Анализ результатов определения антигена

Л. а. используют в иммунохим. анализе для определения антител, гормонов, лек. препаратов, вирусных и бактериальных антигенов по концентрации комплекса антиген-антитело. При этом в иммунном флуоресцентном анализе к антителу непосредственно присоединяют флуоресцирующие в-ва, напр. РЗЭ, флуоресцирующие красители (чувствительность метода 10" моль/л), а в иммуноферментном анализе к антителу присоединяют фермент и в результате ферментативной р-ции, сопровождаемой биолюминесценцией, определяют ферментативную активность (чувствительность метода 10" моль/л). [c.614]

Очевидно, что при разработке гомогенного иммуноферментного анализа для определения макромолекул следует учитывать размеры антигена. Нельзя ожидать, что связывание антител с антигеном, меченным при помощи фермента, скажется на ферментативной активности по отношению к малому субстрату, так как массивный антиген не передает воздействия ферменту. Однако в случае крупного субстрата присоединение антител, вероятно, приведет к ингибированию в результате стерического [c.103]

Бернет считал, что такое разнообразие вызывается мутациями в определенной линии клеток крови в ходе эмбрионального и постнатального развития животного. После того как была выяснена четвертичная структура и природа изменчивости молекул антител, теория Бернета была перефразирована следующим образом мутации, которые селекционирует антиген, возникают в генах, определяющих структуру легких и тяжелых цепей антител, причем в той части этих генов, которая соответствует вариабельным участкам полипептидных цепей. На фиг. 255 представлены результаты анализа аминокислотной последовательности вариабельного фрагмента легкой цепи у различных молекул антител человека. Видно, что эти данные очень напоминают аминокислотные замены, обнаруженные у мутантов по белку оболочки вируса табачной мозаики (фиг. 217). Легкие цепи отличаются друг от друга по разным положениям полипептидной цепи, и если сопоставить эти различия с таблицей генетического кода (табл. 27), то видно, что все они могут быть объяснены заменами одиночных оснований в триплетах. Таким образом, характер изменчивости первичной структуры белков антител находится в соответствии с мутационной гипотезой Бернета. [c.521]

Хотя в последние годы опубликовано немало статей, описывающих преимущества ФИА, соответствующие наборы и приборы стали выпускать в промышленном масштабе только недавно. Флуоресцентные метки значительно дешевле изотопных, срок годности наборов ФИА намного больше, чем наборов РИА, а флуоресценцию можно измерять на простых флуориметрах. Многие достоинства ФИА свойственны и методам ИФА (доступность методик ковалентного связывания ферментов с антигенами или антителами, стабильность меченых продуктов, безопасность и др.). Главный недостаток ИФА связан со способом измерения результата анализа, а именно с необходимостью дополнительной операции определения активности фермента с помощью соответствующего субстрата. Эта операция усложняет и замедляет анализ и в принципе может сни- [c.139]

Сначала все слияния клеток проводят с предельно допустимыми разведениями популяции клеток — продуцентов МА против антигенов клеточных поверхностей. Последующий анализ обычно дает достаточно определенные результаты для того, чтобы можно было отобрать гибридные клоны, представляющие интерес. Этот этап не прост, если учесть, что первичная иммунизация крыс клетками мышиных лимфом требует 200—300 лунок с растущими клонами. Такое количество образцов нетрудно проверить с помощью ИФМ, однако приблизительно 5—20% лунок содержат клоны, продуцирующие МА против неизвестных мембранных компонентов. Поэтому следует проводить и негативный отбор, чтобы отбраковать клоны, которые секретируют МА к общим для всех клеток поверхностным антигенам. После того как с помощью ИМФ отбирают клоны, позитивные [c.179]

Результаты определения абсорбции антител к ОХ-45 тканевыми гомогенатами, представленные на рис. 5.6, Л, показывают, что антигенная активность ткани селезенки в пересчете на 1 мг белка примерно вдвое превышает антигенную активность тимуса и в 20 раз — активность мозговой ткани. На рис. 5.6,5 представлены результаты определения абсорбции антител препаратом несолюбилизированных мембран крысиных спленоцитов и дезоксихолатным экстрактом тех же мембран. Дезоксихолат несколько смещает кривую торможения связывания антител в сторону уменьшения антигенной активности в расчете на белок, однако данный метод анализа вполне пригоден для определения сорбции и выхода антигена в процессе аффинной хроматографии. [c.184]

Для скрининга больших семейств или аутбредных популяций Xenopus на наличие определенных антигенов иногда наилучшим методом оказывается гемагглютинация с соответствующими аллоантисыворотками. Антисыворотки лягушек часто являются слабыми, и поэтому при их использовании необходимы высокочувствительные методы анализа. Хорошие результаты получают при постановке опытов по следующей методике. [c.496]

При смешивании липосом с антителами и комплементом высвобождается заключенная в липосомы пероксидаза хрена, активность которой измеряют при помощи кислородного электрода. Свободный теофиллин, содержащийся в образцах, мешает связыванию антител с липосомами и, таким образом, снижает литическую активность системы комплемента. В результате уменьшается скорость расходования кислорода. Это позволяег построить калибровочную кривую для надежного определения свободного лекарственного препарата в интервале 4—40 нМ. (рис. 9-2). Важно, что высокая чувствительность достигается, при использовании дешевой электродной системы детектирования. Столь же обнадеживающие результаты были получены при анализе тироксина и IgG в сыворотке спектрофотометрическим методом на основе комплемента (Braman et al., 1984), Использованные липосомы были покрыты специфическими антигенами и содержали щелочную фосфатазу. Авторы показали, что результаты определения тироксина и IgG этим методом довольно-хорошо коррелируют с результатами радиоиммунологического-анализа. По-видимому, фермент, активность которого демаскируется комплементом, остается в данном случае внутри липосом, но они становятся проницаемыми для субстрата. [c.125]

После удачного слияния клеток необходимо провести быстрый и эффективный скрининг гибридом. В большинстве случаев дл-ч слияния требуются три этапа скрининга, и поскольку для каждого эксперимента используется свыше 500—1000 лунок, это означает, что для выявления наличия специфических антител нужно проанализировать до 3000 проб. Кроме того, кинетика роста гибридных клеток такова, что результаты скрининга должны быть известны в течение первых 48 ч после отбора проб. Единственный реальный способ обработать такое количество проб — использование метода, который позволяет провести скрининг, дающий визуальные результаты, на планшетах с лунками маленького объема. Скрининг не обязательно дает абсолютно однозначные результаты и допускается выявление некоторого количества ложных положительных клонов. Затем его можно повторить и получить более определенный ответ, работая только с относительно небольшим количеством проб, давших положительный ответ при первом скрининге. Один из наиболее удобных методов скрининга — твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA), при котором антиген наносится на дно лунок пластикового планшета он связывает антитела, продуцируемые гибридомой, а наличие этого комплекса обнаруживается с помощью антител к иммуноглобулинам, конъюгированных с определенным ферментом. Описание иммуноферментного анализа (ИФА) приведено в табл. 6.6. [c.185]

Описанные в данной главе эксперименты свидетельствуют в пользу использования in vitro мутагенеза клонированных генов НА для изучения функции гидрофобных областей белка. Существуют многочисленные возможности распространения этой технологии на другие участки молекулы, включая пептид слияния, антигенные сайты, сайт связывания рецептора и точки прикрепления углевода. Точный анализ роли индивидуальных аминокислот в структуре и функции белка может быть проведен при введении изменений в одном основании в определенных сайтах в гене НА с использованием олигонуклеотидуправляемого мутагенеза [32]. Хотя подобные эксперименты будут особенно уместны для нашего анализа молекулы НА, эти дополнительные результаты весьма ценны для понимания структуры и функции цельных мембранных белков в общем смысле. Не говоря об особенных свойствах, связанных с антиген-ностью и биологическим значением, структура молекулы НА характерна для основного класса клеточных мембранных белков. Более того, поскольку биосинтез НА включает ферменты клетки хозяина и процессы во время трансляции, мембранного транспорта, гликозилирования и созревания, НА представляет собой полезную модель для изучения мембранных белков и органелл. [c.184]

Изучение проблемы распознавания антигена В-клетками не вызвало особых экспериментальных осложнений. Легкость обнаружения мембранного иммуноглобулина у данного клеточного типа давала в руки исследователей основу для детального анализа явления. При этом поиск аналогичных структур у Т-клеток столкнулся с определенными трудностями. Использование тех же экспериментальных подходов, которые применялись при изучении антигенных рецепторов у В-клеток, не привело к положительным результатам. Первые шаги к решению проблемы были сделаны, как это ни странно, не в молекулярной иммунологии, а в клеточной — в эмпериментах с генетически отличаюицшися клетками, взаимодействующими in vitro. [c.85]

Применение в ИФА антигенов и антител, иммобилизованных на нерастворимых носителях, дает возможность эффективно разделять компоненты аналитической системы перед стадией определения концентрации ферментной метки. Такой подход универсален и может применяться для широкого круга соединений — от гаптенов до микробных клеток. Однако нерастворимые иммуносорбенты имеют и некоторые отрицательные стороны, а именно 1) возможность неспецифического связывания компонентов с носителем 2) значительное время анализа (до нескольких часов) из-за длительности реакции антиген — антитело, определяемое низкой концентрацией иммобилизованного агента- (например, при использовании непористых сорбентов — полистирольных плат или пробирок) или диффузионными затруднениями при использовании пористых сорбентов (сефароза, пористое стекло, силохром и т. д.) 3) методические сложности, связаниью с трудностями точного дозирования и промывок иммуносорбентов па основе пористых носителей 4) существенное влияние неоднородности сорбциоииых свойств полимерных носителей (микроплаты и пробирки из полистирола, поливинилхлорида, полиметилметакрилата и т. д.) на точность и воспроизводимость результатов анализа. [c.111]

Отсюда определенный интерес представляет использование в анализе иммуносорбентов, полученных путем аффинного связывания специфических антител с иммобилизованным на носителе антигеном. Связь антиген — антитело обратима, поэтому для предотвращения смывания антител с сорбента разработаны пути последующего ковалентного закрепления молекул, образовавших специфический комплекс на носителе. Для стабилизации комплекса эффективно применяются обычные сшивающие агенты глутаровый альдегид, диазиды, изоцианаты. Процедура иммобилизации включает инкубацию связанного с носителем антигена с антисывороткой, отмывку носителя, проведение реакции с сшивающим антигеном и заключительную отмывку для удаления избытка (рис. 24). Процесс может проводиться как в реакторах перемешивания, так и в колоночном режиме. Данный подход детально изучен на примере иммобилизации антител против сывороточного альбумина человека на сефарозном сорбенте. В результате такого связывания по крайней мере половина активных центров иммобилизованных антител способна принимать- участие в последующих реакциях с антигеном, что является недостатком метода. Однако [c.210]

Ферментативную активность измеряли амперометрическим определением скорости окисления NADH на платиновом электроде. Возможности методики были продемонстрированы на примере модельной системы лидокаин-антитела к лидокаину, калибровочная кривая которой получена вплоть до ианограммовых количеств антител. Абсолютная чувствительность анализа зависит от начального количества конъюгата антиген-фермент. Показано, что возможное загрязнение платинового электрода, обусловленное адсорбцией белков, и перекрестные реакции антител практически не влияют на результат анализа. [c.217]

Во-первых, в зависимости от области применения существует возможность выбора наиболее подходящего и удобного источника получения моноклональных антител культуральной или асцитной жидкости. При использовании препаратов асцитной жидкости возникают определенные трудности при интерпретации полученных результатов, обусловленные примесью естественных мышиных антител к моноклональным антителам (высокие фоновые уровни). Однако в 1 мл асцитной жидкости содержится несколько мг МКА. Поэтому, когда используют разведение 1 1000 или более, значительная часть посторонних мышиных антител удаляется разбавлением. Иногда необходимо полностью удалить из препарата примесь естественных иммуноглобулинов (например, при использовании моноклональных антител для выделения и очистки небольшого количества белкового антигена с целью биохимического анализа). В последнем случае предпочтительно выделять моноклональные антитела из культуральной жидкости. При использовании в иммунологических реакциях асцитной жидкости следует иметь в виду присутствие посторонних фоновых антител. В некоторых случаях в организме мыши может существовать высокий титр природных антител, реагирующих с антигеном, специфически распознаваемым моноклональными антителами. При использовании асцитной жидкости возникают и проблемы неспецифического характера. Например, культуральная жидкость дает более ясное и точное окрашивание образца в иммуногистологических исследованиях. [c.148]

По-видимому, нецелесообразно использовать совершенно неочищенные препараты антигена, при иммобилизации которых с анализируемыми антителами будет взаимодействовать лишь незначительная часть связавшегося с поверхностью носителя материала. И хотя для получения удовлетворительных результатов в тестах рассматриваемого типа высокоочищенные препараты антигена, как правило, необязательны, известно, что с повышением степени очистки исходного антигена в определенных пределах повышается и эффективность анализа. При диагно стировании инфекционных заболеваний следует также иметь в виду, что при той или иной инфекции в иммунном ответе могут участвовать различные схемы взаимодействия антиген — анти тело. При этом некоторые из них имеют большее, а другие меньшее значение. [c.195]

Влияние концентрации антигена на неспецифическое связывание. На первом этапе компоненты образца и компоненты системы определения могут связываться непосредственно с полистиролом даже в присутствии 0,05% твина-20 (неопубликованные данные). Непосредственное связывание компонентов образца может приводить к дополнительному артефактному обнаружению иммуноглобулинов, не обладающих специфичностью к данному антигену, а адсорбция на пластике самих компонентов системы определения вызывает фоновое связывание, которое может существенно искажать кривые титрования. Оба названных процесса протекают не очень интенсивно и, вероятно, оказывают лишь незначительное влияние на точность определения в системах ELISA с относительно низкой чувствительностью. Однако в случае систем, предназначенных для тестирования специфических антител в низких концентрациях, эти же процессы могут очень значительно искажать результаты анализа. [c.220]

Хотя, строго говоря, метод ИААК должен быть отнесен к классу гетерогенных ИФА, этап разделения связанных и свободных реагентов в этом методе осуществляется настолько просто и быстро (особенно при использовании соответствующего оборудования), что позволяет сопоставить его с современными вариантами гомогенного анализа. Время инкубации после добавления к образцу препарата моновалентных антител, конъюгированных с ферментом, определяется главным образом концентрациями антител и антигена, поскольку их взаимодействие в данном случае представляет собой простую обратимую бимолекулярную реакцию, зависящую только от диффузии. В табл. 15-1 представлены результаты расчета скорости взаимодействия антиген — антитело в зависимости от их относительного содержания в реакционной смеси. Единственным допущением при расчетах является величина константы скорости прямой реакции ЫО л моль -с выбранная на основании данных, полученных для большинства исследованных систем взаимодействия небольших антигенов с антителами (Pe ht, 19 2). Из расчетных данных табл. 15-1 следует, что даже для определения тестируемого компонента, концентрация которого не превышает пикомолярного уровня, использование большого избытка конъюгата [фермент—антитело] (на наномолярном уровне) позволяет ожидать быстрого количественного связывания и завершения анализа не более чем за 5—10 мин. Кривая, построенная на основании изучения кинетики связывания дигоксина с мономерным конъюгатом [Fab — -галактозидаза] (рис. 15-2), подтверждает справедливость расчетных оценок. Концентрации дигоксина и конъюгата в этих экспериментах составляли 0,2 нМ и 10 нМ соответственно. Как видно на ри- [c.249]

Пример 10-И. Определение мутантных белков или белковых фрагментов при помощи перекрестных реакций. Белки из мутантных генов содержат либо новую аминокислоту вместо определенной аминокислоты, присутствующей в белке дикого типа, либо фрагменты нормального белка, если мутация вызывает терминирование цепи. В обоих случаях активность белка (например, ферментативная) теряется, в результате чего биохимический анализ оказывается несостоятельным. Если измененный белок или фрагмент продолжает содержать ту же антигенную детерминанту (например, аминокислотную последовательность), что и белок [c.267]

Смотреть страницы где упоминается термин Анализ результатов определения антигена: [c.128] [c.12] [c.374] [c.393] [c.179] [c.197] [c.152] [c.257] [c.213] [c.147] [c.132] [c.323] [c.44] [c.26] [c.106] [c.124] [c.215] [c.174] [c.49] [c.257] [c.368] [c.398] [c.132] [c.323] [c.158] [c.62] [c.209]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология