидов внутри или окола-сайта их действия и разрезают обе нити двухцепочечной молекулы ДНК определенным образом. Обычно за единицу (ед.) активности рестриктазы принимают активность, при которой- [c.278]

Фермент рестрикции 8аиЗА узнает последовательность —ОАТС— и расщепляет цепь ДНК на 5 -стороне (слева) от О (поскольку верхняя и нижняя цепи большинства сайтов рестрикции читаются одинаково в направлении от 5 - к З -концу, только одна цепь этого сайта может быть показана для иллюстрации). Одноцепочечные концы, возникающие при расщеплении рестриктазой 8аиЗА, идентичны концам, возникающим при расщеплении рестриктазой ВатН1 (рис. 5-38), что позволяет им соединяться при инкубации с ДНК-лигазой. (Полезно нарисовать структуру продукта, образующегося в результате такого сшивания, чтобы убедиться в том, что она правильна.) [c.42]

На основании субъединичной структуры и потребности в кофакторах рестриктазы сначала были разделены на два типа [89]. В результате дальнейших исследований появились дополнительные критерии для классификации ферментов рестрикции. Был идентифицирован третий тип специфических эндонуклеаз [201, 307]. Основные свойства ферментов всех трех типов приведены в табл. 1, позаимствованной из обзора Юана [417]. Эта таблица представлена с незначительными дополнениями, касающимися новых сведений о субстратной специфичности сравниваемых ферментов рестрикции, отнесенных к разным типам [212, 292, 293, 319]. Включение в нее данных о модифицирующих метилазах является неизбежным, так как ферменты I и III типов представляют собой бифункциональные сложные белки, проявляющие как рестриктазную, так и ме-тилазную активность [157, 201, 307, 325, 418]. Кроме того, ферменты I типа обладают ярко выраженной АТФазной активностью [134, 418]. [c.8]

Чувствительность рестриктаз к различным модификациям субстрата представляет собой важное проявление их специфичности. Поэтому такие данные регулярно обобщаются и публикуются. Выполняется эта работа в основном Макклелландом [252, 253, 258]. В табл. 12 представлены сводные данные, касающиеся характеристики ферментов рестрикции II типа [258]. Они обобщают совокупность известных данных о чувствительности рестриктаз к метилированию субстрата. Ниже приводятся некоторые частные обобщения, составленные на основе данных, приведенных в табл. 12. [c.49]

В случае изучения рестриктазы Нра I (5 GTPAA ) заменам на и или на 5BrU подвергался Т, находящийся около расщепляемой фосфодиэфирной связи, [127]. Первая замена блокировала гидролиз олигонуклеотида, а вторая — приводила к появлению незначительного количества продуктов рестрикции. Из этого был сделан вывод, что 5-СНз группа тимина участвует в образовании гидрофобного контакта с ферментом. Способность рестриктаз Нра I и E oR I расщеплять бромиро-ванный субстрат указывает, что атом брома может компенсировать потерю 5-СНз группы путем вступления в прямой контакт с ферментом, так как Ван-дер-вальсовый радиус атома брома близок радиусу метильной группы, только он является более электроотрицательным. Наличие атома Вг в пиримидиновом кольце меняет распределение электронов и таким образом может влиять на взаимодействие пиримидина с соседними основаниями или белком [265]. [c.83]

Сведения о возможном участии гидрофобных взаимодействий с углеродной частью w-аминопентилсефарозы в хроматографическом фракционировании рестриктаз, описанном в цитированных выше работах, отсутствуют. Таким образом, амино-пентилсефарозу можно рассматривать как второй (после ДЭАЭц) анионит, используемый для очистки ферментов рестрикции, что расширяет возможности варьирования процедур выделения целевых ферментов. [c.158]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология