Седиментация в градиенте плотности

Метод равновесной седиментации в градиенте плотности основан на следующем. Если поместить в ячейку центрифуги смесь низкомолекулярных жидкостей (растворителей) различной плотности, то при сильном центробежном ускорении (более 10 м/с ) через некоторое время в кювете установится седиментационное равновесие, т.е. в радиальном направлении возникнет постоянный во времени градиент плотности. Если в таком бинарном растворителе содержится полимерный компонент с плотностью, промежуточной между плотностями элементов растворителя, то полимер начнет собираться в полосы в тех местах кюветы, где его плотность равна плотности бинарного растворителя. Чем ниже молекулярная масса, тем больше коэффициент диффузии и тем сильнее размывается эта полоса (изоденса). Для сополимеров (если сомономеры имеют разные плотности) в результате установления равновесия могут появиться несколько полос макромолекулы с различной плотностью соберутся в разные полосы. Следует отметить, что метод применим для молекулярных масс выше критической, иначе ширина полосы становится соизмеримой с длиной ячейки. [c.325]

Мы видим, что диффузия служит одним из определяющих факторов в седиментационных процессах. В методе, основанном на измерении скорости седиментации, необходимы прямые определения коэффициента диффузии О. Диффузия создает возможность определения М в методе седиментации в градиенте плотности. Вместе с тем изучение диффузии дает информацию о подвижности макромолекул и, тем самым, об их геометрических и гидродинамических свойствах. [c.154]

Равновесная седиментация в градиенте плотности [c.489]

Плотность ДНК, измеренная методом седиментации в градиенте плотности хлористого цезия, также является линейной функцией содержания пар ГЦ. При измерениях в градиенте плотности на ширину слоя ДНК влияют два фактора — диффузия и гетерогенность образца. Так как уширение, обусловленное диффузией, зависит от молекулярного веса, влияние диффузии можно приблизительно учесть. Влияние гетерогенности образца на уширение для ДНК бактерий невелико если выразить его через содержание пар ГЦ, то оно составит всего несколько молярных процентов, что много меньше интервала в 50 мол.%, в пределах которого отличаются по содержанию ГЦ образцы ДНК, полученные из различных бактерий. Это объясняется тем, что, хотя содержание ГЦ в ДНК из различных бактерий сильно варьирует, молекулы ДНК одного и того же препарата различаются по содержанию ГЦ сравнительно мало. Как и следовало ожидать, у более сложных организмов ДНК оказывается более гетерогенной по содержанию ГЦ, чем у простых. В клетках млекопитающих гетерогенность ДНК по содержанию ГЦ достигает порядка 10%. [c.323]

Г. Седиментация в градиенте плотности [c.242]

Рис. 1.9. Принципиальная схема равновесной седиментации в градиенте плотности (плотности компонентов трех компонентной системы Р1<Рп<Р2)-а — положение компонентов при установившемся равновесии б — распределение плот" ности виг — интегральная С (х) и дифференциальная йС йх = / (х) кривые распределения концентрации полимера.

Подобрать 0-растворитель для полимеров, различающихся по химическому составу, часто невозможно, поэтому подбирают условия, близкие к 0-условиям, и экстраполируют результаты к общей концентрации полимера С = 0. Интересно исследование седиментации в градиенте плотности вблизи критической точки раствора [64]. [c.34]

Ф н г. 203. Кривая седиментации в градиенте плотности сахарозы рибосом, освобожденных после лизиса и умеренного гомогенизирования клеток ретикулоцитов кролика, к которым за 45 с до лизиса (при 37 С) добавили С-аминокислоты. [c.409]

Формальная сторона вопроса о влиянии избирательной сольватации на седиментацию в градиенте плотности была исследована Болдуином [8]. В дополнение к очевидному эффекту смешения изоденсы, предсказываемому формулой (6.116), сольватация приводит к изменению ее ширины, так что [c.492]

Формулы (6.112), (6.113) и (6.114) позволяют определить из опытов по равновесной седиментации в градиенте плотности молекулярный вес и полидисперсность состава, а формулы (6.116) и (6.118)—избирательную сольватацию. [c.492]

Отметим, наконец, что равновесная седиментация в градиенте плотности, как и обычное седиментационное равновесие, может использоваться для определений молекулярного веса [ср. формулы (6.112) и (6.117)]. Однако при этом следует считаться с тем, что локальная концентрация полимера в области изоденсы высока и пренебрежение термодинамической поправкой (пропорциональной второму вириальному коэффициенту Лг) приводит к сильным искажениям при расчетах. Так, в работе [84] для системы хлороформ — бензол было получено сильно завышенное, а для системы ДМФ — хлороформ — заниженное значение Л1 . Авторы объясняют это наличием агрегативных тенденций (Лг < 0) в первой системе и большими положитель- [c.493]

Метод спинового расщепления в ближайшем будущем, несомненно, расширит возможности применения метода ЯМР, и не исключено, что именно таким образом проблема будет окончательно решена. Однако потенциальные возможности методов инфракрасного дихроизма и седиментации в градиенте плотности еще не были полностью раскрыты, и нужно также учитывать возможность конкуренции этих методов . [c.31]

Фиг. 205. Кривая седиментации в градиенте плотности сахарозы рибосом, выделенных из ретикулоцитов кролика так же, как описано в подписи к фиг. 203, но подвергну-"ых перед центрифугированием краткой обработке рибонуклеазой.

Для биофизики важен метод седиментации в градиенте плотности. В концентрированном растворе низкомолекулярного но-щества (в СзС1, в сахарозе и т. д.) при ультрацентрифугироиа-нии устанавливается градиент концентрации, т. е. градиент плотности растворителя макромолекул фо/йх. В таком растворе мак[)о-молекулы будут располагаться в той части кюветы, в которой 5 = 0, т. е. согласно (3.66), Умро = 1 или ро = рм- Иными словами, макромолекулы локализуются в той области кюветы, где плотность концентрированного раствора совпадает с плотностью макромолекул (р измеряется непосредственно). Гетерогенная смесь макромолекул разделяется и наблюдается спектр плотностей. Этот метод с большой эффективностью применяется при изучении нуклеиновых кислот. [c.82]

Метод седиментационного равновесия в качестве абсолютного метода онределения молекулярных весов полимеров обладает рядом достоинств. Силовое поле ультрацентрифуги обусловливает осаждение крупных частиц типа пыли, но в то же время практически весьма слабо влияет на низкомолекулярные включения в образце. На довольно малом количестве полимера можно измерить молекулярные веса, изменяюш иеся от нескольких сотен до нескольких миллионов, а также получить обш ую картину степени полидисперсности. Недостатки метода, обусловленные большим временем эксперимента и трудностями при исследовании достаточно низких концентраций образцов, применяемых для надежной экстраполяции к бесконечному разбавлению, могут оказаться не столь суш ественнымй, если применять идеальные растворители и использовать появившиеся возможности быстрого достижения равновесных условий седиментации. В то время как метод скоростной седиментации обладает большей чувствительностью к тонким характеристикам распределений по молекулярным весам, метод седиментационного равновесия применяют главным образом для определения средних молекулярных весов, хотя использование этого метода в случае смешанных растворителей (седиментация в градиенте плотности), как недавно было показано, перспективно для определения наличия в образце других типов неоднородности. [c.238]

В принципе возможны три механизма редупликации ДНК [162] консервативный с сохранением исходной двойной спирали и созданием новой дочерней спирали, полуконсервативный (см. стр. 496) и дисперсный с равномерным распределением исходного материала между четырьмя цепями двух дочерних двойных спиралей (см. [6]). Месельсон и Сталь изучали редупликацию ДНК при делении клеток Е. соИ с помощью меченых атомов и седиментации в градиенте плотности s l [76]. Была получена популяция клеток, меченных N . В период интерфазы митоза эти клетки переносились в среду, содержавшую (но не N ), и в ней делились. Из исходной популяции детей и внуков извлекалась ДНК и определялась ее плотность и радиоактивность. Исходная ДНК имела наибольшую плотность и была мечена N . ДНК детей оказалась меченной наполовину и ее плотность равнялась среднему арифметическому плотностей N -ДНК и N -ДНК- Наконец, ДНК внуков разделились при седиментации на две зоны — на зону с ДНК, меченную N и зону ДНК, содержащую оба типа ДНК. Эти результаты точно согласуются с полуконсерватквным механизмом. [c.536]

Для определения состава и строения Б. используют также УФ- и ИК-спектроскопию, рентгенографию, дифференциальный термич. анализ, а также пикнометрич. и рефрактометрич методы исследования, основанные на правиле аддитивности уд. объемов и уд. рефракций компонентов Б. Достаточно успешно используется и метод ЯМР, к-рый значительно облегчает точное установление состава и строения Б. Для определения мол. массы и композиционной неоднородности Б. типа (А) — (В), в нек-рых случаях (прп подборе растворителей с учетом показателей преломления компонентов Б.) м. б. использован метод светорассеяния. Точный, но довольно сложный метод количественного анализа Б.— равновесная седиментация в градиенте плотности с использованием ультрацентрифуги. Данные о составе и строении Б. могут быть получены и при изучении нек-рых их физико-механич. свойств (напр., термомеханических). [c.136]

Метод седиментации в градиенте плотности СзС1 применяют, в частности, для разделения Н - и М -ДНК. В результате центрифугирования получают два отдельных пика, соответствующих разности в плотностях, равной всего 0,014 г/см . Относительные количества ДНК каждого типа определяют посредством фотографирования в ультрафиолете (интенсивность поглощения рассчитывают по степени почернения фотопластинки). Метод седиментации в градиенте плотности позволяет также изучать нуклеотидный состав ДНК из разных источников, поскольку различия в нуклеотидном составе приводят к различиям в плотности. (Препараты ДНК, содержащие большое количество пар гуанин — цитозин, обладают более высокой плотностью, чем препараты с высоким содержанием аденина и тимина.) Эти работы будут рассмотрены более подробно в разд. 3 и 4 гл. ХУП1. Применение описанного метода к белкам встречает ряд затруднений, связанных с тем, что молекулярный вес белков составляет всего 1% от молекулярного веса ДНК и они образуют в растворах с таким же градиентом плотности очень широкие полосы (в 10 раз шире, чем ДНК). Такая полоса может занять всю ячейку. Осаждение белков с помощью сульфата аммония, добавляемого в небольших количествах, позволяет заметно сузить полосы. [c.196]

Рис. 21. Принципиальная схема равновесной седиментации в градиенте плотности трехкомнонентной системы (плотности компонентов р <р<р").

Полидисперсность по составу может быть определена на основании различия показателей преломления компонентов сополимера, их способности поглощать ультрафиолетовое излучение определенной длины волны, либо их парциальных удельных объемов (например, при седиментации в градиенте плотности). В двух первых случаях применяют метод невидимок , предложенный С. Я. Френкелем [197], и многодетекторную регистрацию. [c.122]

При помощи метода, основанного на измерении скорости седиментации в градиенте плотности, мол. вес определяют приблизительно с такой же точностью, как и через константу седиментации 5 и молярный коэффициент трения /о- При этом также получают минимальное значение мол. веса, что связано с предположенпем о сферической форме частиц. Соотношение Мартина и Эймса может быть выведено из уравнения (7.38), поскольку расстояние, пройденное макромолекулами, прямо пропорционально 5. Как правило, считают, что два компонента имеют один и тот же парциальный удельный объем V. [c.419]

Кригбаум, Карпентер и Ньюмен [76] измерили парциальный удельный объем атактического и изотактического полистирола в толуоле. Обнаруженные различия были слишком малы, чтобы объяснить разницу в значениях А 2, обнаруженную Дануссо и Моральо. Уместно заметить, что эти незначительные различия в парциальных удельных объемах были в дальнейшем использованы для разделения обеих форм полистирола путем седиментации в градиенте плотности (см. гл. Х1П). [c.22]

Недавно появилось несколько хороших обзоров, посвященных методу седиментации в градиенте плотности, написанных Дюне, Берте и Бьюфи [32], Виноградом [33], Виноградом и Хирстом [34]. Основное внимание в этих обзорах уделяется применению метода для исследования макромолекул природного происхождения. В настоящей главе, наоборот, в основном разбираются возможности применения метода к синтетическим полимерам. [c.419]

Незначительного различия в иарциальнолг удельном объеме атактического и стереорегулярного полимера (г З-Ю лгл/г для полистирола) достаточно для разделения полос при равновесной седиментации в градиенте плотности [499]. В соответствующих случаях применение этого метода для исследования стереорегу- лярных полимеров может оказаться весьма эффективным (см. [76], глава ХП1). [c.250]

Вторичная или третичная структура белка может оказывать большое влияние на ту легкость, с которой реакционноснособные атомы водорода могут принимать участие в изотопном обмене. Использование таких эффектов для исследования строения белка было впервые осуш ествлено в Карлсбергской лаборатории в Копенгагене, в частности Линдерштром-Лангом, который разработал изяш ный метод наблюдения за процессом обмена. Согласно этой процедуре, белок вначале обрабатывался при повышенной температуре ВгО с целью замеш ения атомов водорода пептидных звеньев, а также активных атомов водорода белковых цепей (—СООН, —КНг, —ОН, —ЗН и т. д.) дейтерием. Дейтерированный белок затем растворяли в воде, через установленные промежутки времени отбирали пробы раствора, которые замораживали при —60° для прекраш ения реакции обмена и подвергали сублимации под высоким вакуумом. Затем с помош ью метода седиментации в градиенте плотности определяли плотность воды в сублимате [1036]. Недавно был разработан другой экспериментальный метод, который основан на исчезновении полосы инфракрасного поглощения при 1550 см при дейтерировании полипептидов или белков [1037, 1038]. Преимущество этого метода заключается в том, что он может быть приспособлен к сравнительно быстрым скоростям реакции с использованием аппаратуры для остановки реакции. Он отличается от метода седиментации в градиенте плотности тем, что в нем измеряется лишь изотопный обмен атомов водорода в пептидных группах. [c.348]

Фиг. 177. График седиментации в градиенте плотности s l частиц инфекционного фага Р1 (светлые кружки) и фага Р1, трансдуцирующего маркер Leu+ (темные кружки), присутствующих в фаголизатах донорных клеток Е. соИ Leu+Thy, выращенных в пр и -сутствии бромурацила (БУ) или тимина (Т) в трех разных вариантах.

Кривые седиментации в градиенте плотности сахарозы смесей различных пар рибосомных экстрактов . oli. Концентрация Mg " в растворах сахарозы составляла 0,01 М, что приводило к частичной диссоциации 70 S-рибосом на составляющие их 50 S- и 30 S-субъединицы. А. Одни экстракт был получен из культуры, выращенной на тяжелой среде (D2O, и С) с Н-урацилом, а друго11 — из культуры, выращенной на легкой среде (НгО. N и -С) с С-урацилом. [c.428]

В качестве радиоактивной метки. Другая культура была выращена на обычной легкой среде, содержащей HjO, и В качестве радиоактивной метки в ней присутствовал С-урацил. Видно, что меченные С рибосомы, выделенные из легкой культуры, дают три пика с характерными константами седиментации 70S, 50S и 30S, соответствующими нормальным легким рибосомам и некоторому количеству диссоциированных 50S- и 30S- yбъeдиниц. Меченные рибосомы, выделенные из тяжелой культуры, дают три более быстрых максимума с константами седиментации 86S, 61S и 38S, соответствующих тяжелым 70S-pn6o oMaM и диссоциированным тяжелым 50S- и 30S- yбъeдиницaм. На фиг. 214, Б представлена аналогичная кривая седиментации в градиенте плотности сахарозы еще одной смеси рибосом, выделенных из двух культур Е. соИ. Одну из этих культур выращивали, как и ранее, в тяжелой среде с Н-урацилом, а затем переносили на нерадиоактивную легкую среду, где она росла в течение еще 3,5 генерации, после чего из нее выделяли рибосомы. Другая культура все время росла на тяжелой среде с С-урацилом. Видно, что после 3,5 генерации в легкой среде меченные Н тяжелые 508-и 308-субъединицы рибосом по-прежнему седиментируют с той же высокой скоростью, что и меченные тяжелые 50S- и 305-субъединицы тяжелой культуры, не подвергавшейся переносу. Но меченные Н, ранее бывшие тяжелыми 705-рибосомы той культуры, которую переносили с одной среды на другую, седиментируют теперь со скоростью, лежащей примерно посередине между скоростями седиментации полностью тяжелых и полностью легких 708-рибосом. Эти результаты показывают, что, в то время как тяжелые 50S- и 305-рибосомные субъединицы остаются неизменными после переноса бактерии в легкую среду, большинство из них за это время соединилось с легкими , позднее синтезированными партнерами и образовало наполовину тяжелые , наполовину легкие гибридные 708-рибосомы. [c.430]

Наиболее важными являются два средних значения — средне численный и средневесовой. В принципе они определяются следующим путем. Когда показание измерительного прибора пропорционально числу частиц, то определяют среднечисленный молекулярный вес. Когда оно пропорционально весу вещества, тогда получают средневесовое значение. Так, эквимолярные растворы мономера и его димера будут обладать равным осмотическим давлением, но раствор димера будет иметь примерно вдвое большее поглощение света и вдвое больший показатель преломления, чем раствор мономера. Таким образом, молекулярный вес, определенный по осмотическому давлению, будет среднечисленным, но большинство физических методов зависит от измерения двух последних физических свойств. При этих обстоятельствах количество материала, отнесенного к -му компоненту, зависит не от числа присутствующих молекул, а от массы материала этого вида. На практике 5о является средневесовым, так же как и Од, в тех случаях, когда инкремент показателя преломления на единицу веса остается одним и тем же для всех видов молекул. Однако молекулярный вес зависит от отношения За/Од. Когда это отношение определяется непосредственно, как в методе Арчибальда, никаких сомнений не возникает но когда средневесовые во и Од определяются раздельно, полученное отношение не обязательно является подлинно средневесовым. Если распределение молекулярных весов не очень широкое, это вряд ли приведет к серьезным ошибкам. Вычисленное значение молекулярного веса зависит также от парциального удельного объема предполагается, что он также постоянен для всего полидисперсного набора молекул. Фактически он может немного изменяться, особенно для заряженных молекул (стр. 70, 71) это опять-таки не вызовет серьезных ошибок, за исключением метода седиментации в градиенте плотности. [c.43]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология