ДНФ-аминокислоты, колориметрия

Нингидринная реакция широко используется для анализа аминокислот. Реакция протекает количественно. Образующийся альдегид является характерным для каждой аминокислоты Специфическое определение альдегида позволяет установить соответствующую аминокислоту. Колориметрия окрашенного комплекса в сочетании с хроматографией и ионо-форезом является сейчас одним из самых распространенных методов аминокислотного анализа белковой молекулы. [c.469]

Второй раздел практикума ставит своей целью познакомить студентов с особенностями выделения, фракционирования, идентификации и количественного определения различных природных азотсодержащих < оединений. белков, пептидов, аминокислот, нуклеиновых кислот, нуклеотидов и пр Предлагаемые экспериментальные работы включают аиболее широко используемые в лабораторной практике современные методы разделения и анализа этих соединений различные виды электрофореза, хроматографии, спектрофотометрии, колориметрии и др. Работа проводится как на готовых коммерческих препаратах высоко- и низкомолекулярных азотсодержащих соединений, так и на препаратах, выделяемых студентами из различных тканей лабораторных животных. [c.79]

Цветные реакции протеинов, обусловленные наличием в молекуле последних определенных аминокислот, позволяют определять некоторые аминокислоты не только качественно, но и количественно с помощью особого прибора — колориметра (рис. 2), иногда даже не производя гидролиза протеина или не выделяя полученных аммино-кислот из гидролизатов . [c.21]

Наиболее общим методом определения концентрации пептидов является колориметрия продуктов реакции с нингидрином [2]. Это один из наиболее чувствительных колориметрических методов. Для обнаружения аминокислот и пептидов разработаны как обычный, так и полностью автоматизированный варианты, причем нингидриновый реагент не вызывает коррозии и его можно подавать обычным микронасосом. Реакция идет по свободным аминогруппам, но в некоторых случаях хромофор образуется с низким выходом. Данные по окрашиванию дипептидов можно найти в работе [3]. У всех дипептидов, содержащих в качестве Ы-концевой аминокислоты аргинин, треонин, серин, глутаминовую кислоту, глицин, фенилаланин, метионин, лейцин и тирозин, интенсивность окраски составляет 1,6-10 у лейцина эта величина составляет 1,7-10 . У дипептидов с М-концевым лизином и аспарагиновой кислотой интенсивность окраски несколько выше (на 20 и 29% соответственно), а дипептиды с Ы-концевым гистидином и триптофаном проявляются несколько слабее (42 и 67% соответственно от средней интенсивности). Дипептиды с М-концевым пролином, валином и изолейцином окрашиваются очень слабо [2,7 6,4 и 8,5% от средней (1,6- 10 ) интенсивности]. [c.391]

Для количественного определения аминокислот и пептидов по приведенным выше реакциям требуется колориметр или фотометр, с помощью которых обнаруживают изменения в свето-поглощении, связанные с протеканием реакций. Поскольку нингидрин наиболее широко используется для обнаружения аминокислот и белков, он послужит основой для дальнейшего обсуждения колориметра. [c.26]

Заметная флуоресценция появляется при температуре не ниже 37°. Преимуществом этого метода является то, что аминокислоты не разрушаются, в то время как при применении реактивов вроде нингидрина они переходят в другие соединения. Однако цветные реакции являются более чувствительными. При количественном анализе аминокислот применяют обычные методы, как, например, титрование, визуальную и фотоэлектрическую колориметрию и т. д. [c.160]

При необходимости можно провести количественное определение некоторых аминокислот в исследуемом образце, например аланина и глицина, которые хорошо отделяются от других аминокислот. Для количественного определения аланина и глицина на электрофореграмму, помимо исследуемого образца, наносят разные количества этих амино-кислот- свидетелей (20—140 нмоль). После окончания электрофореза, прокрашивания и фиксации вырезают пятна соответствующих аминокислот и обрабатывают их так, как описано на с. 132. Колориметри-рование проводят при 500 нм и строят график зависимости оптической плотности от количества внесенной аминокислоты. Используя полученный график, определяют содержание глицина и аланина в исследуемом образце. [c.139]

Метод колориметрии. Определение тирозина, (формулу см. на стр. 13). Окисление тирозина при обработке растительных продуктов сопровождается образованием темноокрашенных меланинов. В процессе окислительного дезаминирования из тирозина образуется спирт тирозол, который влияет на качество продуктов, полученных в процессе брожения, в частности тирозол входит в состав веществ, определяющих букет пива и сообщающий ему горький вкус. В процессе метилирования тирозина в солоде образуется алкалоид горденин, поэтому определение этой аминокислоты весьма важно. [c.19]

Количественное определение глютаминовой кислоты проводилось по следующему методу [12]. Хроматограмму протягивали через 1%-иый раствор нингидрина, испаряли ацетон на воздухе (1—2 мин) и для развития окраски пятен выдерживали в течение 25 мин в термостате при 60 . Нингидриковые производные аминокислот элюировали 4 мл 40%-ного метилового спирта i 2 мл 0,5%-ного раствора хлористого кадмия в 40%-ноы метиловом спирте в течение 2 ч. Растворы колориметрировали на колориметре ФЭК-М со светофильтром № 2 (длина волны 530 ммк). В связи с тем, что цветовой выход нингидриновых производных аминокислот подвержен некоторым колебаниям и оптические плотности растворов различаются даже для различных хроматограмм из одной камеры, на каждый лист наносили стандартный раствор аминокислоты в количестве 10—20у. [c.214]

По скорости и эффективности хроматография аминокислот уже начала превосходить классические системы детектирования, и дальнейшее усовершенствование анализаторов продолжалось на основе более глубокого изучения кинетики реакции аминокислот с нингидрином и отработки конструкции реактора и колориметра [7, 16, 17]. В результате удалось еще более повысить разрешение и чувствительность анализа. Время одного анализа составляло уже менее 8 ч, и, следовательно, появилась возможность увеличить эффективность за счет круглосуточной работы прибора. Большинство операций уже осуществлялось в автоматическом режиме, однако для полной автоматизации необходимо было иметь блок ввода образцов (автосамплер). Первая модель устройства с одной петлей для ручного ввода образца уже была разработана [18], поэтому не составляло труда преобразовать ее в блок для автоматического ввода большого числа образцов. В дальнейшем для этих целей были созданы специальные патроны [19]. Теперь рабочая программа, заложенная в программирующее устройство, стала включать и управление автосамплером. Высокая эффективность прибора потребовала включения в систему интегратора или ЭВМ для автоматического обсчета результатов анализа. В последующих разделах дано описание неавтоматического базового анализатора и анализатора Te hni on, а затем совсем коротко приведены основные характеристики современных аминокислотных анализаторов. [c.316]

В обычном аминокислотном анализаторе N -2 сохранен блочный принцип. Прибор снабжают одной или несколькими колонками (0,5X75 см). Анализ белковых гидролизатов может занять 2 ч 30 мин анализ образцов более сложного состава может длиться более 36 ч. Прибор имеет два колориметра, с полосами пропускания при 570 и 440 нм в случае необходимости можно использовать один колориметр с полосой при 410 нм. Полагают, что потерю чувствительности можно многократно перекрыть благодаря непрерывному 10-кратному расширению шкалы, что вообше является конструктивной особенностью этих колориметров. Для достижения максимального разрешения используют также рассечение потока пузырьками азота (что является характерной особенностью анализатора Te ni-соп), хотя новый состав нингидринового реагента, с использованием гидразинсульфата, делает излишним хранение его под азотом. Предел детектирования аминокислот составляет 1 нмоль. [c.325]

Также очень неточен метод экстракции окраски пятна от нингидрина ацет-оном [16] и последующего колориметрического определения густоты окраски в колориметре. Действительного внимания заслуживает метод Войвода ( о1 уос1) [17, 18], представляющий собой модификацию метода Попа и Стивенса [19] для определения д-NH2-aзoтa аминокислот и пептидов. Метод оказался пригодным для определения микроколичеств (1—25 у) К 2-азота. [c.405]

Ход работы. Отмерить в две фарфоровые чашки для выпаривания объемы белкового фенилаланина. В две другие чашки отмерить 3 мл vl мл стандартного раствора фенилаланина, содержащего в 1 мл 0,25 мг аминокислоты. Выпарить досуха содержимое чашек на водяной бане. По охлаждении добавить по 2 мл нитрующей смеси (раствор 20 г KNO3 в 100 ял концентрированной серной кислоты) и нагреть на водяной бане 20 мин. Перенести содержимое чашек, споласкивая водой, в мерные колбы на 25 мл, следя за тем, чтобы объем жидкости не был больше 10 мл. Охладить во льду. Теперь в колбу со стандартным образцом и в колбу с раствором неизвестной концентрации, близкой к этому стандарту, добавить по 2,5 мл 30%-ного раствора гидрохлорида гидроксиламина. Быстро охладить во льду и довести до 25 мл добавлением охлажденного льдом концентрированного раствора аммиака (уд. в. 0,9). Схмешать, оставить при комнатной температуре и через 40 мин сравнить окраски в колориметре. Такой же обработке и колориметрированию подвергнуть два других параллельных опыта. [c.166]

Интенсивность окраски реакционной смеси, получающейся при добавлении нингидринового реагента к эффлюенту, измеряется проточным колориметром в условиях постоянной скорости потока жидкости. Возникающее изменение напряжения на фотоэлементе регистрируется самописцем. Обычно выходное напряжение колориметра на самописец составляет О—5 мВ. При максимальном развитии окраски (наивысшая оптическая плотность, ОП) напряжение равно нулю, а при отсутствии, за исключением фона реагентов (фоновая линия), напряжение составляет 5 мВ. Для точной записи результатов хроматографического анализа самописец должен а) точно реагировать только на сигнал фотоэлемента калориметра б) допускать длительную работу с минимальным дрейфом из-за тепловых и электрических помех в) иметь постоянную скорость лентопротяжного механизма для обеспечения точной идентификации пиков по времени. Если запись на самописце производится на диаграммной бумаге с линейной шкалой, то для расчета пиков аминокислот или пептидов необходим шаблон с нанесенной сеткой ОП. Если самописец снабжен диаграммной бумагой со шкалой в единицах ОП или логарифмической шкалой, величина поглощения находится непосредственно. Другими вспомогательными элементами, которые связаны с записью анализа и считаются составными частями системы регистрации, являются устройства, осуществляющие расширение шкалы, логарифмирование сигнала, интегрирование пика, а также цифропечать и связь с ЭВМ. Расширение шкалы представляет собой метод, по которому вся шкала самописца может быть легко заменена с О—5,0 мВ на 4,0—5,0 или 4,5— [c.32]

Визуальное колориметрическое определение количества аминокислоты производится следующим образом участок бумаги, содержащий аминокислоту, предварительно вырезают из бумажной хроматограммы, помещают в пробирку и обрабатывают раствором нингидрина. Экстрагированную и окрашенную нингидрином аминокислоту исследуют на количественное содержание нри помощи какого-либо колориметра. Следует отметить, что точность и чувствительность этого метода зависят от ряда условий температуры, при которой происходит нин-гидриновая реакция, количества воды, концентрации нингидрина, времени реакции, рП раствора. Поэтому, прежде чем приступить к колориметрированию растворов, необходимо исследовать влияние этих условий на ход количественного анализа, выбрать оптимальные условия и в дальнейшем проводить измерения только при этих вполне определенных условиях. Предельная чувствительность этого способа достигает 1 -]f. [c.152]

Для количественного анализа удобно применять фотоэлектрические колориметры. Этот способ анализа бумажных хроматограмм описан, например, в работе Фишера и др. (1948). Хроматограмму после обработки нингидриновым раствором и высушивания вставляют в фотоэлектроколориметр, с помощью которого снимают кривую распределения интенсивности окраски по длине занимаемой аминокислотой зоны. Площадь под этой кривой пропорциональна количеству аминокислоты. Для вычисления же количества аминокислоты предварительно получают аналогичные кривые распределения для аминокислот с известным количественным содержанием. Точность этого способа варьирует в пределах 5—15% в зависимости от исследуемой аминокислоты. [c.152]

Хотя автоматизация ионообменного разделения и колориметри- ческих измерений сильно уменьшила затраты труда при анализе аминокислот и увеличила производительность аналитической аппаратуры по сравнению с ручными методами, обработка результатов долгое время все еще выполнялась вручную. Измерялась площадь каждого аминокислотного пика, и с помощью стандартных добавок рассчитывался коэффициент пересчета для определения концентрации каждого компонента. В случае многокомпонентного анализа эта операция становится длительной и трудоемкой. Поэтому автоматические методы обработки данных привлекли внимание нескольких групп исследователей. [c.297]

Около 0,2 мг а-аминокислоты (валин, лейцин, фениламиноуксусная кислота, аспарагиновая кислота, аланин) растворяют в буферном растворе и прибавляют ер -нафтиндантрион-2,3,4 гидрат. При этом а-аминокислота превращается в соответствующий альдегид. Альдегид отгоняют в токе двуокиси углерода и конденсируют в щелочном растворе с салициловым альдегидом при температуре 50° С. Интенсивность появляющейся при этом оранжево-желтой окраски измеряют в колориметре. [c.716]

С 1951 г. введен ряд модификаций нингидринового реагента некоторые из этих модификаций удовлетворяют требованиям отдельных методик разделения аминокислот, другие — улучшают колориметрию. Метод Смита [96] отличается главным образом тем, что нингидрин, хлористое олово и буферные растворы прибавляют отдельно, а не в виде одного реагента. Мур и Стейн [4] изменили состав своего прежнего реагента, увеличив буферную емкость в пять раз прибавлением раствора ацетата натрия (pH 5,5). Это устранило необходимость отдельной нейтрализации фракций. Вместо хлористого олова в нингидриновый реагент был введен гидриндантин во избе- [c.145]

Данные различных исследователей по одному и тому же белку легче всего сравнивать, когда они выражены в виде числа остатков каждой аминокислоты, приходящихся па тысячу (или другое удобное число) общих остатков [117]. При этом методе сравнения уменьшаются небольшие различия между отдельными данными за счет ошибок во взвешивании, колориметрии и определении азота. Существенно, однако, чтобы данные были полными и возможно более точными, так как иначе метод теряет свою ценность и может привести к ошибочным выводам. Обзор других методов, использованных для выражения результатов аминокислотных анализов, опубликован Истоу [38]. [c.150]

Разделение аминокислот можно проводить разными методами, но для анализа аминокислотного состава полипептида после его гидролиза обычно используют автоматическую ионообменную хроматографию. Полное разделение аминокислот, их идентификация и количественная оценка занимают менее трех часов. В методе Мура и Штейна используют короткую и длинную колонки, заполненные смолой из сульфонированного полистирола в Ыа+-форме. Когда кислотный гидролизат при pH 2 наносят на колонку, аминокислоты связываются в результате катионного обмена с Na+. Далее колонку элюируют раствором цитрата натрия при заранее запрограммированных значениях pH и температуры. Короткую колонку элюируют одним буфером, длинную— двумя. Элюат обрабатывают нингидрином, измеряя интенсивность окраски с помощью проточного колориметра. Данные автоматически регистрируются на ленте самописца и могут передаваться в компьютер для вычисления площади под пиком (рис. 3.12). [c.31]

Принцип метода аминокислоты переводят в растворимые медные соли. Содержание меди в растворе определяют по ферроцианиду меди [СцРе(СЫ)б], который при малых концентрациях дает слабо-розовую окраску. Интенсивность окраски измеряется на колориметре. [c.378]