Ионообменная хроматография аминокислот автоматическая

Существенные экспериментальные трудности, которые до последнего времени ограничивали исследования в области белковой химии, в значительной степени обусловливались отсутствием простых и надежных способов анализа аминокислот. Лишь благодаря развитию за последние два десятилетия ионообменной и распределительной хроматографии удалось разработать автоматический метод количественного анализа аминокислот с использованием окисления аминокислот нингидрином и фотометрирования продуктов реакции [9]. Однако стремительное развитие химии белков и пептидов, среди которых обнаружены важнейшие биорегуляторы и антибиотики, уже сейчас предъявляет новые требования по чувствительности и быстроте анализа. Сложность аппаратурного оформления и дороговизна эксплуатации, безусловно, ограничивают применение автоматического анализатора Мура и Штейна и в значительной степени обусловливают интерес к разработке новых методов аналитического определения аминокислот, свободных от указанных недостатков. [c.252]

Для разделения и количественного определения аминокислот особенно эффективными оказались методы распределительной, адсорбционной и ионообменной хроматографии. Большое применение, в частности, получил метод Мура и Стейна, в котором исследуемый раствор пропускают через колонку, наполненную или крахмалом (твердый полярный адсорбент), или ионообменной смолой (сочетание адсорбции с ионным обменом), и затем связанные на колонке вещества вымывают с различной скоростью подходящими растворителями. Сбор и анализ отдельных фракций осуществляются при помощи автоматических приспособлений. Метод Мура и Стейна позволяет получить через 24 часа данные о полном аминокислотном составе образца белка, используя при этом только 2,5—3,5 мг белка. Для оценки эффективности и значения этого метода полезно напомнить, что старые и более грубые аналитические приемы требовали для получения данных о полном аминокислотном составе белка нескольких недель трудоемкой работы, связанной с расходованием десятков граммов белка. [c.35]

После полного гидролиза белка производится количественное онределе-ние каждой из аминокислот, присутствующих в гидролизате. Для разделения аминокислот чаще всего применяется метод ионообменной хроматографии. В качестве ионообменника обычно используют сульфополистирольный катионит. Смесь аминокислот вносится в верхнюю часть колонки при pH 3 в этих условиях индивидуальные аминокислоты полонштельно заряжены. Аминокислоты в форме катионов сорбируются на сульфополистирольной смоле (содержащей группы — SOg Na ), замещая часть ионов натрия, и удернги-ваются на материале колонки электростатическими силами. Очевидно, что прочность сорбции аминокислоты возрастает с увеличением ее основности. После внесения смеси начинается элюция аминокислот при постепенном увеличении pH и 1тонной силы буферных растворов, пропускаемых через колонку. В этих условиях положительный заряд на аминокислотах постепенно нейтрализуется и ионные взаимодействия ослабляются. Первыми с колонки снимаются кислые аминокислоты (глутаминовая и аспарагиновая кислота), затем нейтральные и, наконец, основные. С помощью этого метода можно разделять все аминокислоты, обычно встречающиеся в белках, поскольку прочность сорбции аминокислоты смолой зависит как от ионных, так и от неионных взаимодействий. Сульфополистирольный катион адсорбирует аминокислоты достаточно избирательно, так что все нейтральные аминокислоты, которые нельзя разделить с помощью ионного обмена, тем не менее элюируются с колонки в разных фракциях. Индивидуальные аминокислоты, элюируемые с колонки, собираются автоматическим коллектором фракций. Затем их количественно определяют путем измерения интенсивности окраски, возникающей при действии нингидрина. В настоящее время промышленность выпускает несколько типов автоматических амино- [c.57]

Разделение свободных аминокислот в безбелковых экстрактах тканей проводят методами ионообменной хроматографии на колонках (в автоматическом анализаторе аминокислот) и хроматографии на бу- [c.194]

В отличие от ранее рассмотренных видов хроматографии ионообменная хроматография основана на химическом взаимодействии активных групп неподвижной фазы с ионами разделяемых соединений. Она используется для разделения смесей белков н аминокислот, которые в водном растворе находятся в виде ионов (см. 11.1.3). Ионообменная хроматография положена в основу действия специальных приборов — автоматических аминокислотных анализатор О В. [c.498]

До настоящего времени проведены широкие исследования по разделению нескольких типов аминов, в частности катехоламинов и метаболитов триптофана. Разделению этих соединений самыми различными методами посвящено много публикаций. Что касается других аминов, например алифатических аминов, полиаминов и ароматических аминов, то их разделение представляет меньшие трудности, хотя иногда трудно добиться разделения этих аминов на указанные выше типы, так как они имеют близкие хроматографические характеристики. Кроме того, некоторые типы аминов, например триптамин и серотонин, хроматографируются вместе с аминокислотами. Разделение этих типов аминов не приводится ни в настоящей главе, ни в главе по хроматографированию аминокислот. Однако можно получить некоторое представление о разделении этих аминов на основе методов ионообменной, хроматографии, описанных в настоящей главе. Для разделения аминов широко применяются почти все варианты колоночной жидкостной ионообменной хроматографии. Скоростные методы и гель-проникающая хроматография в настоящее время не имеют широкого применения по всей вероятности, классические методы ионообменной хроматографии будут преобладать в области разделения аминов, так как они позволяют получать хорошее и быстрое разделение компонентов. Еще одним важным фактором является возможность использования для этой цели автоматических анализаторов аминокислот. [c.267]

Для мясных продуктов дополнительной необходимой аминокислотой является оксипролин, который характеризует количество соединительных тканных белков в мясе. Его можно определять ионообменной хроматографией с помощью автоматических анализаторов или химическим колориметрическим методом [13, 15, 23]. Метод основан на нейтрализаиди кислотного гидролизата до pH 6,0, последующем окислении оксипролина с помощью 1,4% раствора хлорамина Т (или хлорамина Б) в смеси пропилового спирта и буфера и колориметрическом определении при 553 нм продуктов окисления оксипролина после реакщш с 10%-цым раствором шрд-диметиламинобензальдегида в смеси хлорной кислоты и пропилового спирта (1 2). [c.283]

В книге подробно рассматриваются автоматический метод анализа пептидов и белков с помощью ионообменной хроматографии, газожидкостная хроматография аминокислот и пептидов, очистка белков с помощью гель-фильтрации и электрофореза, изучение функциональных групп в белках с привлечением химических методов. Отдельная глава посвящена изучению четвертичной структуры белков. [c.2]

Применение сефадекса дало возможность выделять и разделять аминокислоты, используя различия в заряде и размерах молекул. Поэтому применение гель-хроматографии к исследованию загрязнений воды легко осуществимо. Ионообменную хроматографию широко используют в автоматических анализаторах [96]. Описано также ее применение для исследования вредных примесей в воде [93, 94]. Автоматизированную хроматографию на силикагеле использовали также для анализа аминокислот [7], однако обычно предпочитают ионный обмен. [c.411]

Хроматографический метод — количественное определение субстрата или продуктов ферментативной реакции с помощью различных видов хроматографии. Так, в настоящее время для количественного определения аминокислот широко применяется автоматический прибор Штейна и Мура, в котором используется ионообменная хроматография. [c.198]

Ионообменная хроматография имеет важное значение в разделении биологических веществ, например смесей аминокислот (белковых гидролизатов). В биологическом анализе широко используют автоматические аминокислотные анализаторы. [c.285]

Резкая интенсификация научной деятельности за последние десятилетия вынуждает исследователя отказаться от чтения множества узкоспециальных публикаций и большую часть информации получать из заслуживающих доверия обзоров. Эта ситуация наблюдается и в области анализа аминокислот, пептидов и белков, где каждые пять лет появляются новые эффективные методы, способные заменить уже существующие. Например, в настоящее время газожидкостная хроматография успешно конкурирует с автоматической ионообменной хроматографией аминокислот по Муру и Стейну, которая полностью заменила микробиологический анализ, хроматографию на бумаге и другие методы количественного анализа, существовавшие до 1958 г. Определение последовательности пептидов — трудоемкая задача при использовании обычных методов — производится на данном этапе автоматически на секвенсере Эдмана, а последовательность небольших пептидов удобно определять с помощью масс-спектрометрии. [c.6]

Очеиь широко используют ионообменную хроматографию для анализа ионизирующихся органических соединений (кислоты, амины, аминокислоты, компоненты нуклеиновых кислот и т. д.). Для анализа аминокислот создан -, автоматические анализаторы, которые в процессе хроматографирования изменяют pH элюента, ионную силу, вводят необходимые реагенты и пр. [c.609]

Гистидинсодержащие дипептиды определяют в безбелковом экстракте мышц после разделения их методами хроматографии на бумаге, в тонком слое силикагеля или ионообменной хроматографии на колонке (в автоматическом анализаторе аминокислот). Как и все первичные амины, дипептиды можно обнаружить по реакции с нингидрином, флуорескамином и с о-фталевым диальдегидом. Карнозин, кроме того, может быть определен по цветной реакции Паули с диазотиро-ванной сульфаниловой кислотой. [c.191]

Ч1ротеииы с помощью кислотного, основного или ферментативного гидролиза могут расщепляться на простейшие составляющие — а-ами-нокарбоновые кислоты, обычно называемые просто а-аминокислотами. Ка.чественный анализ получающихся при этом смесей аминокислот связан с относительно большими трудностями. Э. Фишер (1901 г.) обрабатывал такие смеси спиртом и разделял образующиеся в результате смеси сложных эфиров а-аминокислот дробной перегонкой. В настоящее время эти соединения разделяют и идентифицируют методами газовой хроматографии. Использование ионообменной хроматографии позволяет разделить подобные смеси без предварительной этерификации. Существуют приборы, которые автоматически проводят качественный и количественный анализ смесей такого рода. При этом первоначально а-аминокислоты разделяются на ионообменных смолах, элюаты обрабатываются нингидрином, а образующиеся синие окрашенные вещества анализируются колориметрически, кривые поглощения записываются с помоп ью самописца. [c.647]

В последнее время появилась возможность определять аминокислотный состав белков с помощью автоматических аминокислотных анализаторов. Когда в 1948 г. Мур и Стейн [551 в дополнение к классическим методам органической химии, а также манометрическому и бактериологическому анализу ввели ионообменную хроматографию, наступил поворотный момент в развитии химии аминокислот. В основу работы созданных сотрудниками Рокфеллеровского института современных автоматических аминокислотных анализаторов была положена ионообменная хроматография. Принцип работы этих приборов заключается в следующем. Исследуемый белок гидролизуют, затем гидролизат подвергают хроматографии на смоле типа дауэкс 50 х8 в Na-форме. Элюирование производят с помощью непрерывной подачи буферного раствора. Выходящий из колонки элюат попадает в пластмассовую ячейку особой формы, где он смешивается с раствором нингидрина. Подачу нингидрина осуществляет специальный насос, работающий синхронно с насосом, подающим буферный раствор на колонку. Затем смесь элюата с нингидрином проходит через тефлоновый капилляр, который погружен в кипящую баню. В этих условиях в растворах происходит нингидриновое окрашивание, интенсивность которого измеряется в проточной кювете спектрофотометрически. Поглощение света регистрируется самописцем. Применение сферических смол [80] позволило сократить время исследования одного образца примерно в четыре раза, а использование особых ячеек сделало вполне допустимыми для анализа очень малые количества исследуемого вещества — порядка 0,01—0,05 мкмоля [38]. Введение одноколоночной процедуры значительно упрощает метод [9, 29, 43, 60]. С помощью этой методики в одной и той же пробе можно определить кислые, нейтральные и основные аминокислоты, что не только экономит исследуемый материал, но и повышает точность и сокращает время исследования. Работая на стандартном аминокислотном анализаторе и пользуясь некоторыми модификациями известных методов, можно полностью закончить анализ одного вещества в течение 3 ч [91. [c.32]

В ионообменной хроматографии соединения разделяются в-соответствии с их зарядом. Например, карбоновые кислоты, которые диссоциируют с образованием анионов КСОг , оченз медленно проходят через колонку с анионообменной смолой (например, имеющей группы —М(СНз)зС1 ), тогда как нейтральные или положительно заряженные частицы проходят быстрее. В случае катионообменной смолы нейтральные и отрицательно заряженные частицы проходят быстро, тогда как катионы за-де рживаются дольше. Аминокислотный анализатор (машина длж автоматических анализов смесей аминокислот, см. гл. 12) основан на ионообменной хроматографии. [c.61]

На основе нингидриновой реакции были разработаны методы количественного определения аминокислот, в частности метод распределительной хроматографии на бумаге, впервые внедренный в 1944 г. (А. Мартин и Р. Синдж). Эта же реакция используется благодаря своей высокой чувствительности в автоматическом анализаторе аминокислот. Впервые такой прибор сконструировали Д. Шпакман, С. Мур и У. Стейн (рис. 1.7). После разделения смеси аминокислот в колонках, заполненных специальными ионообменными смолами (сульфополистирольный катионит), ток элюента из колонки поступает в смеситель, туда же поступает раствор нингидрина интенсивность образующейся окраски автоматически измеряется на фотоэлектроколориметре и регистрируется самописцем. Этот метод нашел широкое применение в клинической практике при исследовании крови, мочи, спинномозговой жидкости. С его помощью за 2—3 ч можно получить полную картину качественного состава аминокислот в биологи- [c.42]

В настоящее время интенсивно развиваются методы автоматического анализа аминокислот. Основы этих методик заложены Спакманом и сотр. [186], которые использовали в своей работе метод ионообменной хроматографии на сильнокислотных катионитах, разработанный Муром и 111тейном [126]. В настоящее время ведутся поиски способов ускорения анализов и совершенствуются анализаторы (см. гл. 8). Разрабатывается техника анализа белков и продуктов гидролиза пептидов, а также физиологических жидкостей. Анализ соединений первой группы проще, поскольку он предусматривает разделение лишь тех 18—20 аминокислот, которые обычно встречаются в продуктах гидролиза пептидов. Анализ физиологических жидкостей слож- [c.305]

Хроматография на ионообменных смолах. Метод ионообменной хроматографии был разработан американскими учеными Муром и Штейном. В 1958 г. этот прием был положен в основу автоматического анализатора, который позволяет определить аминокислотный состав белков и пептидов с большой быстротой и точностью. Ионообменные смолы состоят из органического полимера, приготовленного в виде зерен разного размера. Для разделения аминокислот используют сильные катионообменники — полистирольные смолы, активной ионогенной группой которых является группа 50зН. Эта группа при любом значении pH представляет собой анион ЗОз с про-тивоионами Н+ в растворе. Полистирольные цепи периодически соединены молекулярными мостиками так, что обеспечивается трехмерная сетчатая структура смолы. Эта структура допускает проникновение внутрь воды, электролитов и аминокислот. [c.45]

В принципе почти все ионообменные разделения могут быть в той или иной степени автоматизированы, однако, как и следовало ожидать, до сих пор развитие автоматических методов почти полностью сосредоточено на длительных и трудоемких разделениях аминокислот и сахаров, определение которых является важной частью биохимических и клинических исследований. Различается два основных уровня автоматизации оборудования для ионообменной хроматографии а) автоматизация последовательности операций от загрузки пробы в колонку до колориметрического измерения и регистрации концентраций разделенных компонентов и 6) автоматизация не только разделения и регистрации данных, но и последовательной загрузки ряда проб после каждого законченного aнaJ изa. Ниже описываются примеры автоматического оборудования для ионообменной хроматографии обоих типов с указанием классов анализируемых соединений. [c.285]

Ионообменная хроматография — развитие того простого метода ионного обмена, о котором говорилось выше как о методе отделения ионогенных веществ от нейтральных. Ионообменная хроматография проводится на тз[ких же полимерных ионообменных смолах, но более тщательно подготовленных (полученных по строго определенной методике из очень чистого сырья, с одинаков й величиной зернения и т. д.). В таких условиях можно проводить разделение близких веществ, используя сравнительно небольшие различия в свойствах разделяемых соединений. Одно из очень важных для биоорганической химии приложений ионообменной хроматографии — ко-яичественный аминокислотный анализ, производимый иа специальных автоматических анализаторах. При этом благодаря строгой стандарт-ности всех операций каждая. 22 аминокислота всегда элюи- руется в определенный мо- мент (см. рис. 4, где в каче-стве примера указано разделение основных аминокислот и аммиака). Измеряя объем пика каждой аминокислоты, можно количественно определить соотношение различных аминокислот в данном образце (т. е. провести аминокислотный анализ). [c.25]

Метод анализа аминокислот с помощью ионообменной хроматографии базируется на работах Штейна и Мура [3—5], которые систематически изучали проблемы, связанные с разделением и количественным определением наиболее распространенных аминокислот. В 1958 г. эти авторы [5] предложили автоматическую систему, позволяющую проводить полный анализ аминокислот за 24 ч. В дальнейшем эта система неоднократно модифицировалась с целью увеличения скорости и чувствительности анализа. В настоящее время предел обнаружения аминокислот составляет несколько пикомолей, а длительность анализа равна 90 мин. Следует, однако, отметить, что ни одна из современных систем не дает такого высокого разрешения, как система, предложенная Муром и др. [5] . Уменьшение разрешающей способности, которое является следствием увеличения скорости разделения, затрудняет или даже делает невозможным определение малораспространенных аминокислот. [c.37]

Адсорбционная хроматография аминокислот на неполярных неподвижных фазах, впервые предложенная в сороковых годах, в период после пятидесятых годов в какой-то степени утратила свое значение в связи с разработкой метода ионообменной хроматографии. Однако развитие высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) вновь пробудило интерес к этим фазам. Сравнивая методы ВЭЖХ, ионообменной и газовой хроматографии применительно к разделению аминокислот, следует иметь в виду, что автоматическое оборудование для ионообменной хроматографии дорого и пригодно только для анализа аминокислот, причем полное разделение 20 природных аминокислот занимает около 60 мин, для газохроматографического анализа необходима предварительная модификация аминокислот с целью получения их летучих производных, что возможно далеко не во всех случаях. Однако метод ВЭЖХ является весьма гибким и с помощью сравнительно недорого оборудования позволяет решать разнообразные проблемы, связанные с изучением различных веществ. В частности, 20 аминокислот можно разделить данным методом менее чем за 40 мин. В результате многочисленных систематических исследований сорбентов установлено, что химически связанные фазы являются наилучшими для анализа аминокислот и пептидов. [c.43]

Разделение аминокислот можно проводить разными методами, но для анализа аминокислотного состава полипептида после его гидролиза обычно используют автоматическую ионообменную хроматографию. Полное разделение аминокислот, их идентификация и количественная оценка занимают менее трех часов. В методе Мура и Штейна используют короткую и длинную колонки, заполненные смолой из сульфонированного полистирола в Ыа+-форме. Когда кислотный гидролизат при pH 2 наносят на колонку, аминокислоты связываются в результате катионного обмена с Na+. Далее колонку элюируют раствором цитрата натрия при заранее запрограммированных значениях pH и температуры. Короткую колонку элюируют одним буфером, длинную— двумя. Элюат обрабатывают нингидрином, измеряя интенсивность окраски с помощью проточного колориметра. Данные автоматически регистрируются на ленте самописца и могут передаваться в компьютер для вычисления площади под пиком (рис. 3.12). [c.31]

Ионообменная хроматография широко используется для разделения биомолекул. Примером, свидетельствующим о ее высокой разрешающей способности, является приведенная на рис. 5.17 картина разделения аминокислот. Для разделения требуются две колонки одна (150 см) для кислых, нейтральных и ароматических а.минокислот, а другая (15 см) для основных аминокислот. Очевидно, что удерживание аминокислот зависит от их основности. Поэтому аспарагиновая и глутаминовая кислоты выходят с колонки раньше большинства нейтральных аминокислот и, естественно, значительно опережают выход основных аминокислот. В этом случае легко могут быть разделены даже нейтральные ампнокнслоты, поскольку, несмотря на близкие значеиня рК, их неполярные боковые цепи обладают различным сродством к смоле. В системе, представленной на рис. 5.17, элюат, выходящий нз колонки, автоматически смешивается с раствором нингидрина при прохождении аминокислоты с нингидрином через нагревательную ячейку появляется окрашивание, интенсивность которого [c.154]

Разделение первичных аминов, диаминов и полиаминов на ионообменных колонках с сорбентом типа аминекс с использованием несколько измененной аппаратуры, обычно применяемой для автоматического анализа аминокислот, показало, что жидкостная колоночная хроматография, по-видимому, является в настоящее время наиболее перспективным способом разделения [c.267]

Система позволяет анализировать в режиме сканирования окрашенные, флуоресцирующие и поглощающие УФ-излучение соединения, а также авторадиограммы. В ионообменной и лигандообменной тонкослойной хроматографии с помощью этого устройства молено измерять содержание отдельных аминокислот в процентах к общему количеству аминокислот. Для заданной аминокислоты в автоматическом рел име можно последовательно определить концентрацию шести отдельных компонентов в девяти образцах на одной хроматограмме. Видеодепсито-метрические измерения можно проводить со стандартным отклонением не более 5%. Воспроизводимость анализов характеризуется стандартным отклонением не более 1,5%. [c.101]