Моноклональные антитела и их применение в анализе

В клетке можно пометить любые молекулы для этого е них вводят один или несколько радиоактивных атомов. Нестабильные радиоактивные атомы распадаются, испуская излучение, что позволяет прослеживать судьбу исследуемых молекул. Применение радиоизотопов в клеточной биологии ограничено двумя видами экспериментов анализ метаболических путей по методу вытеснения метки и локализацией меченых молекул в клетке с помощью радиоавтографии. Антитела представляют собой очень удобный и чувствительный инструмент для локализации специфических биологических макромолекул В организме позвоночных животных продуцируются миллионы различных антител, в каждом из которых имеются участки связывания, опознающие специфические группы молекул. Метод гибридом позволяет получать моноклональные антитела с одинаковой специфичностью практически в неограниченных количествах. В принципе можно получать моноклональные антитела против любых макромолекул в клетке и затем использовать эти антитела для локализации или очистки определенных макромолекул, а в некоторых случаях и для анализа внутриклеточных свойств этих молекул. [c.228]

Последние достижения в развитии новейших технологических приемов значительно расширили наши возможности в определении генетического строения и молекулярной структуры вирусов, а также выявлении сходства штаммов и идентификации различий между вариантами вирусов. Наиболее важные из этих методов — клонирование и определение последовательности нуклеиновых кислот, картирование РНК и пептидов, а также антигенный анализ белков с помощью моноклональных антител. Задача последней обзорной главы данной книги — обсуждение эпидемиологии вируса гриппа в свете применения этих новых методов. Особое внимание уделено оценке последних достижений и изучению вопросов эпидемиологии, которые могут быть успешно решены при использовании молекулярных методов. [c.313]

Моноклональные антитела и их применение в анализе [c.164]

Наиболее простым способом оценки специфичности моноклональных антител в процессе клонирования гибридом является метод непрямого твердофазного иммуноферментного анализа с применением Т8Р-планшетов. ТЗР-планшеты представляют собой полисти-рольные стерильные крышки к 96-луночным культуральным платам, имеющие выступы, опускающиеся в лунки. Поверхность выступов ТЗР-планшетов может быть покрыта в стерильных условиях антигеном. Планшетом накрывают плату, в которой выращивают гибридомы таким образом, чтобы покрытые антигеном выступы опустились в среду культивирования гибридом. Выдерживают 1 ч и заменяют на новый планшет, выступы которого покрыты перекрестно реагирующим антигеном. Дальнейшую обработку ТЗР-крышек проводят в соответствии со стандартной методикой для непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. Используя этот метод, можно в течение одного дня провести оценку способности моноклональных антител взаимодействовать с перекрестно реагирующими антигенами. Это дает возможность уже через 12—15 дней отобрать и клонировать только те гибридомы, которые обладают нужной исследователю специфичностью. [c.172]

Некоторые аспекты иммуноанализа требуют дополнительных комментариев. На чувствительность анализа неблагоприятно влияет противодавление, обусловленное введением образцов. По-видимому, оно связано с тем, что реагент 1 обладает повышенной вязкостью из-за присутствия полиэтиленгликоля. При использовании обводного потока для инъекции или модифицированной системы прокачивания точность измерений может значительно возрасти. Вероятно, чувствительность метода может увеличиться при работе с более сложной оптической системой. Характеристики анализа улучшатся благодаря применению моноклональных антител, а стабильность окрашивания возрастет при обеспечении лучших условий для ферментативной индикаторной реакции. Однако даже и без этих усовершенствований рассмотренная здесь система иллюстрирует эффективность нового подхода к разработке гомогенных методов ИФА. [c.168]

Чрезвычайно широкий спектр применений имеет иммуноанализ для определения как самого факта присутствия, так и измерения количества антигенов, в том числе гаптенов, т.е. низкомолекулярных соединений, к которым можно получить антитела, как правило, путем иммунизации животных конъюгатом гаптена с высокомолекулярным носителем, способным вызывать иммунный ответ. Иммуноанализ нашел широкое применение для анализа содержания различных гормонов, что имеет огромное значение для оценки состояния эндокринной системы человека и животных. Важное значение для оценки состояния окружающей среды, в первую очередь качества питьевой воды и пищевых продуктов, приобретает иммуноанализ содержания пестицидов. В связи с интенсивным развитием гибри-домной техники для анализа определенных антигенов всё более широкое применение находят моноклональные антитела. [c.257]

Хотя, как указывалось выше, клеточные культуры и находили применение в иммунологии, в течение ряда лет использование этой системы осложнялось следующим обстоятельством. Клетки, синтезирующие интересующие исследователей антитела (например, клетки селезенки животных, иммунизированных специфическими антигенами), плохо росли в культуре или совсем не росли, а клетки миеломы продуцировали антитела с неизвестной специфичностью (разд. 15.4). Способность этих двух типов клеток к слиянию позволила в последнее время наладить крупномасштабное производство моноклональных антител (Kohler, Milstein, 1975). Если мышь иммунизировать неочищенным препаратом антигена и затем клетки ее селезенки гибридизовать с клетками миеломы, то среди полученных гибридных клеток найдется по крайней мере одна, продуцирующая антитела, специфические к исходному антигену. Эта клетка может быть клонирована (разд. 8.1) и трансплантирована в мышь в форме опухоли, продуцирующей высокоспецифические антитела в количестве, измеряемом граммами. Представляя безусловный интерес для иммунологов, это, кроме того, дает возможность биохимику получать антитела к материалу, который он не может должным образом очистить. Такие антитела могут быть, в частности, использованы для генетического анализа антигенов поверхности клеток человека (Barnstable et al., 1978). [c.12]

Применение моноклональных антител для иммуноанализа пептидов требует большой осторожности, поскольку высокоспецифичные моноклональные антитела могут взаимодействовать, например, только с одним из изогормонов. По этим же причинам нельзя использовать слишком специфичные моноклональные антитела и для аффинной очистки пептидов. Кроме того, существует опасность разрушения образца при его элюировании с аффинной колонки под действием pH и ионной с ы раствора. И наконец, следовые количества антител могут загрязнять очищенный продукт и влиять на результаты анализа. [c.35]

Ситуация резко изменилась после введения неизотопных меток для регистрации реакции антиген - антитело [5 ], и особенно после применения моноклональных антител в двухцентровом им-мунометрическом анализе белков [б ]. Необходимость создания высокочувствительных методов иммуноанализа для научных исследований, а также более простых методик для проведения анализов в поликлиниках, полевых условиях и для самодиагностики также содействовала бурному развитию твердофазных методов. Носители, применяемые в этих анализах, могут быть выполнены в виде трубок, шариков, мелких гранул, микропланшетов, полосок, пленок и электродов. [c.53]

Во-первых, в зависимости от области применения существует возможность выбора наиболее подходящего и удобного источника получения моноклональных антител культуральной или асцитной жидкости. При использовании препаратов асцитной жидкости возникают определенные трудности при интерпретации полученных результатов, обусловленные примесью естественных мышиных антител к моноклональным антителам (высокие фоновые уровни). Однако в 1 мл асцитной жидкости содержится несколько мг МКА. Поэтому, когда используют разведение 1 1000 или более, значительная часть посторонних мышиных антител удаляется разбавлением. Иногда необходимо полностью удалить из препарата примесь естественных иммуноглобулинов (например, при использовании моноклональных антител для выделения и очистки небольшого количества белкового антигена с целью биохимического анализа). В последнем случае предпочтительно выделять моноклональные антитела из культуральной жидкости. При использовании в иммунологических реакциях асцитной жидкости следует иметь в виду присутствие посторонних фоновых антител. В некоторых случаях в организме мыши может существовать высокий титр природных антител, реагирующих с антигеном, специфически распознаваемым моноклональными антителами. При использовании асцитной жидкости возникают и проблемы неспецифического характера. Например, культуральная жидкость дает более ясное и точное окрашивание образца в иммуногистологических исследованиях. [c.148]

Быстрое развитие иммунологии нашло свое отражение в данной, третьей книге из серии Иммунологические методы , которая включает изложение экспериментального опыта, накопленного в Базельском институте иммунологии. В нее входят пять глав, посвященных применению рекомбинантных ДНК в иммунологии в двух главах описано использование высокоэффективной жидкостной хроматографии для разделения белков отдельные главы касаются следующих вопросов применение моноклональных антител для идентификации мембранных антигенов лимфоцитов, типирование антигенов гистосовместимости, новые методы анализа белков с помощью двумерного электрофореза, лимфокины, поддерживающие рост В-клеток. В четырех главах описано получение и ведение линий клонированных В- и Т-кле-ток и гибридом, а еще в четырех обсуждаются новые методы детектирования клеток, продуцирующих ревматоидный фактор. Две главы посвящены таким общим иммунологическим методам, как флуоресцентный сортинг клеток и анализ методом лимитирующих разведений, и наконец, четыре последние главы касаются сложных методов, используемых при работе с определенными видами животных (птицами, овцами и амфибиями) для изучения специальных иммунологических вопросов. [c.7]

Одна из наиболее трудных проблем при цитометрии связана с неспецифическим окрашиванием. Клеточный сортер с чрезвычайно высокой чувствительностью детектирует флуоресцирующие молекулы — обычно с большей, чем глаз. Поэтому реагенты, используемые при работе с сортером, должны быть более высокой степени очистки, чем для других методов анализа. Как правило, гетерологичные сыворотки должны подвергаться очистке на аффинных сорбентах даже в тех случаях, когда они достаточно специфичны для непосредственного использования при флуоресцентной микроскопии. Моноклональные антитела не всегда требуют очистки. Мы с успехом использовали супернатанты многих продуцирующих моноклональные антитела гибридом, которые культивировали в средах с добавлением и без добавления сыворотки, а также асцитные жидкости (конечно, в соответствующем разведении). В случае непрямых методов флуоресцентного окрашивания влияние контаминирую-щих молекул в культуральных жидкостях сводится к минимуму. Если конъюгированные с флуорохромом антитела строго специфичны по отношению к иммуноглобулинам, то даже при связывании клетками молекул, не относящихся к иммуноглобулинам, эти молекулы не будут детектироваться (по флуоресценции). В случае применения асцитных жидкостей активность моноклональных антител обычно настолько высока, что эффекты контаминирующих иммуноглобулинов и других компонентов чаще всего не выявляются. Однако при прямом конъ-югировании препаратов антител с флуорохромом наличие в них белковых примесей неиммуноглобулиновой природы может стать причиной высокого уровня неспецифического окрашивания. Следовательно, любой конъюгат используемый при сортинге клеток, должен быть тщательно очищен. [c.332]

Следует обратить внимание читателей на те основные тенденции развития иммуноферментного анализа, которые прослеживаются в представленной книге сокращение времени анализа и упрощение методик благодаря переходу к гомогенным методам анализа применение двойных меток (два фермента, фермент и якорная группа и т. д.), которые повышают специфичность детектирования ферментной метки использование моноклональных антител и множественный антигенный анализ для повышения специфичности иммунохимической стадии детектирования. Принципиально новым является создание методов иммунохроматографии, в которых концентрация вещества определяется не по активности ферментного конъюгата, а по его хроматографической подвижности. [c.6]

Благодаря многочисленным преимуществам, связанным с применением моноклональных антител, особенно в системах с использованием меченых антител, происходит быстрое вытеснение обычных поликлональных антисывороток моноклональными антителами (Sevier, 1982). Однако следует сразу отметить, что использование моноклональных антител практически не дает преимуществ для систем анализа, основанных на применении меченых антигенов (например, в случае конкурентного ИФА) (Wu et al., 1983). Небольшими преимуществами в данном случае оказываются лишь наличие надежного источника стандартных препаратов антител и снятие проблемы перекрестной активности при использовании моноклональных антител с достаточно высокими константами связывания. [c.385]

Гибридные клетки, продуцирующие моноклональные антитела, фактически бессмертны. Они прекрасно приспособлены для роста в культуре или опухолевого развития в организме животного. Применяя стандартные методы работы с культурами клеток, можно обеспечить практически неограниченную наработку моноклональных антител. Это важнейшее преимущество моноклональных антител по сравнению с поликлональными с точки зрения возможностей применения в иммунометрическом анализе. [c.386]

Использование меченых моноклональных антител для проведения ферментативного иммунометрического анализа связано с преимуществами двух типов. В первую очередь мы обсудим преимущества, которые представляют методы, основанные на работе в условиях избытка любых антител, затем — преимущества, которые в связи с этим дают возможность применения в качестве избыточного реагента моноклональных антител. [c.386]

Преимущества, присущие моноклональным антителам, обусловлены их гомогенностью. При работе в условиях избытка реагентов преимущества метода меченых антител достаточно очевидны. Во-первых, при использовании иммобилизованных на носителе антител, эффективно осуществляющих первичный захват тестируемого антигена, значительно ослабляется, а в некоторых случаях и полностью подавляется эффект насыщения, называемый эффектом загиба в области высоких концентраций (Ryall et al,, 1982), С проблемой насыщения приходится сталкиваться практически в любой системе прямого тестирования. В связи с этим создание системы анализа, в которой эта проблема исключается, имеет особо важное значение. Использование моноклональных антител позволяет одновременно легко получить сорбенты с очень высокой емкостью и вводить в систему меченые антитела в высокой концентрации. Для систем, работающих в режиме избытка антител, характерны не только быстрое выполнение анализа и высокая чувствительность определения, но и возможность использования тестируемого антигена в чрезвычайно широком диапазоне концентраций. Концентрационный диапазон, охватываемый в системах анализа, основанных на применении меченых антител, обычно в 3—10 раз шире диапазона, доступного для конкурентного анализа с применением меченого антигена. [c.388]

Введение моноклональных антител в систему анализа, основанную на применении меченых антител, позволяет улучшить большую часть характеризующих ее параметров. Химическая гомогенность моноклональных антител обеспечивает надежность и воспроизводимость анализа. Кроме того, использование для иммунометрического анализа моноклональных антител, конъюгированных с ферментом, позволило приблизиться к реализации режима кинетики первого порядка (Вагапу, 1980). Порядок химической реакции соответствует показателю степени у величины концентрации реагента в кинетическом уравнении. Реакциям, скорость которых постоянна и не зависит от концентрации, соответствует нулевой порядок. Если концентрация одного из реагентов лимитирована, то скорость реакции оказывается пропорциональна его концентрации. Если лимитирующими оказываются два или три реагента, то скорость реакции зависит от концентрации каждого из реагентов и кинетика реакции приобретает сложный характер. [c.389]

Моноклональные антитела благодаря таким свойствам, как химическая гомогенность, высокая аффинность и доступность в больших количествах, могут весьма эффективно использоваться для иммунодиагностических тестов. Названные особенности моноклональных антител в сочетании с применением ферментативных иммунометрических вариантов тестирования позволяют при проведении клинических анализов с высокой точностью, чувствительностью и надежностью количественно определять тестируемый антиген. При удачном выборе индикаторного фермента процесс анализа может существенно упроститься за счет калибровки по одному положительному стандарту. Помимо повышения эффективности уже существовавших методов анализа с помощью моноклональных антител удается выявить новые антигенные детерминанты, появление которых связано с протеканием раковых и других заболеваний. Таким образом, химическая однородность моноклональных антител открывает перед исследователями практически неограниченные возможности. [c.399]

Гистологический анализ опухолей человека в больщинстве случаев показывает, что они инфильтрированы клетками зоны воспаления (рис. 20.8). В инфильтрате обычно доминируют лимфоциты и макрофаги, но могут присутствовать и клетки других типов, в том числе дендритные клетки, фанулоциты и тучные клетки. Более точный анализ типов составляющих опухоли клеток с применением моноклональных антител (мАт), позволяющий выявлять субпопуляции лимфоидных клеток (рис. 20.9). показывает, что в опухолях может присутствовать больщинство основных субпопуляций лимфоцитов. [c.382]

В процессе фундаментальных исследований механизмов синтеза иммуноглобулинов, проводимых с применением клеточных культур и гибридологического анализа, выявились закономерности, практическое применение которых произвело революцию в иммунологии [1]. Был найден подход, позволяющий получать практически в неограниченных количествах моноклональные антитела (МонАТ) с известной специфичностью. Суть новой технологии состоит в получении гибридов между клетками миеломы и нормальными В-лимфоцитами от доноров, иммунизированных определенными антителами. В таких гибридах (гибридомах), которые при культивировании бессмертны , продуцируются гомогенные антитела против индивидуальных эпитопов антигена. [c.194]