Градиент элюента

Рис, 7.8. Стеклянное устройство для создания линейных градиентов элюента. [c.199]

Колонка. К хроматографической колонке предъявляются как конструкционные, так и рабочие требования. К первым относятся длина, внутренний диаметр, форма, материал. К рабочим — плотность насыпки адсорбента, скорость протекания элюента, градиент давления, температура, объем пробы. [c.82]

Основной задачей теории хроматографии является выяснение механизмов разделения и описание движения компонентов смеси вдоль неподвижной фазы. Поскольку при хроматографии происходит непрерывное движение одной фазы относительно другой, между фазами не устанавливается равновесие. Однако при определенных условиях процесс хроматографирования можно рассматривать как равновесный, и тогда скорость перемещения вещества вдоль слоя сорбента имеет простую связь со скоростью потока элюента и градиентом адсорбции по концентрации. Основное уравнение равновесной хроматографии, записанное относительно линейной скорости и перемещения вещества вдоль колонки неподвижной фазы, имеет вид [c.348]

Элюенты. При выборе растворителей или их смесей для ТСХ учитывают растворимость разделяемых соединений в подвижной фазе. Важное значение имеет избирательная растворимость по отношению к отдельным компонентам смеси. Методика выбора растворителей — элюентов для ТСХ — зависит от типа разделяемой смеси. Различают два основных случая 1) разделение веществ с близкими значениями R и 2) разделение веществ с сильно различающимися Rj. В первом случае применяют проточное непрерывное элюирование, во втором случае — метод антипараллельных градиентов, заключающийся в разделении веп еств в камерах с ненасыщенной атмосферой, при котором уменьшается подвижность соединений в направлении элюирования. [c.358]

Рис. 27. Форма градиента концентрации элюента (см. текст)

Рис. 30. Форма экспоненциального градиента концентрации элюента (см. текст)

Элюция белков с колонки. Скорость протекания элюента по колонке при ионообменной хроматографии сказывается на результатах разделения. При медленном токе жидкости, например порядка 8 мл/см -ч, разделение лучше, чем при токе жидкости через ту же колонку со скоростью 20 мл/см -ч. На разделительной способности колонки сказывается и крутизна создаваемого градиента элюции чем круче градиент, тем острее пики на кривой элюции, однако лучшему разделению способствует более пологий градиент. [c.111]

Имеются и другие специфические для высокополимеров концентрационные эффекты, определяющие форму хроматографического пятна. Один из них связан с осаждением полимера, которое происходит, если на пластинке имеется градиент элюента с постепенным уменьшением соотношения растворитель — осадитель. В результате, чем выше концентрация полимера в хроматографическом пятне, тем ниже концентрация осадителя, соответствующая порогу растворимости полимера, и тем больше вытянуто это пятно (рис. VIII.17) в направлении, обратном движению по пластинке. Этот эффект напоминает влияние вогнутой изотермы адсорбции на форму хроматографического пятна, хотя и определяется иными причинами, связанными с осаждением полимера в условиях градиентной ТСХ. [c.305]

Изменение температуры дает сложный эффект. С ее новышением снижается вязкость элюента, но, что более существенно, может изменяться и характер взаимодействия вещества с неиодвпжной фазой, т. е. величина К (как правило, она уменьшается). Иногда это используют для управления элюцией (градиент температуры), [c.39]

Рис. 13. Сопоставление характера разделения смеси компонентов, входящих в состав трех различных ио прочности сорбции групп, при изократической ЭЛЮЦШ1 (А) и элюции ступечатым (В) или непрерывным С) градиентом силы элюента

I Выбор между ступенчатым и непрерывным законами изменения силы элюеита диктуется в первую очередь степенью различия ио сродству к неиодвпжной фазе между группами кодгаонентов и внутри них. Если различия между группами очень велики, то предпочтение следует отдать ступенчатому градиенту (рис. 13). Конечно, можно задать столь крутой закон постепенного (наиример, линейного) нарастания силы элюента, что эти группы окажутся достаточно сближенными, но разрешение инков внутри групп при этом может пострадать, так как предел сужению зон внутри груииы кладет диффузия вещества и неоднородность, в то время как уменьшение расстояния мен ду зонами с ростом крутизны градиента ничем не ограничено. Однако, прежде чем в каждом конкретном случае сделать выбор между ступенчатой н непрерывной градиентными элю-циями, следует принять во внимание целый ряд чисто практических соображений, которые изложены нин е в форме сжатого перечисления достоинств и недостатков обоих типов градиентной элюции. [c.43]

Преимущества непрерывной гра 1иентной элюции. 1. Автоматическое и ностененное перекрывание очень широкого диапазона силы элюента предоставляет максимально полные возможности для обзорного анализа всей совокупности компонентов исходно11 смеси веществ. 2. Максимальное сокращение объема элюента и соответственно продолжительности хроматографического процесса. 3. Возможность варьирования формы градиента (см, ниже). [c.43]

Рис. 31. Спираль для сохранения предварительно созданного градиента концентрацпп элюента при элюции микроколонки

В открытую колонку (без адаптора) препарат вносят вручную из пипетки. Начинают с того, что спускают жидкость из колонки так, чтобы открылся (но не начал обсыхать ) слой сорбента. Затем сливную трубку зажимают. Раствор препарата остороншо, чтобы не взмутить сорбент, заливают по стенке колонки, начиная от расстояния в 1 мм над поверхностью сорбента и постепенно вместе с уровнем раствора препарата продвигая кончик пипетки вверх по стенке. После того как весь объем препарата внесен в колонку, сливную трубку освобождают от зажима и дают слою препарата войти в сорбент до того момента, когда его поверхность снова обнажится. Так же, как описано, вносят объем элюента, равный объему препарата, а затем спускают его в сорбент. Такую промывку стенок колонки целесообразно повторить еш е раз. После этого заливают (так же) некий объем элюента (на высоту 1—2 см) и вставляют верхнюю пробку с капельницей. Слой свободного элюента предназначен для того, чтобы обеспечить образование некоторого разрежения над сорбентом, необходимого для всасывания жидкости из резервуара, если он располагается ниже верха колонки при элюции без насоса (образование сифона), или для предотвраш ения обнажения верхнего слоя сорбента при. неработающем насосе и открытом сливе из колонки (в первый момент после открывания слива пз колонки вытекает немного жидкости, затем, если система герметична, вытекание прекращается). Вместе с тем следует иметь в виду, что в слое свободного элюента над сорбентом происходит перемешивание градиента, поэтому в случае градиентной элюции высота этого слоя должна быть минимально необходимой. После того как внесение препарата п подготовка колонки закончены, можно присоединить резервуар нли насос, открыть сливную трубку п начать элюцию. [c.77]

Программное устройство фирмы Waters (модель 660) предусматривает возможность задания любого из 11 фиксированных профилей градиента (линейного, двух ступенчатых и по четыре — выпуклых и вогнутых). Экспериментатору достаточно задать начальный и конечный состав смеси буферов, сумлгарную скорость подачи элюента п время элюции. Существуют варианты п более сложных систем. Например, в хроматографе фирмы Руе Uni am (модель PU 4800) задание формы градиента с помощью микропроцессора можио осуществить путем разбиения всего времени элюции на девять произвольных интервалов, внутри каждого из которых любую кривую можно аппроксимировать экспоненциальной функцией. Однако необходимость столь сложных (и дорогостоящих) устройств представляется сомнительной, по крайней мере для решения тех задач, которым посвящена эта книга. [c.100]

Необходимо проверить его полную растворимость в смеси орга нических растворителей с водой или буфером для всех пропорций этой смеси, образующих градиент элюцип. Исходный раствор препарата следует отфильтровать через фильтр с отверстиями размером не более 0,5 мкм. Препарат должен быть по возможности растворен в исходном элюенте, которым уравновешена колонка, поэтому па предшествующих этапах очистки препарата желательно х спользо-вать летучие буферы и удалять их лиофилизацией. Если в препарате содержатся нелетучие соли, их следует убрать диализом или гель-фильтрацией. Моя<но использовать предколонку для защиты основной колонки. [c.193]

При разделении относительно крупных бромциановых пептидов ОС-, р- и 7-цепей глобина человека 0,1 %-ный раствор ТФУ, помимо своей роли в осуществлении ион-парной хроматографии, оказался очень полезен как прекрасный растворитель для пептидов, в частности гидрофобных. Кроме того, раствор ТФУ прозрачен вплоть до А, = 216 нм и легко удаляется лиофилизацией. Фракционирование вели на колонке Li lirosorb RP-8 (0,46 X 50 см). Использование сорбента с меньшей, чем в рассмотренных выше примерах, гидрофобностью обусловлено большими размерами пептидов. Колонку уравновешивали 0,1%-ньш водным раствором ТФУ, впрыскивали в нее 100 мкл смеси пептидов и вели элюцию линейным градиентом концентрации изопропанола (от нуля со скоростью нарастания 1,6% в минуту) в течение 1 ч при температуре 28 и скорости подачи элюента 0,7 мл/мин. Профиль элюции показан на рис. 96 (сплошная линия). Пептиды длиной 32, 43 и 64 аминокислотных остатка хорошо отделились друг от друга [Mahoney, Hermod-son, 1980]. [c.204]

Рассмотрению возможностей обратнофазовой гидрофобной хроматографии белков в основном посвящен сравнительно недавно опубликованный обзор [Rubinstein, 1979]. Основные его выводы совпадают с тем, что было сказано выше при рассмотрении обратнофазовой гидрофобной хроматографии пептидов. Для белков с молекулярной массой в интервале 12—30 тыс. Дальтон автор отдает предпочтение силикагелям, модифицированным октилсиланом (Са). В качестве органического компонента элюента, по его мнению, следует предпочесть градиент концентрации пропанола, вплоть до 40%-ной концентрации, если позволяет растворимость белка. Для получения узких пиков рекомендуется в качестве водного компонента использовать буфер высокой (примерно 1 М) концентрации, подавляющий ионное взаимодействие белка с силанольными группами матрицы. При pH 5—6 разрешение получается обычно хуже, чем при pH 4 (формиатно-пиридиновый буфер) или 7,5 (Na-ацетатный буфер). Существенно указание на то, что скорость элюции следует снизить до 60—90 мл/см Ч. Продолжительность фракционирования белков при этом остается относительно небольшой — 1—3 ч. Белки целесообразно разделить предварительно на группы [c.210]

Колонкп Оксиапатита обычно предварительно промывают 5 — 10 объемами слабого ( 0,05 М) нейтрального фосфатного буфера. Если стабильность белка требует определенной ионной силы, ее обеспечивают добавлением в буфер для промывки и элюент соли. Элюцию кислых белков ведут ступенчатым или линейным градиентом концентрации фосфатного буфера — вплоть до 0,8 М. Особо прочно сорбированные белки нередко снимают пирофосфатом. Емкость колонки оксиапатита обычно составляет примерно 1—5 мг белка па 1 мл объема колонки, выход белков — 8O —100%. Утрата ферментативной активности наблюдается редко — метод относительно мягок . I По-видимому, механизм сорбции (в частности, [c.228]

Для очистки мембранной D-лактатдегидрогеназы Е. соИ хроматографией на оксиапатите [Pratt et al., 1979] был использован пологий линейный градиент концентрации (0—0,2 М) К-фосфатного буфера, pH 7,2 (500 мл для колонки размером 2,6 X 20 см). Растворимость белка обеспечивали включением в состав буфера детергентов (1% Тритона Х-100 и 0,1% ДДС-Na). Очистке на оксиапатите предшествовали освобождение фермента из ме.мбрин с помощью дезоксихолата натрия, хроматография на DE-52 и гель-фильтрация на сефадексе G-200. На всех хроматографических этапах очистки в составе элюентов тоже присутствовали детергенты. [c.234]

Длина колонок, заполненных мелкозернистыми обменниками типа Aminex , и колонок высокого давлеиия не превышает 40 см, а обычные их размеры лежат в пределах 15 — 25 см. Как уже указывалось, объем колонкп определяется при изократической элюции объемом исходного препарата (соотношение объемов — от 1 100 до 1 20), а при градиентной — соотношением количества веш ества и эффективной емкости колонки (загрузка па 5 — 10%). По выбранным длине и объему колонки подсчитывают ее диаметр. Однако в интересах обеспечения хорошей формы хроматографических зон отношение диаметра колонки к ее длине не должно превышать определенного предела. Для непрерывного градиента оно не должно быть больше 1 5, для изократической элюции — 1 20, в аналитических опытах — порядка 1 50, а в особо тонких случаях разделения это отношение снижают до 1 100 и даже 1 200. Здесь уместно напомнить обоснованное в гл. 1 правило при перепесонии условий хроматографического процесса, отработанных на маленькой колонке, на большую по объему (препаративную) колонку длина ее должна остаться без изменений (как и скорость элюции в расчете на 1 см сечения). Плош адь колонки увеличивают пропорционально повышению количества препарата, а расход элюента (мл/г) — пропорционально площади. Эту ситуацию можно себе представить как слияние нескольких аналитических колонок, работающих параллельно. [c.294]

Разделение пептидов на колонке Mi roPak АХ-10 осуществляли с помощью линейного градиента концентрации соли 25—100% 0,01 М триэтиламмонийацетатного буфера (pH 6) в смеси с ацетонитрилом. Очень кислые пептиды элюировали дополнительно 0,04 М НСООН при 60°. Использование летучих элюентов облегчало дальнейший анализ состава пептидов [ Dizdaroglu et aL, 1982]. [c.300]

Колонку (2X15 см) заполняют густой суспензией гидроксилапатита так, как это описано на с. 102. Колонку промывают 100 мл 0,03 М фосфатного буфера. Затем в нее вносят препарат нуклеиновой кислоты из расчета 0,2 мг на 1 мл суспензии (сухие препараты растворяют в 0,03 М калий-фосфатном буфере, менее очищенные препараты предварительно освобождают от избытка ионов). Устанавливают скорость тока жидкости 0,2 мл/мин-см . Колонку промывают 50—100 мл исходного буфера и проводят элюцию в линейном градиенте концентрации фосфатного буфера 0,03—0,4 М. Общий объем элюента — 400 мл. Собирают фракции по 5—10 мл. Содержание нуклеиновых кислот определяют по поглощению при 260 нм. Порядок элюции нуклеиновых кислот с колонки гидроксилапатита при постепенном увеличении концентрации фосфатного буфера следующий РНК, однонитевая ДНК, двух-нитевая нативная ДНК. [c.172]

На практике часто реализуются одновременно неск. механизмов разделения. БХ осуществляется в стеклянных хроматографич. камерах или др закрытых сосудах. Для улучшения воспроизводимости их часто кондиционируют, покрывая внутр. стенки фильтровальной бумагой, смоченной соответствующим р-рителем. В камеру помещают лоток с элюентом, в к-рый опускают край хроматографич. бумаги после нанесения на нее пробы разделяемых в-в (обычно объемом 1-10 мкл) Элюент движется под действием капиллярных и гравитац сил. По расположению бумаги и направлению тока элюента различают восходящую, нисходящую и горизонтальную БХ Хроматографирование можно проводить также в центробежном поле или в условиях градиента т-ры, что увеличивает эффективность и скорость разделения В т. наз. двумерной БХ пробу наносят в один из углов квадратного листа и после завершения хроматографирования в одном элюенте бумагу высушивают и, повернув на 90 погружают в др элюент. На дву- [c.325]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология