Очистка гибридов ДНК—РНК

В клетке можно пометить любые молекулы для этого е них вводят один или несколько радиоактивных атомов. Нестабильные радиоактивные атомы распадаются, испуская излучение, что позволяет прослеживать судьбу исследуемых молекул. Применение радиоизотопов в клеточной биологии ограничено двумя видами экспериментов анализ метаболических путей по методу вытеснения метки и локализацией меченых молекул в клетке с помощью радиоавтографии. Антитела представляют собой очень удобный и чувствительный инструмент для локализации специфических биологических макромолекул В организме позвоночных животных продуцируются миллионы различных антител, в каждом из которых имеются участки связывания, опознающие специфические группы молекул. Метод гибридом позволяет получать моноклональные антитела с одинаковой специфичностью практически в неограниченных количествах. В принципе можно получать моноклональные антитела против любых макромолекул в клетке и затем использовать эти антитела для локализации или очистки определенных макромолекул, а в некоторых случаях и для анализа внутриклеточных свойств этих молекул. [c.228]

В заключение отметим, что получение и очистка моноклональных антител требуют новых как научных, так и инженерных разработок, чтобы можно было проектировать процессы, обеспечивающие как быстрый рост продуцирующих клеток (т.е. гибридом), так и высокое качество конечного продукта. Создание таких процессов позволит получать большие количества моноклональных антител (до 100 г в одном периодическом процессе) с очень высокой степенью чистоты. Ясно, что такие процессы являются идеальными для получения новых моноклональных антител, которые могут быть применены в иммуноанализе. [c.50]

После отмывки фильтров от несвязавшегося радиоактивного зонда их высушивают и анализируют с помощью авторадиографии с использованием чувствительной к радиоактивному излучению рентгеновской пленки. Образование специфических гибридов обнаруживают после проявления рентгеновской пленки по появлению на ней четких гибридизационных сигналов в виде темных пятен, положение которых точно соответствует таковому определенных колоний или бляшек на исходной чашке Петри. В результате проведения исследования идентифицируются бактериальные колонии или фаговые бляшки, содержащие искомые рекомбинантные ДНК. С этого момента с помощью обычных микробиологических и биохимических методов можно получать неограниченное количество идентичных копий клонированной последовательности нуклеотидов ДНК для дальнейших исследований. В ряде случаев, когда нет необходимости в скрининге большого числа клонов, гибридизацию с зондами можно заменить ПЦР. При таком подходе в качестве источника матричной ДНК используют суспензию бактериальных клеток или фаговых частиц отдельных клонов без специальной очистки матричных нуклеиновых кислот. [c.163]

Если отмытый фильтр затем нагреть до температуры выше температуры плавления гибрида ДНК — РНК (гл. 1), специфически связанная РНК будет освобождаться этот метод является наилучшим для очистки специфической информационной РНК. [c.162]

Основное преимущество метода гибридом определяется возможностью получения моноклональных антител против неочищенных молекул, содержащихся в сложной смеси в качестве минорного компонента. Это преимущество обеспечивается реальностью выбора индивидуальных гибридом, образующих антитела определенного вида, из сложной смеси различных гибридных клеток, продуцирующих множество разных антител. Таким образом в принципе можно получить моноклональные антитела против любого белка, содержащегося в клетке. Каждый тип антител можно затем использовать в качестве специфического зонда как для локализации белков с помощью цитологических методов, так и для очистки белков. Получив белки в чистом виде, мы можем исследовать их структуру и функцию. К настоящему времени выделено не более 5% из 1000 или более различных белков, которые, судя по имеющимся данным, содержатся в типичной клетке млекопитающих. Использование моноклональных антител и технологии клонирования генов (см. ниже) снимает многие сложности в идентификации и определении новых белков и генов. Проблемой для исследователей остается определение их функций. [c.227]

Буфер 2XSSG (SSG —0,15 М Na l, содержащий 0,015 М цитрат натрия, pH 7,0). Используется при сорбции ДНК, гибридизации и очистке гибридов. [c.152]

В этих случаях очистка гибридов заключается в отделении гибридизированной РНК от других компонентов реакционной смеси посредством ступенчатого элюированпя солевыми растворами при повышенной температуре, После гибридизации на любом из перечисленных носителей иа его [c.157]

В системах, в которых для очистки гибрида пспользуется РНК-аза, устойчивый К ферменту гибрид представляет собой, как это было доказано, структуру, стабилизированную комплементарными водородными связями (см. разд. IV). Для систем, в которых элюировапие проводили солевыми растворами, подобное доказательство отсутствует, и это заставляет с осторожностью относиться к результатам таких. экспериментов. [c.157]

При гибридизации на фильтрах очистку гибридов выполняют так же, как и при проведении гибридизации в растворе с последующей очисткой гибридов на фильтрах. После гибридизации флаконы охлаждают. Фильтры извлекают из флаконов и промывают с каждой стороны 50 мл буфера 2XSS с отсасыванием. (Если фильтры высушить и определять радиоактивность на этой стадии, то полученные результаты будут относиться к неочищенным гибридам.) Лабильные комплексы разрушают, инкубируя фильтры при комнатной температуре в буфере 2XSS , содержащем 20 мкг мл предварительно прогретой РНК-азы. Обработку РНК-азой нужно проводить в буфере 2XSS , в то время как на других стадиях можно использовать и более концентрированные растворы. Фильтры высушивают и определяют радиоактивность. [c.158]

Описанный подход люжно использовать и для очистки рестриктов ДНК, содержащих определенную последовательность, из продуктов переваривания рестриктазами суммарных нативных ДНК или для оценки содержания определенных генов в исследуемой ДНК путем титрования избытком меченой кДНК. Авторы отмечают, что аналогичные задачи решались путем гибридизации с НК, сорбированными на целлюлозе. Однако гибридизация с участием иммобилизованных НК идет хуже, а при последующем плавлении гибридов с матрицы могут частично сниматься и пе закрепленные ковалентной связью молекулы, по которым идет отбор. [c.439]

Потенциальная контаминация названных выше продуктов возможна из рааллчных источников от лиц, чьи клетки используются в биотехнологических процессах, от миеломных клеток, применяемых для получения гибридов, из питательных сред для культивирования клеток млекопитающих, из реагентов, используемых для очистки белковых продуктов, например, моноклональные антитела, наконец, несоблюдение требований GMP [c.256]

Следует всегда номиить о том, что примеси основных белков в препаратах ДНК также увеличивают уровень фона. Для очистки ДНК можно посоветовать метод Мармура [20] в модификации Джилесни и Сиигелма-на [8]. Возрастание уровня фона за счет загрязнений препаратов ДНК определяют, проводя при 4° ложную гибридизацию, для чего используют ДНК фильтры и РНК с нулевым фонола . При этой температуре за короткий срок (1—2 дня) гибриды не образуются, однако сорбция ДНК, обусловливающая возрастание фона, происходит нормально. Независимо от методики гибридизации и обнаружения гибрида препараты ДНК должны быть свободны от следов РНК-азы. [c.159]

ДНК и РНК выделяли из Е. соН. Гибридизацию проводили на мембранном фильтре, используя избыток ДНК и небольшие количества РНК. После гибридизации в течение 24 час ДНК-фи. ц,тр удаля.чи и очищали образовавшийся гибрид. В раствор РНК помещали свежий ДНК-фильтр и повторя.г]и гибридизацию и очистку ибрида РПК гибридизовали со свежими порциями ДНК (на фильтрах) до тех пор, пока количество образующихся гибридов не стало постоянным (подряд на трех фильтрах). [c.164]

Гибридизация ДНК - ДНК и ДНК - РНК. Если дуплексы ДНК, выделенные из клеток человека и мыши, денатурировать нагреванием по отдельности, а затем смешать и выдержать в течение многих часов при температуре ниже температуры плавления, то большая часть цепей мышиной ДНК отжигается с комплементарными цепями мышиной ДНК с образованием исходного дуплекса. Аналогичным образом большинство цепей ДНК человека воссоединяется с комплементарными цепями ДНК человека. Наряду с этим некоторое число одиночных цепей ДНК мыши будет связываться с одиночными цепями ДНК человека, в результате чего появляются гибридные дуплексы, в которых отдельные участки цепей ДНК мыши образуют двухцепочечные области с участками цепей ДНК человека (при наличии комплементарных пар оснований). Гибридные дуплексы возникают только при условии, что между ДНК двух разных видов существует комплементарное сходство в нуклеотидных последовательностях. Чем ближе родство двух видов, тем в большей степени их ДНК будут образовывать гибриды. Например, ДНК человека гораздо лучше образует гибриды с ДНК мыши, чем с ДНК дрожжей. При наличии комплементарных пар оснований возможно образование гибридных дуплексов ДНК — РНК. Например, в ходе транскрипции новосинтезируемая цепь РНК временно образует короткие отрезки гибридной двойной спирали ДНК — РНК (за счет спаривания ее оснований с основаниями матричной цепй ДНК). Гибридизационные тесты используют в биохимической генетике для определения того, насколько близки два вида для установления связи данной ДНК с какой-либо РНК для выделения и очистки генов и РНК и определения их нуклеотидных последовательностей. [c.300]

Комплексообразование по-разному сказывается на спектрах поглощения исследуемых МГЦ-соединений в соответствии с особенностями в строении их хелатных узлов. Комплексы соединения I с Си +, N1 + и Со + дают спектры с полосами поглощения, отличными от без-метального соединения, но сходными по форме друг с другом, причем в спектрах первых наблюдается батохромный эффект. Так, в спектре комплекса соединения I с медью максимум поглощения при 506 нм сдвигается до 558 нм и возникает ряд новых максимумов в области 550—713 нм (табл. 1, рис. 1). Спектр соединения I при комплексообразовании в целом усложняется, что, вероятно, связано с сильной асимметричностью поля лиганда и неодинаковой прочностью связей металл—азот. Характерна в спектрах комплексов этого соединения идентичность полос поглощения в области 680 нм (рис. 1), в противоположность отмеченного различия в спектрах этих соединений в зависимости от природы координируемого иона, сделанного в работе [7], что, вероятно, также связано с очисткой соединений. Сходство характера спектров поглощения комплексов наталкивает на мысль, что появление этих полос связано с переходами в связях металл—лиганд. Действительно, эти ионы являются -элементами и образуют гибриди-зованные ё, з, р-связи с лигандом, переходы в которых и обусловливают идентичный характер спектров. [c.60]

Метод очень эффективно работает для всех антител класса IgG мыши, кроме подкласса IgGl. Эти последние антитела обладают очень низкой аффинностью по отношению к белку А. Поэтому для получения хорошего их выхода метод следует модифицировать. Очистка иммуноглобулинов других классов здесь не рассматривается, поскольку подавляющее большинство гибридом, получаемых в результате гипериммунизации и слияния, проводимых в соответствии с описанными методиками, продуцирует антитела класса IgG. Мы не советуем вам получать антитела нз асцитной жидкости (разд. 6.3.8), поскольку такие же количества антител, причем более чистых, могут быть получены прн использовании методов, описание которых приводится выше. [c.198]

Низкая эффективность метода MMGT означает, что загрязнение целыми клетками является серьезной проблемой даже в том случае, когда система селекции предусматривает подавление их роста. В некоторых экспериментах мы обнаружили гибриды целых клеток и даже ревертанты донорных клеток, которые смогли избежать элиминации. Конечно, процедура очистки мини-клеток в какой-то степени решает проблему, но ценой уменьшения выхода мини-клеток и, как следствие, последующего уменьшения выхода гибридов. Один из способов разрешить это противоречие — использовать реципиентные и донорные клетки с различной морфологией. Например, в наших опытах в роли реципиентов выступали клетки эмбриональной карциномы мыши (ЭК). Их морфология является рецессивным признаком по отношению к морфологии L-клеток. В экспериментах, где гибридные клетки человек—грызун с морфологией L-клеток используются в качестве доноров человеческих хромосом, а ЭК-клетки — в качестве реципиентов, гибриды целых клеток могут быть легко выявлены по их морфологии. [c.22]

Для дальнейшего совершенствования процесюв получения и очистки моноклональных антител необходимо провести исследования в нескольких направлениях. Используемые в настоящее время процессы ферментации очень эффективны. Однако более глубокое понимание физиологии гибридом и линий клеток человека должно позволить увеличить выход продукта. Например, очень перспективным представляется улучшение линий клеток путем повторного [c.49]

Одна из наиболее трудных проблем при цитометрии связана с неспецифическим окрашиванием. Клеточный сортер с чрезвычайно высокой чувствительностью детектирует флуоресцирующие молекулы — обычно с большей, чем глаз. Поэтому реагенты, используемые при работе с сортером, должны быть более высокой степени очистки, чем для других методов анализа. Как правило, гетерологичные сыворотки должны подвергаться очистке на аффинных сорбентах даже в тех случаях, когда они достаточно специфичны для непосредственного использования при флуоресцентной микроскопии. Моноклональные антитела не всегда требуют очистки. Мы с успехом использовали супернатанты многих продуцирующих моноклональные антитела гибридом, которые культивировали в средах с добавлением и без добавления сыворотки, а также асцитные жидкости (конечно, в соответствующем разведении). В случае непрямых методов флуоресцентного окрашивания влияние контаминирую-щих молекул в культуральных жидкостях сводится к минимуму. Если конъюгированные с флуорохромом антитела строго специфичны по отношению к иммуноглобулинам, то даже при связывании клетками молекул, не относящихся к иммуноглобулинам, эти молекулы не будут детектироваться (по флуоресценции). В случае применения асцитных жидкостей активность моноклональных антител обычно настолько высока, что эффекты контаминирующих иммуноглобулинов и других компонентов чаще всего не выявляются. Однако при прямом конъ-югировании препаратов антител с флуорохромом наличие в них белковых примесей неиммуноглобулиновой природы может стать причиной высокого уровня неспецифического окрашивания. Следовательно, любой конъюгат используемый при сортинге клеток, должен быть тщательно очищен. [c.332]

Для получения моноклональных антител, одиако, требуется не только большое число линий гибридом, ио и знание основных приемов поддержания этих линий в культуре, выявления аитител данной специфичности и их очистки. Поэтому в этой главе будут опнсаиы важнейшие вспомогательные методики, которые помогут исследователю, не имеющему опыта в культивировании клеток, вырастить и испытать гибридомы. Где это возможно, будут указаны нсточиики коммерческих реактивов. [c.314]

Культивирование гибридом in vitro. Продукция антител при рутинных способах культивирования in vitro является низкой (единицы—десятки микрограммов на 1 мл). Преимуществом этого метода является упрощение процедуры очистки антител. Кроме того, низкая концентрация антител, присутствующих в культуральной среде, оказывается достаточной для проведения некоторых тестов с использованием моноклональных антител. [c.202]

Фирма Линде, используя обе новинки - регенераторы Френкля и Турбо детандер, создала, воздухоразделительные установки Линде-Френкль для получения газообразного кислорода производительностью до 3600 м /ч кислорода. В них большая часть воздуха сжималась до низкого давления (0,6 Пa), необходимого для ректификации в колонне. Этот воздух сжимался в турбокомпрессоре, а затем охлаждался и очищался в регенераторах. Необходимое охлаждение происходило в турбодетандере, который работал тоже при начальном давлении 0,6 МПа. Но он все же не обеспечивал всю нужную холодопроизводительность и приходилось часть воздуха (5-6%) сжимать до высокого давления и дросселировать, как в классическом процессе Линде. Лля этого пришлось сохранить поршневой компрессор и химическую очистку возгуха. Таким обра-30 , получился некий гибрид из нового (низкое давление воздуха, регенераторы, турбокомпрессор, турбодетандер) и старого (высокое давление воздуха, поршневой компрессор, химическая очистка). Но доля воздуха, сжимаемого до низкого давления, все же превышала 95%. Эти установки, несомненно, были большим достижением 30-х годов в этой области техники. [c.276]

Смотреть страницы где упоминается термин Очистка гибридов ДНК—РНК: [c.243] [c.243] [c.151] [c.152] [c.167] [c.5] [c.243] [c.436] [c.449] [c.542] [c.168] [c.177] [c.181] [c.334] [c.188] [c.69] [c.180] [c.494] [c.43] [c.68] [c.315] [c.42] [c.158] [c.406] [c.194]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология