Дисульфидные мостики расщепление

Прежде чем проводить расщепление полипептидной цепи, обычно сначала разрывают дисульфидные мостики [138—141]. Для этой цели можно использовать три реакции [см. уравнения (2-20) —(2-22) ]. При работе с рибонуклеазой использовалось окисление надмуравьиной кислотой [c.173]

Рибонуклеаза (РНК-аза). Рибонуклеаза из поджелудочной железы быка (молекулярный вес 13 683) была вторым белком после инсулина (содержащего 51 аминокислоту), в котором удалось полностью установить последовательность расположения аминокислот. Молекула этого белка представляет собой поли-пептидную цепочку, состоящую из 124 аминокислотных остатков, в том числе восьми остатков цистеина. Последние соединены попарно четырьмя дисульфидными мостиками, которые заметно ограничивают набор возможных конформаций молекулы. Рибонуклеаза представляет собой фермент, катализирующий гидролитическое расщепление рибонуклеиновой кислоты. Из-за преобладания основных аминокислот его изоэлектрическая точка довольно высока — около pH 9,7. [c.118]

С-Концы пептидных цепей определяются избирательным отщепле нием концевой аминокислоты с помощью специфического фермента — карбоксипептидазы и последующей идентификацией этой аминокислоты. Если макромолекула белка состоит из двух (или более) пептидных цепей, как в случае инсулина (см. рис. 53), то избирательно разрушают дисульфидные мостики окислением (например, надмуравьиной кислотой) и затем полученные полипептиды разделяют путем фракционирования на ионитах. Для определения последовательности расположения аминокислот в каждой полипептидной цепи ее подвергают частичному кислотному гидролизу и избирательному расщеплению с помощью ферментов, каждый из которых разрывает полипептидную цепь только в определенных местах присоединения какой-то одной определенной аминокислоты или одного типа аминокислот (основных, ароматических). Таким образом получают несколько наборов пептидов, которые разделяют, используя методы хроматографии и электрофореза. [c.376]

Как известно, функция рибонуклеазы состоит в гидролитическом расщеплении рибонуклеиновых кислот и олигонуклеотидов. Как мы видели, это один из первых белков, изучавшихся с помощью ЯМР, хотя спектры, полученные на ранних стадиях, не обнаруживали характерных деталей. Рибонуклеаза близка по размеру (молекулярная масса 13700, 124 аминокислотных остатка) и форме к лизоциму и является удобным объектом для изучения методом ЯМР. В ее молекуле имеются 4 дисульфидных мостика, 18 остатков основных аминокислот (10 Лиз, 4 Apr и 4 Гис) и только 10 остатков кислых аминокислот (5 Глу и 5 Асп). Таким образом, в растворе при нейтральных pH молекула заряжена положительно. По сравнению с лизоцимом она содержит несколько меньше а-спиральных структур и больше -структур (остатки 42—49, 71—92 и 94—110). В дополнение к 4 Гис имеются также 6 Тир и 3 Фен, но нет остатков триптофана. Полная трехмерная структура рибонуклеазы известна из рентгеноструктурных исследований, проведенных двумя группами авторов [37, 38, 38а]. Форма ее глобулы близка к сферической имеется большая щель, в которой происходит связывание субстрата. С одной стороны этой щели расположены в непосредственной близости друг от друга остатки Гис-12, Гис-119 и Лиз-7, а с другой стороны находится Лиз-41. По данным подробных химических исследований все эти четыре остатка входят в активный центр. [c.363]

Химотрипсин — наиболее хорошо изученный протеолитический фермент. Он катализирует гидролитическое расщепление пептидной (или сложноэфирной) связи, в образовании которой принимают участие фенилаланин, тирозин или триптофан. Образование химотрипсина происходит в поджелудочной Железе первоначально образуется неактивный химотрипсиноген (зимоген) — резервная форма фермента. Основной компонент, химотрипсиноген А, представляет собой полипептидную цепь из 245 аминокислотных остатков и 5 дисульфидных мостиков. Активация и образование активного о -химотрипсина осуществляются сложным путем. После триптического расщепления связи Аг -11е последовательно одии за другим из молекулы отщепляются дипептиды 8ег -Аг и ТЬг -А5п . В результате одноцепочечный предшественник переходит в трехцепочечную молекулу фермента. Цепи А, В и С химотрипсина соединены исключительно дисульфидными связями. Рис. 3-32 показывает пространственную модель химотрипсина, установленную на основе рентгеноструктурных данных. [c.408]

Наличие поперечных химических связей в белках сообщает им специфические свойства, такие, как нерастворимость, меньшая способность к набуханию под действием полярных растворителей и повышенная прочность в мокром состоянии. В небольших молекулах таких биологически активных белков, как инсулин и рибонуклеаза, поперечные дисульфидные мостики оказываются необходимыми для проявления этими белками биологической активности. При этом дисульфидные поперечные связи не участвуют непосредственно в биохимических процессах, а функции их заключаются в сохранении в неизменном состоянии такой конформации молекул белка, которая необходима для проявления биологической активности. Модификация дисульфидных поперечных связей шерсти, а также введение в нее новых поперечных связей часто придают новые интересные свойства этому белку. Такими свойствами могут быть повышение прочности на разрыв, уменьшение способности к свой-лачиванию, увеличение устойчивости к агрессивным химическим реагентам (щелочи, кислоты, окислители или восстановители), повышение устойчивости к моли и износостойкости, а также повышение прочности окрашивания. Было показано, что дубление коллагена, необходимое для превращения сырья в технический продукт, также является процессом образования поперечных связей. Поскольку коллаген не содержит цистеина или цистина, в сшивании, протекающем при дублении, участвуют, по-видимому, другие группы, возможно аминные и гидроксильные. В настоящем разделе будут рассмотрены в первую очередь поперечные химические связи упоминавшихся выше классов белков. Шерсть — типичный кератин, являющийся одним из наиболее детально изученных в этом плане белков, дает интересные и наглядные примеры образования, расщепления и поведения как дисульфидных, так и вводимых искусственно поперечных химических связей другого типа. [c.395]

Внутримолекулярное связывание боковых радикалов двух остатков цистеина создает дисульфидный мостик, который обычно способствует упорядоченности конформации. Многие обладающие важными биологическими функциями полипептиды имеют первичную структуру, включающую дисульфидные мостики между остатками цистеина, которые отделены друг от друга в полипептидной цепи несколькими атомами, что приводит к образованию многочленных колец. Влияние дисульфидных мостиков на конформацию полипептидной цепи, находящейся между двумя остатками цистеина, легко видеть по возрастанию неупорядоченности, происходящему при расщеплении дисульфидных групп. Лизоцим после расщепления дисульфидных связей теряет около 50 % своих а-спиральных участков [27], однако расщепление полипептидной цепи в двух точках (по остаткам метионина) приводит к трем пептидным фрагментам, соединенным дисульфидными мостиками и ли- [c.433]

Некоторые препараты гликопротеинов групп крови, например, выделяемые из жидкости кисты яичника и из слизистой желудка лошади, разделяются на фракции — легко растворимую и трудно растворимую в воде. Последняя, по-видимому, состоит из гигантских молекул, в которых полипептидные цепи связаны дисульфидными мостиками. Расщепление их обычными методами дает растворимые гликопротеины. [c.179]

Таким образом, пептидные цепи могут быть сшиты дисуль-фидными мостиками. Расщепление пептидной связи происходит при гидролизе, дисульфидная же связь разрывается путем восстановления [c.395]

РАСЩЕПЛЕНИЕ ДИСУЛЬФИДНЫХ МОСТИКОВ [c.88]

Установлено строение белкового гормона инсулина, регулирующего сахарный обмен в организме, а также строение рибонуклеазы — катализирующего гидролитическое расщепление рибонуклеиновых кислот (стр. 433) на простые нуклеотидные остатки. Молекула рибонуклеазы, имеет цепь из 124 аминокислотных остатков. Эта цепь сложена определенным образом и удерживается в этом состоянии четырьмя дисульфидными мостиками (за счет содержащей такие мостики аминокислоты цистина). В 1969 г. появилось сообщение о синтезе этого фермента. [c.427]

ОТ применения окислительного расщепления дисульфидных мостиков. Для иллюстрации метода окислительного расщепления ниже описаны приемы, использованные при изучении инсулина и рибонуклеазы. [c.98]

Фосфолипаза Аг поджелудочной железы свиньи [123] представляет собой белок с молекулярной массой 14 000, присутствует в виде ферментативно неактивного зимогена, активация которого достигается расщеплением связи Arg—Ala, что приводит к образованию фосфолипазы Аг и гептапептида. Фосфолипаза Аз содержит 123 аминокислоты и 6 дисульфидных мостиков. Определена полная аминокислотная последовательность фермента и расположение дисульфидных связей. [c.271]

Панкреатическая рибонуклеаза быка (мол. в. 14 ООО) представляет собой одиночную полипептидную цепь, построенную из 124 аминокислот, причем в настоящее время определена их последовательность В определенных местах полипептидная цепь сшита четырьмя дисульфидными мостиками (см. раздел Белки ). Расщепление дисульфидных мостиков приводит к потере каталитической активности фермента. [c.297]

Р-Галактозидаза Е. соИ изучена лучше других галактозидаз [86, 87]. Этот фермент имеет молекулярный вес 518 000. Он может быть расщеплен солянокислым гуанидином на 4, а окислением надмуравьиной кислотой на 12 субъединиц соответственно. Аминокислотный состав его известен, но пока открыты только 4—5 N-концевых групп. Его молекула содержит около 20 дисульфидных мостиков [88]. [c.158]

ХИМОТРИПСИН, фермент класса гидролаз, относится к эндопептидазам. Мол. масса бычьего X. 25 300, р1 9, оптим. каталитич. активность при pH 7,5—8,0, состоит из трех цепей, связанных дисульфидными мостиками. По типу каталитяч. центра относится к группе серин-гистидиновых гидролаз. Образуется в поджелудочной железе позвоночных из предшественника (химотрипсиногена) последоват. отщеплением двух дипептидов в середине цепи. Катализирует гидролиз белков, пептидов, эфиров и амидов аминокислот проявляет специфичность к гидрофобным аминокислотам, участвует в расщеплении белков пищи в тонком кишечнике. Ингибируется ионами тяжелых металлов, борорг. к-тами, диизопропилфторфосфатом и др. Избирательно гидролизует белки пораженных тканей. Использ. для лечения тромбозов, ожогов. [c.654]

Поскольку растворы цианидов обладают высокой щелочностью, реакции деструкции, протекающие в такой среде, сильно осложняют использование этого реагента. В сильно щелочной среде может происходить даже полное расщепление пептидных и дисульфидных связей, а также может иметь место разложение образующегося из дисульфида тиоцианата. Если одновременно с расщеплением дисульфидных мостиков окислять образующиеся сульфгидрильные группы цистеина снова в цистин, то иногда удается полностью превратить всю исходную серу, входящую в состав цистиновых звеньев, в тиоцианатную [276]. [c.406]

Применение. В качестве специфического реактива восстановительного рас- щепления дисульфидных мостиков, для стабилизации и регенерации сульфгидрильных групп, В качестве добавки к секвенатррным растворам, повышающей стабильность введенной пробы и способствующей последующему расщеплению дисульфидных связей [2]. Как активатор креатинкиназы в сыворотке крови и как реактив для количественного определения креатинфосфокиназы [3, 4] и расщепления дисульфидных связей в кератине [5], Восстанавливает дисуль-фидные связи в пептидах и белках в жидком аммиаке без каких-либо обна руживаемых побочных реакций [6]. [c.143]

Рис. 55.8. Схематическое строение протромбина. N-конец— слева область 1 содержит все остатки Gla Показаны сайты расщепления фактором и наименования продуктов расщепления. Локализация каталитически активного остатка серина обозначена А. Л- и В-цепи активного тромбина заштрихованы) удерживаются вместе дисульфидным мостиком.

Фосфолипиды, находящиеся на внутренней стороне плазматической мембраны тромбоцитов, экспонируются в результате индуцированного коллагеном разрушения и дегрануляции тромбоцитов. Эти фосфолипиды связывают ионы Са + и протромбин (последний, по N-концевой области, содержащей остатки Gla). Тромбоциты содержат также фактор V, который в активированной форме (VJ соединяется со специфическими рецепторами на мембране тромбоцитов (рис. 55.9). Фактор служит рецептором для фактора Хз, который в свою очередь связывает протромбин в области F-1-2 (рис. 55.8). Фактор Х также является сериновой протеазой, он расщепляет каталитически неактивную молекулу протромбина в областях, указанных на рис. 55.8. При этом высвобождается N-концевая часть протромбина. В результате расщепления тромбина фактором Х образуются полипептиды тромбина А и В, связанные дисульфидным мостиком. [c.327]

Это предположение основывается на том, что трипептид глута-тион в дисульфидной форме, по-видимому, также имеет циклическое строение, отвечающее формуле II, и подтверждается следующими наблюдениями. Цистин обладает максимальным молекулярным вращением вблизи изоэлектрической точки ( [М]5641=—7 85 pH = 3—7), при сдвиге в более кислую или щелочную область вращение понижается М]5641 = —613 нри pH = 2 1М]5641 = —168 при рн = 12. Горовиц (1961> пpипи ывaef большие изменения [аЬ, происходящие при расщеплении надмуравьиной кислотой дисульфидных мостиков в белках, богатых цистином, деструкции жестких цистиновых структур, образуемых за счет водородных связей. [c.654]

Так как белковые молекулы часто связаны между собой дисульфидными мостиками (или же такие мостики присутствуют внутримолекулярно), то важным химическим приемом, предворя-ющим все остальные, является расщепление этих связей. Для достижения цели используются различные реагенты, среди которых одним из наиболее популярных можно считать [c.97]

Расщепление полипептидных цепей, содержащих дисульфидные мостики, обычно приводит к сложной смеси низших пептидов. При реконструкции полипептидной цепи установление исходного порядка дисульфидных связей — довольно трудная задача. Один из путей ее решения дает диагональный электрофорез по Хартли, при котором пептиды после ферментативного гидролиза сначала разделяют электрофоретически на полосе бумаги. [c.365]

Пролин и оксипролин полностью устойчивы к действию фермента.- Цистеин в продуктах расщепления не был обнаружен. Полуцистин, если он присутствует в продуктах расщепления, мог образоваться за счет разрыва пептидной связи при этом связь с полипептидной цепью дисульфидным мостиком сохраняется. Окисление остатков цистина в цистеиновую кислоту не должно давать способную отщепляться под действием карбоксипептидазы группу, так как она содержит заряженную боковую цепь, но восстановление и алкилирование до --S H2 ONH2-rpynn приводят к образованию нейтрального остатка. Такой остаток был недавно обнаружен [198] в гидроЛизатах, полученных при действии карбоксипептидазы на восстановленный и алкилированный пролактин, что свидетельствует о присутствия С-концевого полуцисти нового остатка. [c.233]

Ковальски [4, 5] и Мендел [7, 8] сообщили о заметных изменениях в спектрах рибонуклеазы, снятых при 60 и 100 МГц. Изменения, главным образом, проявляются в сужении пиков при расщеплении дисульфидных мостиков или при нагревании водного раствора белка выше температуры 65 °С, при которой обычно происходит денатурация. Мак-Дональд и Филлипс [9—11, 24] показали, что если раствор денатурированного белка с неповрежденными ди-сульфидными мостиками охладить ниже температуры ренатура-ции, то при повторном свертывании цепей в спектре на частоте 220 МГц появляется много новых резонансных сигналов и изменяется распределение интенсивностей пиков по всему спектру. Это видно из рис. 14.8. Здесь (а) —спектр рибонуклеазы поджелудочной железы быка, построенный по спектрам составляющих его аминокислот, подобно тому, как это показано для лизоцима на рис. 14.4, а. Спектр (б) относится к термически денатурированному [c.363]

После того как будет определена последовательность аминокислот во всех продуктах деградации и в соответствующем числе перекрывающихся пептидов, полную последовательность нативной полипентидной цепи можно считать установленной. (Ниже мы это покажем на конкретном примере.) Последнее, что требуется сделать, — это установить положение дисульфидных мостиков. С этой целью подвергают ферментативному расщеплению белок, дисульфидные связи которого не нарушены. Обычно небольшого числа дополнительных анализов (по установлению последовательности) оказывается достаточно для полной локализации групп, участвующих в образовании дисульфидных связей. [c.91]

Галактозидаза Е. соН изучена лучше других галактозидаз [59]. Этотфермент имеет молекулярную массу 518 ООО. Он можетбыть расщеплен солянокислым гуанидином на 4, а окислением надмуравьиной кислотой на 12 субъединиц соответственно. Известен его аминокислотный состав. Его молекула содержит около 20 дисульфидных мостиков. [c.43]

Примером использования ионообменной хроматографии для изучения свойств ферментов может служить работа Таниуши и сотр. [203]. Нуклеаза стафилококка представляет собой фермент, 149 аминокислот которого связаны в единую пептидную цепь без дисульфидных мостиков. Этот свободный фермент легко расщепляется различными протеазами, вызывающими его дезактивацию и деградацию на пептиды и аминокислоты. В присутствии лиганда дезокситимидин-3, 5-дифосфата (рс1Тр) и ионов Са + значительно повышается устойчивость фермента по отношению к денатурации и уменьшается степень его расщепления протеазами. Термолизин вовсе не расщепляет этот фермент, а трипсин, химотрипсин и субтилизин расщепляют его [c.318]

Данных по аминокислотной последовательности каждой полипептидной цепи белка еще не достаточно для установления его первичной структуры. Необходимо определить число и местоположение дисульфидных мостиков, связывающих эти цепи в единое целое. Разрешение этой задачи требует очень мягких условий гидролиза, ибо воздействие таких реагентов, как концентрированная соляная кислота приводит к окислению цистина до цистеиновой кислоты и ряда других продуктов. Поэтому белок подвергают энзиматическому гидролизу в возможно более мягких условиях и в присутствии тиоловых ингибиторов (например, Ы-этилмалеинимида). Часто для этой цели используют пепсин и химотрипсин, и расщепление ведут при pH 1,9 и 8,0 соответственно. Полученную смесь пептидов подвергают разделению с помощью одного или нескольких перечисленных выше приемов, п фрагменты, содержащие дисульфидную связь, выделяют в чи- [c.86]

После расщепления бромоцианом и триптического гидролиза были выделены три коротких пептида, связанные дисульфидными мостиками (вероятное положение дисульфидных связей указано штриховыми линиями). Поскольку при анализе руководствовались известной структурой, пептиды были подвергнуты одностадийной деградации по Эдману в секвенсере, обессолены и фракционированы. При этом были получены два фрагмента [c.175]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология