Гель-электрофорез и перенос ДНК

Очень важной областью применения радиоавтографии является обнаружение радиоактивного ДНК-зонда после его гибридизации с препаратом ДНК, подвергнутым электрофоретическому разделению. К сожалению, провести гибридизацию в самом геле невозможно, поскольку зонд не может в него проникнуть. Поэтому ДНК после электрофореза переносят на нитроцеллюлозный или найлоновый фильтр по методу Саузерна (Саузерн-блоттинг) или с помощью элюции. Расположение молекул ДНК на фильтре в точности соответствует таковому в геле. Перенесенную на фильтр ДНК подвергают [c.65]

Тотальную ДНК из клеток человека гидролизуют эндонуклеазой примерно на 500000 фрагментов длиной от 10 до 10 нуклеотидных пар. Затем фрагменты разделяют по молекулярной массе с помощью гель-электрофореза в агарозе, после чего ДНК денатурируют щелочью прямо в геле, чтобы получить одноцепочечные фрагменты. Их переносят на нитроцеллюлозный фильтр и фиксируют высушиванием при 80°С. В результате получается отпечаток (реплика) картины разделения фрагментов ДНК по их размеру. Эти фрагменты можно идентифицировать методом гибридизации с радиоактивными ДНК-зондами, специфичными для определенных генов или хромосом. Любой фрагмент, содержащий всю последовательность зондируемого гена или его часть, будет выглядеть на радиоавтографе в виде темной полосы (рис. 4.60). [c.126]

При проведении иммуноблоттинга сложную смесь антигенов вначале подвергают гель-электрофорезу, а затем фракционированные пептиды переносят (блоттинг) на лист нитроцеллюлозы для идентификации индивидуальных антигенов при помощи специфических антисывороток. Производя предварительное разделение в геле с додецилсульфатом натрия или в геле для изо-электрического фокусирования можно получить данные о размерах и изоэлектрической точке исследуемых антигенов, а также о сходстве между ними (родстве) (рис. 29.13). [c.531]

Иммуноблоттинг — определение антигенов или антител с помощью известных сывороток или антигенов. Метод основан на вьщелении антигена с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, последующем переносе вьщеленного антигена из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозу (блот-пят-но) и выявлении на подложке искомого антигена с помощью ИФА. Используется как диагностический метод. [c.181]

Заряженные частицы перемещаются в растворе под влиянием электрического поля с различной скоростью. Уже в первой половине нашего столетия для этого явления было введено понятие "электрофорез" или "электрический перенос". Различие скоростей перемещения может быть обусловлено двумя причинами (а) различные молекулы несут на себе различные заряды и поэтому при наложении электрического поля могут ускоряться в различной степени (б) их перемещению препятствует различающееся по величине сопротивление трения. В простейшем случае разделительная среда (раствор электролита) находится в трубке. Из-за отвода Джоулева тепла на практике зачастую наблюдается искажение зон за счет различных плотностей электролита и конвекционных потоков. В случае классического электрофореза применяются гели или полоски бумаги, пропитанные электролитами для того, чтобы уменьшить помехи, вызванные конвекцией, а также чтобы увеличить сопротивление трения макро-молекул с незначительными различиями в зарядах и тем самым усилить эффект разделения. Использование полиакриламидного гель-электрофореза (ПААГ-электрофореза) позволяет проводить эффективное разделение молекул ДНК и белков. Благодаря изменению степени сшивания геля может быть оптимизирована производительность разделения. При использовании гель-электрофореза белков, денатурированных додецилсульфатом натрия (ДДСН), возможно непосредственное определение их молекулярной массы. Разделение в этом случае основано исключительно на затруднении миграции пробы через гель (без геля все денатурированные додецилсульфатом натрия белки перемещаются с одинаковой скоростью). [c.5]

Наряду с КЗЭ, при котором удается осуществить разделение только за счет разницы в подвижности, и который в настоящее время представляет собой наиболее распространенный метод, выделяют также капиллярный гель электрофорез (КГЭ) с капилляром, заполненным гелем. При этом на электрофоретическую миграцию молекул оказывает влияние матрица геля, и поэтому достигается селективное разделение молекул по размерам. Незаряженные молекулы можно разделять с помощью мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ). В данном случае к буферу добавляется детергент, и нейтральные молекулы распределяются между буфером и мицеллами в соответствии с их гидрофобностью. Разделение основано на подвижности мицелл, заряженных в большинстве случаев отрицательно. Поскольку в основе разделения лежит процесс распределения, можно с полным основанием говорить о хроматографическом методе. При изоэлектрической фокусировке (ИЭФ) происходит разделение в градиенте pH, формируемом добавлением амфолита к буферу в электрическом поле. Небольшое распространение получила пока электрохроматография (ЭХ), при которой применяется стационарная среда ВЭЖХ, а течение эдюента и перенос пробы происходит только за счет электроосмотического потока. В качестве самой старой капиллярной техники следует упомянуть изотахофорез (ИТФ), который в настоящее время вновь приобрел значение для концентрирования проб в КЭ. [c.7]

Вестерн-блоттинг (Western blotting) Перенос белковых молекул, разделенных с помощью гель-электрофореза, на твердую подложку. [c.545]

Рис. 18.17. Картирование клонированных генов человека при использовании гибридов соматических клеток мыши и человека с помощью блот-гибридизации по Саузерну. Присутствие хромосом человека определяется при цитологическом изучении гибридных клеток. Ферменты, служащие маркерами данных хромосом, выявляются с помощью гель-электрофореза. Рестрикционные фрагменты ДНК, выделенной из гибридной линии, разделяют электрофорезом в агарозном геле и переносят на нитроцеллюлозный фильтр. На этом фильтре проводят их гибридизацию с зондом, меченным радиоактивными изотопами. (По Shows ТВ. et al, 1982. Adv. Hum. Genet., 12, 341-452.)

Для анализа РНК. кодирующих альбумин, с помощью ДНК-зонда используется метод Нозерн-блоттинга. На первом этапе с помощью гель-электрофореза, фракционируют интактные молекулы РНК дефектных и контрольных клеток печени и пол чают набор полос. Для гого чтобы молекулы РНК, содержащиеся в геле, сделать более доступными ДНК-зонду, осуществляют перенос (блоттинг) фракционированных молекул РНК из геля на лист нитроцеллюлозы. На следующем этапе лист нитроцеллюлозы инкубируют с раствором, содержащим меченый ДНК-зонд. Полосы РНК, гибридизующиеся с зондом, выявляют методом радиоавтографии (рис. 4-72). Известно, что скорость движения молекул нуклеиновых кислот в геле зависит от их размера при электрофорезе малые молекулы перемещаются быстрее, чем большие. Сравнивая [c.239]

Для анализа структуры гена альбумина дефектных мыщей был использован метод Саузерн-блоттинга. В данном случае вместо РНК анализируется ДНК Изолированную ДНК сначала обрабатывают рестрицирующими нуклеазами, затем полученные фрагменты разделяют по размеру гель-электрофорезом и выявляют комплементарные ДНК-зонду альбумина с помощью переноса и гибридизации, как это описано для РНК (см. рис. 4-72). Повторяя эту процедуру с различными рестрицирующими нуклеазами, можно получить детальную рестрикционную карту генома в участке альбуминового гена (см. разд. 4.6.2). Анализируя эту карту, можно ответить на вопрос, несет ли альбуминовый ген у дефектных животных перестройки, например, делеции или инсерции коротких фрагментов ДНК. [c.240]

Используйте стандартную методику гель-электрофореза РНК [281. Удобнее всего работать с содержащими формальдегид агарозными гелями а для переноса РНК и анализа ее на фильтрах можно использовать методы, описанные в работе [28]. Мы получали хорошие результаты с найло- овыми фильтрами Hybond (Amersham International), следуя инструкциям-фирмы-производителя. [c.29]

Секретированная форма НА оказывается отличной от белка связывания мембраны дикого типа только в одном отношении — в скорости его гликозилирования. Добавка углевода к белкам происходит в две стадии. Как только образующийся белок появляется на открытой просвету потока стороне грубого эндоплазматического ретикулума, преформированные богатые сахарозой олигосахариды переносятся от липидного носителя к определенным аспарагиновым остаткам [13, 21]. Это первоначальное котрансляционное гли-козилирование кора является только первым шагом в тщательно разработанной программе реакций, которые происходят в грубом эндоплазматическом ретикулуме и позднее в аппарате Гольджи, где сахара упорядочены и добавлены к образующемуся белку [13, 26]. Во время биосинтеза НА переход от гликозилированной по кору молек5щы к полной молекуле можно наблюдать при анализе методом SDS-гель-электрофореза белка, меченного S-метионином, или меченных тритием предшественников сахаров в экспериментах с пульсовой меткой. Конечный состав олигосахаридных боковых цепей на завершенных белках штамма дикого типа и А -бел-ках оказывается одинаковым. Однако в противоположность белку связывания мембраны дикого типа, который быстро и относительно синхронно гликозилирован, популяция секреторных молекул становится терминально-гликозилированной через очень длительный период. Возможно, это различие в некоторой степени отражает относительную эффективность, с которой белки связывания мембраны и относящиеся к просвету потока белки изолируются в транспортные везикулы, перемещаемые от грубого эндоплазматического ретикулума к аппарату Гольджи. [c.183]

Гибридизацию по Саузерну [7] используют для выявления и изучения организации последовательностей ДНК после их разделения с помощью гель-электрофореза. Процедура гибридизации подразделяется на два этапа. Первый этап — перенос разделенных фрагментов ДНК на нитроцеллюлозную мембрану, осуществляемый под действием капиллярных сил (в последнее время применяется электроперенос) таким образом, чтобы относительное положение каждой молекулы ДНК осталось неизменным. Второй этап — гибридизация связанной ДНК с пробами, меченными изотопами (комплементарной ДНК), для выявления определенных последовательностей ДНК. Анализ ДНК по Саузерну включает в себя апуриниза-дию, денатурацию и нейтрализацию ДНК внутри геля с последующим переносом и связыванием нуклеиновой кислоты с мембраной. Далее мембрану инкубируют с одноцепочечной пробой, меченной радиоактивным изотопом, а после отмывания — выявляют гибридизовавшиеся гомологичные фрагменты ДНК путем авторадиографии с использованием рентгеновской пленки. [c.277]

Активность GUS можно выявить in situ среди фракционированных белков после денатурирующего гель-электрофореза экстрактов. Такой подход помогает изучать белки, образующиеся в результате трансляционного слияния, а также посттрансля-ционный процессинг белков, например отщепление транзитных пептидов после переноса продукта химерного гена ab-GUS в хлоропласты. Аналогичный анализ химерного гена РБФК M -npt-II описан в разд. 6.7, в котором и приведены более подробные детали приготовления и проведения электрофореза в ПААГ. [c.371]

Белки, разделенные в геле с помощью ДСН-электрофореза, переносят на твердую подложку, например на нитроцеллюлозу или активированную бумагу (Renart et al., 1979). Считается, что активированная бумага, с которой перенесенные белки связываются ковалентно, обладает более высокой сорбционной емкостью, которая, к сожалению, проявляется и в более высоком фоновом связывании. На сегодняшний день наиболее популярным материалом матрицы для белкового переноса является нитроцеллюлоза. Методы фракционирования белков в геле с использованием ДСН-электрофореза и (или) изоэлектрофокусирования весьма многочисленны и разнообразны. В настоящей статье мы не будем их рассматривать, а при изложении материала будем считать, что у нас имеется гель, в котором с применением тех или иных электрофоретических приемов уже провели разделение белковых компонентов исследуемых образцов. [c.342]

Кольцевые YA имеют ряд преимуществ перед линейными. Во-первых, они легко выделяются из суммарной дрожжевой ДНК, поскольку кольцевые молекулы задерживаются в стартовом положении при гель-электрофорезе с пульсирующим полем (см. приложение). Во-вторых, они более устойчивы к разрывам при манипуляциях. В-третьих, введение в исходный вектор репликатора из F-плазмиды позволяет переносить YA в клетки Е. oli, трансформируя их суммарной дрожжевой ДНК. [c.361]

Цитохалазин В-антибиотик, который часто используют как ингибитор клеточной подвижности, обеспечиваемой актином,-служит также мошным конкурентным ингибитором поглощения О-глюко-зы клетками млекопитающих. Когда тени эритроцитов инкубируют с цитохалазином В, меченным Н, а затем облучают ультрафиолетовым светом, происходит связывание цитохалазина с переносчиком глюкозы за счет поперечных сшивок. Если в среде имеется избыток О-глюкозы, то меченый цитохалазин не взаимодействует с переносчиком. Однако избыток в среде Ь-глюкозы (которая не переносится через мембрану) не влияет на связывание. Если мембранные белки из меченых теней разделить при помощи гель-электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН, то переносчик выявляется в виде размытой радиоактивной полосы в диапазоне молекулярных масс от 45000 до 70000 Да. Если меченые тени до проведения электрофореза обработать ферментом, отщепляющим связанные сахара, то эта размытая полоса исчезает и вместо [c.56]

Чтобы проверить, действительно ли р-галактозидаза высвобождается в результате отщепления убикитина от образовавшегося гибридного белка, вы выделяете с помощью антител нерадиоактивную р-галактозидазу из клеток, содержащих те же три плазмиды. Затем вы подвергаете эти образцы гель-электрофорезу с ДСН, переносите пластины геля на фильтровальную бумагу и проводите реакцию взаимодействия с радиоактивными антителами против убикитина. Как видно из рис. 8-3, антитела к убикитину не взаимодействовали с материалом, соответствующим полосе р-галактозидазы. Однако эти антитела взаимодействовали со всеми полосами, расположенными над р-галактозидазой. Рас- [c.103]

Вы можете найти ответ на этот вопрос, поскольку получил последовательный ряд клонов, который охватывает отрезок длиной 315 т. п. н. ДНК дрозофилы, включающий примерно 12 диет и междисковых участков. В качестве зондов для гибридизации вн можете использовать радиоактивно меченные фрагменты эт клонов, чтобы определить количество комплементарной им ДНК присутствующей в диплоидных тканях и политенных хромосомал Вы выделяете ДНК из диплоидных тканей и политенных хромо сом, обрабатываете равные количества ДНК рестриктазами, взя тыми в различных сочетаниях, разделяете фрагменты путем гель-электрофореза и переносите их на нитроцеллюлозные фильтры дш гибридизации. В каждом случае набор фрагментов, образовавших- ся при рестрикции, одинаков для ДНК из диплоидных ткане и политенных хромосом, как показано на рис. 9-12. Вы измеряем интенсивность полос многих специфических фрагментов, образо- вавшихся при рестрикции, и выражаете результат как отношение интенсивности полос фрагментов из политенных хромосом к ш- тенсивности полос соответствующих им фрагментов из диплоид- ных тканей (рис. 9-13). [c.138]

Стекла довольно маленького размера (обычно 14 см, но с возможным варьированием от 6 см до 20 см) для секвенирующего гель-электрофореза использовались со специальным прибором, рассчитанным на прямое электрофоретическое блоттирование [Веек, Pohl, 1984], Принцип метода заключается в постоянном движении специальной нейлоновой мембраны и ее тесном контакте с нижним срезом геля. Таким образом, фрагмент ДНК, выходя из геля, переносится на данную мембрану и сорбируется в определенном месте. Поскольку используемая длина геля оказывается достаточной для разделения одного фрагмента ДНК, отличающегося на один нуклеотид, от другого, то отпадает надобность в стеклах большого размера, требующих значительно большего времени до выхода образца из геля. После экспозиции данной мембраны с сорбированными на ней фрагментами ДНК на рентгеновскую пленку удается прочитать 500-600 и даже около 1000 нуклеотидов. [c.171]

Ранее схожий метод мультиплексной геномной прогулки был применен для определения нуклеотидной последовательности неклони-рованного гена пируваткиназы Е. соИ [Ohara et al., 1989]. Суть такой прогулки , весьма напоминающей праймерную (описанную ниже в разделе 8.4), заключается в расщеплении тотальной ДНК несколькими подходящими рестрикционными эндонуклеазами, разделении полученных фрагментов в денатурирующем секвенирующем гель-электрофорезе, их переносе на нейлоновый фильтр и многочисленных гибридизациях с мечеными олигонуклеотидами (рис. 8.3). [c.239]

В общем смысле под иммуноблоттингом понимают анализ смеси белков, перенесенных на твердую подложку-мембрану, с которой они связываются ковалентными связями, с последующей иммунодетекцией. Анализировать можно смесь белков, непосредственно нанесенную на подложку, — дот-блот анализ (от англ. dot — пятнышко) — либо после ее предварительного фракционирования методами электрофокусирования, диск-электрофореза или двумерного электрофореза — Вестерн-блот анализ (Western blotting). Такая методология применяется также для отбора клонов бактерий, фагов или вирусов, экспрессирующих продукты целевых клонированных генов. Перенос белков на мембрану осуществляется либо пассивно, либо с использованием аппаратуры для электропереноса. На эффективность переноса белков на мембрану влияет множество факторов, таких как молекулярная масса белков, пористость геля, время переноса и состав используемого буферного раствора (транс-буфера). В зависимости от задач и условий проведения эксперимента подбираются условия переноса, обеспечивающие наилучшие результаты. [c.57]

II тонкослойных пластинках), уступившему было своп позиции электрофорезу в гелях и ЖХВД. Наиболее интересные результаты достигаются при сочетании такого электрофореза с ТСХ в виде двумерного фракционпрования. Аналогичное сочетание с использованием электрофореза в геле возможно, но затруднительно ввиду сложности количественного переноса вещества с геля на пластинку. Впрочем, впечатляющее развитие в последнее время методов переноса веществ из гелей на фильтры ( блоттинга ) может привести к пересмотру этого утверждения. Ниже мы рассмотрим целый ряд примеров использования двумерного фракционирования с участием электрофореза, не фиксируя внимания на общих закономерностях последнего, поскольку он был подробно рассмотрен нами (для гелей) в одной из предыдущих книг серии, а отмечая лпшь те особенности, которые характерны именно для электрофореза на твердых носителях. [c.458]

Саузерн-блотгипг (Southern blotting) Обнаружение специфических нуклеотидных последовательностей путем переноса денатурированных молекул ДНК, подвергнутых электрофорезу, с агарозного геля на нитроцеллюлозный или найлоновый фильтр за счет капиллярного эффекта и гибридизации с меченым зондом, комплементарным искомой последовательности. [c.559]

Смотреть страницы где упоминается термин Гель-электрофорез и перенос ДНК: [c.67] [c.81] [c.344] [c.344] [c.309] [c.68] [c.91] [c.133] [c.22] [c.68] [c.91] [c.300] [c.106] [c.302] [c.64] [c.239] [c.240] [c.81] [c.90] [c.327] [c.98] [c.54]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология