Молекулярная масса в градиенте плотности

Из всего вышеизложенного должно быть ясно, что практическое использование уравнений (11.90) и (11.93) для определения абсолютных значений молекулярных масс и плотностей наталкивается на значительные трудности. Принято пользоваться уравнением (11.84) для оценки (Эр/Эх) , поскольку все присутствующие в этом уравнении величины поддаются измерению. Макромолекулы с известным или предположительным значением Ро помешают в градиент, и исследуемые макромолекулы сравнивают со стандартом по их относительному расположению в градиенте. При необходимости более точных измерений можно экспериментально определить (Эр/Эд ) , используя изотопное замещение в препарате, например N-ДHK на фоне N-ДHK. В этом случае предполагают, что указанное изотопное замещение не влияет на значение термодинамических величин, а лишь изменяет величину молекулярной массы безводной формы вещества и плотность макромолекулы. Зная фр/дхУ , по ширине концентрационного распределения в зоне с помощью формулы (11.93) получим точное значение молекулярной массы. [c.265]

При наличии заметных градиентов концентрации компонента с сильно отличной от газовой среды молекулярной массой возникает естественная конвекция за счет разности плотностей и конвекционные токи усиливают перемешивание [8]. Подробнее к этому вопросу мы вернемся в гл. IV при учете свободной конвекции, вызываемой температурными градиентами. [c.89]

Фракционирование белков, нуклеиновых кислот и других макромолекул при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы основано на различии в скорости седиментации молекул, пропорциональной их молекулярной массе. Фракции РНК, обладающие различной молекулярной массой, после центрифугирования распределяются в линейном градиенте концентрации сахарозы при этом благодаря значительной вязкости растворов сахарозы улучшается разделение и уменьшается возможность смешивания различных фракций. [c.172]

Следует также упомянуть метод центрифугирования в градиенте плотности. Обычно работают в возрастающем градиенте плотности сахарозы при высокой скорости ротора. Расстояние, на которое перемещается белок в градиенте, обратно пропорционально его молекулярной массе. Молекулярную массу неизвестного белка с достаточной точностью можно определить, сравнивая его с добавленным стандартным белком известной молекулярной массы. [c.361]

Метод равновесной седиментации в градиенте плотности основан на следующем. Если поместить в ячейку центрифуги смесь низкомолекулярных жидкостей (растворителей) различной плотности, то при сильном центробежном ускорении (более 10 м/с ) через некоторое время в кювете установится седиментационное равновесие, т.е. в радиальном направлении возникнет постоянный во времени градиент плотности. Если в таком бинарном растворителе содержится полимерный компонент с плотностью, промежуточной между плотностями элементов растворителя, то полимер начнет собираться в полосы в тех местах кюветы, где его плотность равна плотности бинарного растворителя. Чем ниже молекулярная масса, тем больше коэффициент диффузии и тем сильнее размывается эта полоса (изоденса). Для сополимеров (если сомономеры имеют разные плотности) в результате установления равновесия могут появиться несколько полос макромолекулы с различной плотностью соберутся в разные полосы. Следует отметить, что метод применим для молекулярных масс выше критической, иначе ширина полосы становится соизмеримой с длиной ячейки. [c.325]

Скорости движения молекул в газах и жидкостях почти одинаковы, однако в газе молекулы проходят значительно большее расстояние, прежде чем столкнуться (вследствие более низкой плотности), поэтому коэффициенты диффузии в газе в 10 —10 раз выше, чем в жидкости. Этот факт получает отражение в пропорциональности между Dg и величиной, обратной давлению в системе. Результатом любого диффузионного процесса с участием молекул, имеющих различную массу, является массообмен через некоторую плоскость в системе, причем наличие градиента плотности усложняет процесс конвективного смешивания. В газах этот эффект мал и коэффициент диффузии почти не зависит от концентрации вещества. Имеющиеся экспериментальные данные показывают, что величина Dg с изменением состава системы изменяется на 2—9% в зависимости от разницы молекулярных весов компонентов [2]. Это обстоятельство делает возможным использование в ГХ коэффициентов диффузии в газовой фазе Dg для надежного определения диффузионных эффектов. [c.175]

Центрифугой называется устройство, использующее центробежное поле сил для разделения двух или более компонентов, имеющих различную плотность. Одной из разновидностей центрифуг являются газовые центрифуги, способные разделять газы по их молекулярной массе. Газовая центрифуга имеет полый ротор, вращающийся с окружной скоростью, в несколько раз превышающей среднюю скорость теплового движения молекул разделяемых газов. В этом случае газ внутри ротора прижимается к его стенкам, и вдоль радиуса возникает больцмановский градиент концентраций более тяжёлая компонента концентрируется у стенки, а более лёгкая — ближе к оси ротора. [c.168]

Определив примерную молекулярную массу белка (например, центрифугированием по градиенту плотности), относительное содержание аминокислот можно перевести в абсолютное число остатков в белке. Это будет аминокислотным составом белка. [c.268]

Аналитическое ультрацентрифугирование полимеров [1, 2, 4, 12] включает в себя три следующих экспериментальных метода скоростную седиментацию, изучение седиментационного равновесия и процесса приближения к нему. Скоростная седиментация позволяет определить константу седиментации и полидисперсность образца. Седиментация макромолекул в зоне (зонное ультрацентрифугирование) — ценный метод обнаружения гетерогенности высокомолекулярного образца. Метод приближения к равновесию позволяет рассчитать молекулярную массу М и получить сведения о неоднородности полимера, а изучение седиментационного равновесия (состояния, достигаемого транспортным переносом макромолекул, хотя сам метод и не является истинно транспортным) — молекулярную массу (надежнее, но с большей затратой времени, чем в предыдущем методе) различных типов усреднения. Метод центрифугирования в градиенте плотности заключается в исследовании седиментации, состояния равновесия и приближения к нему в условиях искусственно создаваемого в кювете градиента плотности это — широко используемый метод определения молекулярной массы, наличия неоднородности и ее типа, служащий и для препаративных разделительных целей. [c.14]

Наиболее распространенный способ создания градиента плотности — центрифугирование раствора полимера в смеси двух или более жидкостей, отличающихся по плотности, молекулярным массам или по обоим показателям. Полимер собирается в области, где плотность раствора р близка к плотности полимера в растворе, т. е. где кажущийся парциальный удельный объем [c.30]

Центрифугирование в предварительно установленном градиенте плотности [63 ] дает дополнительную возможность разделить эффекты, обусловленные распределением по составу и молекулярным массам, так как перераспределение полимера в полосе при изменении (О превышает скорость установления нового градиента. [c.34]

Существует ряд ограничений метода центрифугирования в градиенте плотности. Молекулярная масса полимера не должна быть слишком низкой, так как иначе ширина полосы может превышать длину ячейки. Трудности возникают при подборе подходящего 0-растворителя, при учете влияния давления и т. п. [7]. [c.34]

Величину Л4 можно определить также методом равновесия и приближения к нему (см. стр. 23), а также методом центрифугирования в градиенте плотности. Типы усреднения получаемых молекулярных масс указаны в соответствующих разделах. [c.104]

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ В РАВНОВЕСНОМ ГРАДИЕНТЕ ПЛОТНОСТИ [c.126]

Фиг. 30. Характер распределения концентрации в равновесном градиенте плотности может указывать на гетерогенность по молекулярной массе или по плотности.

Пожалуй, наиболее полной экстракции рибосомных белков можно добиться путем разрушения структуры рибосом под действием ДСН [1375]. В этом случае рибосомные белки образуют комплексы с ДСН, которые можно подвергать электрофорезу в ДСН-содержащих гелях без предварительного удаления нуклеиновых кислот. В практическом отношении применение ДСН очень удобно, поскольку это позволяет анализировать небольшие количества рибосом или рибосомных субчастиц. Так, например, из фракций, полученных при центрифугировании в градиенте плотности, можно выделить рибосомные субчастицы путем осаждения ТХУ. Осадки после нейтрализации растворяют в буфере, содержащем ДСН [599], и белки разделяют электрофорезом в соответствии с их молекулярными массами. [c.310]

Принципиально возможно определение коэффициентов седиментации и, следовательно, приблизительных молекулярных масс даже не вполне индивидуальных белков, если имеется подходящий метод для измерения относительных концентраций белков, например путем измерения их ферментативной активности. Изучаемый образец осторожно наносится на раствор сахарозы с линейным градиентом концентрации и подвергается высокоскоростному центрифугированию в роторе с откидывающимися пробирками (в ба-кет-роторе). Обычно в качестве стандарта в раствор добавляется белок с известным коэффициентом седиментации s. Вещества с различными седиментационными свойствами отделяются в градиенте плотности друг от друга, образуя полосы. По окончании центрифугирования в нижней части центрифужной пробирки проделывают небольшое отверстие, фракции сливают и анализируют. Если фракции отбирают через различные промежутки времени центрифугирования, то временная зависимость расстояния от мениска до зоны белка, обладающего активностью, должна быть линейной. Для данного времени центрифугирования соблюдается следующая [c.130]

Первое поколение дочерних молекул ДНК состоит наполовину из старых и наполовину из новых полинуклеотидных цепей. Зто было подтверждено замечательным экспериментом на бактериальных культурах с использованием меченых атомов ( N разд. 20.17). Об этом опыте в 1958 г. сообщили М. Мезельсон и Ф. У. Шталь. Они выращивали несколько поколений кишечной палочки Es heri hia oli) на питательной среде, в которой присутствовало соединение азота с высоким содержанием тяжелого изотопа Выделенная в этом случае бактериальная ДНК имела большую молекулярную массу (атомы в молекуле были те же) и большую плотность, чем ДНК, полученная из бактерий, выращенных на обычной среде. Различие плотности определяли методом, называемым ультрацентрифугированием в градиенте плотности. Раствор хлорида цезия помещают в центрифужную пробирку и вращают ротор с такой скоростью, чтобы получить центробежное ускорение, в 100 000 раз превышающее ускорение земного тяготения. В центробежном поле концентрация ионов цезия, имеющих высокую плотность (вместе с компенсирующими их заряд ионами хлора), будет выше в периферическом конце пробирки. Таким образом, по направлению к периферии в пробирке создается градиент плотности. Большие молекулы, вроде ДНК, при введении в пробирку и создании силового поля концентрируются в зонах, где их плотность равна плотности раствора хлорида цезия, т. е. в периферическом конце пробирки. Мезельсон и Шталь перенесли бактерии, выращенные в среде, обогащенной [c.460]

Первая стадия опре51 еления строения белка состоит в идентификации и количественном определении составляющих его аминокислот. Для этого требуется образец чистого белка, что само по себе представляет значительную проблему. Чтобы получить чистый образец, обычно применяют комбинацию методов (гл. 3), таких, как гель-электрофорез, ионообменная хроматография и центрифугирование по градиенту плотности (белки с большей молекулярной массой оседают быстрее, чем белки с меньшей молекулярной массой). Когда белок в результате применения этих методов становится однородным или когда достигнут максимум биологической активности, белок считается чистым. Тогда его гидролизуют до составляющих аминокислот горячей соляной кислотой и гидролизат анализируют. [c.267]

При воздействии на раствор полимера большой центробежной силы, что достигается в ульграцентрифуге, где создаются гравитационные поля до 250 ООО g, возникает тенденция к осаждению полимерных молекул (предполагается, что плотность молекул полимера выше плотности растворителя). Скорость осаждения (седиментации) пропорциональна молекулярной массе, и поэтому более тяжелые молекулы осаждаются быстрее. При равновесии устанавливается градиент молекулы более вькокой молекулярной массы располагаются ниже, а лее низкой — выше. [c.529]

В этом методе электрофореза используется электрофоретическое перемещение макромолекул в среде с градиентом плотности пор геля. Конечный результат — разделение смеси на отдельные компоненты в соответствии с размерами молекул, при этом электрофоретическая подвижность не играет существенной роли. Необходимым условием такого разделения является наличие у исследуемых соединений зарядов одного типа и отличной от нуля электрофоретической подвижности в применяемой среде. Движение веществ от старта постепенно тормозится вследствие уменьшения пор геля, и с увеличением расстояния от старта подвижность макромолекул постепенно уменьшается. При больших молекулярных массах нодвил ность уменьшается почти до нуля. Ограничение подвижности, вызываемое гелем, приводит к фокусированию зон. Для того чтобы подвижность снижалась до нуля, наряду с градиентом концентрации акриламида необходимо наличие градиента степени сшивки геля. Поэтому в новых типах гелей имеется градиент концентраций и полиакриламида, и бисакриламида. На этих гелях можно разде- [c.299]

Анализ уравнения (IX. 3) приводит к некоторым важным практическим выводам. Скорость седиментации возрастает с увеличением молекулярной массы как (для сферических частиц), а также с расстоянием х до оси вращения. Она пропорциональна квадрату скорости вращения (ю ) и зависит от фактора плавучести (1—ир). Если величина ир больше единицы, то этот фактор становится отрицательным. Плотность частиц (1/о) составляет в среднем для белков 1,33 г/мл, но может приближаться и к единице (1,02 г/мл) в случае липопротеидов. Следовательно, увеличивая плотность р буферного раствора добавлением солей приблизительно до 1,06 г/мл, можно вызвать флотацию липопротеидов к мениску. Коэффициент вязкости т] стоит в знаменателе, и, следовательно, скорость седиментации с возвра-станием вязкости падает. В опытах с применением градиента плотности коэффициент вязкости при увеличении расстояния X до оси вращения возрастает. Используя изокинетический градиент плотности с линейным возрастанием вязкости при увеличении расстояния х, можно компенсировать соответствующее пропорциональное возрастание скорости седиментации и добиться таким образом независимости скорости седиментации от х. [c.174]

Если метод ультрацентрифугирования в градиенте нлотности применять для гомогенных препаратов вирусных ДНК, то уравнение (18) в случае образцов с относительно небольшим молекулярным весом (5 000 000 или менее) дает результаты, которые находятся в полном соответствии с данными, полученными другими методами (табл. 1). Этот метод, кроме того, дает удовлетворительные результаты для низкомолекулярных денатурированных ДНК. Однако для нативных высокопопимерных препаратов значение М, полученное из опытов с градиентами плотности с помощью уравнения (18), значительно ниже (не менее чем вдвое) величин, полученных другими методами. Причина этого расхождения пока еще не выяснена. Можно, однако, пользоваться э ширическим соотношением между молекулярным весом и величиной (или шириной полосы), выведенным для серии нрепаратов фаговых ДНК с известной массой [117]. [c.240]

Определение размера молекул ДНК, присутствующих в экстрактах, которые Меселсон н Сталь использовали в своих опытах по разделению в градиенте плотности, показали, что молекулярная масса этих молекул составляет примерно 1% общей массы ядра одной бактерии. Следовательно, полуконсервативная репликация, осуществляемая путем разделения цепей, происходит в длинных двойных спиралях, состоящих из полинуклеотидных цепей, каждая из которых содержит десятки тысяч нуклеотидных остатков. Однако этот важный вывод — не единственное, [c.199]

Результаты эксперимента Бонгоффера и Гирера приведены на фиг. 97. Во-первых, видно, что два типа меченной Н ДНК, легкая и гибридная, четко разделяются в градиенте плотности s l. Во-вторых, можно видеть, что во время кратковременного включения С-БУ, продолжающегося 2,5 и 5 мин, которые составляют соответственно 0,0025 и 0,005 части от 1000-минутного времени генерации при 23 °С, плотность молекул ДНК, содержащих С-БУ, занимает промежуточное положение между плотностью легких и гибридных молекул ДНК. Следовательно, одна из цепей этих молекул содержит только тимин, а другая — как тимин, так и БУ. Однако, если включение С-БУ продолжается в течение 10 мин, молекулы ДНК достигают плотности, близкой к плотности гибридной ДНК. Таким образом, после ассимиляции БУ в течение / = 0,01 времени генерации двойные спирали имеют одну цепь, содержащую только тимин, и другую цепь, содержащую преимущественно БУ, т. е. к этому моменту молекулы ДНК почти полностью завершили репликацию. Так как средняя молекулярная масса ДНК в этих экстрактах составляет примерно 1% массы ядра бактерии (х = 0,01), то, следовательно, п = fix = = 0,01/0,01 = 1. Другими словами, по-видимому, в единицу времени реплицируется только один участок бактериальной ДНК, или имеется только одна реплицирующаяся Y-вилка на ядро. [c.201]

Пташке надеялся, что в этих условиях значительная часть остаточного синтеза белка будет приходиться на образование продукта гена с1 супер-инфицирующими бактериофагами, так как синтез белков клетки-хозяина был подавлен предварительной обработкой, а синтез большинства вегетативных белков фага не мог происходить из-за присутствия эндогенного иммунитетного репрессора. Действительно, после экстракции и хроматографического фракционирования радиоактивных белков из таких клеток оказалось, что одну из фракций можно идентифицировать как продукт гена с1. Эта фракция обнаруживалась, только если бактерии заражали бактериофагами Яс1+, содержащими нормальный ген репрессора, и отсутствовала при заражении атйег-мутантами по гену с1. Определение скорости седиментации этой белковой фракции в градиенте плотности сахарозы показало, что ее молекулярная масса соответствует длине полипептидной цепи примерно в 200 аминокислот, т. е. близка к молекулярной массе одной из четырех субъединиц, составляющих /ас-репрессор. [c.492]

Наиболее важными являются два средних значения — средне численный и средневесовой. В принципе они определяются следующим путем. Когда показание измерительного прибора пропорционально числу частиц, то определяют среднечисленный молекулярный вес. Когда оно пропорционально весу вещества, тогда получают средневесовое значение. Так, эквимолярные растворы мономера и его димера будут обладать равным осмотическим давлением, но раствор димера будет иметь примерно вдвое большее поглощение света и вдвое больший показатель преломления, чем раствор мономера. Таким образом, молекулярный вес, определенный по осмотическому давлению, будет среднечисленным, но большинство физических методов зависит от измерения двух последних физических свойств. При этих обстоятельствах количество материала, отнесенного к -му компоненту, зависит не от числа присутствующих молекул, а от массы материала этого вида. На практике 5о является средневесовым, так же как и Од, в тех случаях, когда инкремент показателя преломления на единицу веса остается одним и тем же для всех видов молекул. Однако молекулярный вес зависит от отношения За/Од. Когда это отношение определяется непосредственно, как в методе Арчибальда, никаких сомнений не возникает но когда средневесовые во и Од определяются раздельно, полученное отношение не обязательно является подлинно средневесовым. Если распределение молекулярных весов не очень широкое, это вряд ли приведет к серьезным ошибкам. Вычисленное значение молекулярного веса зависит также от парциального удельного объема предполагается, что он также постоянен для всего полидисперсного набора молекул. Фактически он может немного изменяться, особенно для заряженных молекул (стр. 70, 71) это опять-таки не вызовет серьезных ошибок, за исключением метода седиментации в градиенте плотности. [c.43]

Для этой цели в 1ТЬследнее время стали применять метод центрифугирования в градиенте плотности, дающии сведения о распределении полимеров не только по молекулярной массе, но к по химическому составу (см. ниже). [c.541]

Как и в случае ИЭФ в градиенте плотности, снижение электри чеокой проводимости при ИЭФ в геле не дает еще достаточно оснований для заключения об окончании процесса фокусирования. Чтобы определить время, необходимое для ИЭФ в геле, следует поставить предварительные опыты с применением окрашенного белка, нанесенного с обоих концов геля [1347]. В электрическом поле две полосы этого белка будут двигаться навстречу друг другу, и момент их слияния можно считать завершением фокусирования всех белков, у которых молекулярная масса не выше, чем у контрольного белка. Как правило, при работе с гелями обычных размеров увеличение продолжительности ИЭФ на 1—2 ч не сопряжено с каким-либо риском, однако ч резмерного удлинения времени фокусирования следует избегать, так как образующиеся в полиакриламидном геле градиенты pH не могут долго оставаться стабильными [c.153]

В хлоропластах высших растений и водорослей обнаружена ДНК. Из клеток фотосинтезирующего простейшего Euglena gra ilis выделена кольцевая молекула хлоропластной ДНК, которая, судя по ее длине, имеет молекулярную массу 8,3 X Ю Д (около 126 тыс. п. н.). Плотность этой ДНК, равная 1,685 г/см , отличается от плотности ядерной ДНК (1,707 г/см ), благодаря чему ее можно идентифицировать в качестве отдельного пика при равновесном центрифугировании в градиенте плотности. Этот пик отсут- [c.229]

При скоростях ротора, много меньших, чем те, при которых проводят опыты по скоростной седиментации, в результате центрифугирования устанавливается равновесное распределение макромолекул. Форма этого распределения самым тесным образом связана с молекулярной массой и не зависит от фрикционных свойств молекулы. При наличии смеси компонентов с помощью равновесного центрифугирования получают средневесовое значение молекулярной массы. В ряде случаев можно проанализировать равновесное распределение взаимодействующих макромолекул и определить константу связывания. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности является чрезвычайно эффектив- [c.265]

Здесь молекулярная масса фракционируемой ДНК доходила до 500 млн. (ДНК вируса G из Вас. megatherium, выделенная обработкой вируса горячим саркозилом с последующей очисткой центрифугированием в градиенте плотности раствора s l). Подробно описаны предосторожности, необхо имые при манипуляциях с такой ДНК во избежание ее разрыва под действием гидродинамических сил. [c.122]

Фиколл-400 — полисахарид, полученный сополимеризацией сахарозы и эпихлоргидрина, с молекулярной массой 400000, хорошо растворимый в воде и устойчивый в широком диапазоне pH (при рН<3 гидролизуется). Следует избегать его контакта с сильными восстановителями и окислителями. По плотности растворы фиколла уступают растворам сахарозы той же концентрации, а по вязкости заметно их превосходят. Главным достоинством фиколла является малое (при концентрации ниже 20%) осмотическое давление его растворов. Большой размер молекул фиколла не позволяет им проходить через клеточные мембраны, поэтому его используют для создания градиентов плотности при центрифугировании клеток, клеточных органелл и частиц, связанных с мембранами. Эти градиенты применяют не только при зонально-скоростном, но и (чаще) при равновесном центрифугировании [Aspray et al., 1975]. Порошкообразный фиколл производит шведская фирма Pharma ia . [c.208]

В настоящее время наиболее подробно охарактеризованы молекулярная масса регуляторного М-белка. Данные, полученные с использованием трех методов идентификации N-белка, дают похожие результаты. Так, Пфейффер с помощью [ Н] Р -(4-азидо-анилид) Р -ГТФ при блокировании мембранных белков эритроцитов голубя показал включение метки в полипептиды с молекулярной массой 86 000, 53 000, 42 000 и 23 000 дальтон [6]. Из них только полипептид с молекулярной массой 42 000 дальтон был связан с аденилатциклазной активностью в детергентном экстракте при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы. Этот полипептид, проявляющий биологическую активность регуляторного белка в экспериментах по реконструкции, можно было отделить от аденилатциклазы на аффинном носителе, содержащем ГТФ [6, 7]. Примерно в то же время был обнаружен катализируемый субъединицей холерного токсина перенос [ р] ДДф-ри-бозы от [ Р] НАД+ на мембранный белок, который при денатурирующем электрофорезе дает меченый полипептид с молекулярной массой 42 000—45 000 дальтон [11, 24—27]. [c.96]

До сих пор мы рассматривали случаи, когда плотность изучаемых молекул намного превышала плотность растворителя. В этом разделе будет описан важный метод седиментационного равновесия в градиенте плотности (его разработали Мэтью Мезелсон, Франклин Шталь и Джером Виноград), в котором плотность растворителя почти такая же, как и плотность изучаемой молекулы. Этот метод требует присутствия третьего компонента (обычно соли цезия) с низкой молекулярной массой и высокой плотностью. При центрифугировании раствора соль перераспределяется [в соответствии с уравнением (13)] с достижением равновесия, образуя тем самым градиент концентрации, который имеет меньшую плотность сверху и большую — у дна пробирки, т. е. градиент плотности. Макромолекулы при этом [c.329]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология