Рибонуклеаза спектр ПМР

Использование этих стандартных спектров КД для подсчета соотношений а-спирали, -формы и неупорядоченных конформаций глобулярных белков с попыткой воссоздания экспериментально измеренного спектра КД белка по алгебраической сумме различных долей спектра из трех чистых конформаций стало главным применением этого спектроскопического метода в данной области. Достигаемая при этом точность зависит от того, насколько конформационно чистым является стандарт, и для этой цели были рекомендованы и несколько поли ( -аминокислот). Неопределенностью, однако, является то, в каких условиях эти поли (аминокислоты) становятся полностью конформационно неупорядоченными. В качестве стандарта с неупорядоченной конформацией предложен поли ( -серин) при высоких солевых концентрациях [23]. КД-спектры, вычисленные для миоглобина, лизоцима и рибонуклеазы на основе их третичных структур, которые ранее были установлены для этих глобулярных белков по данным рентгеноструктурного анализа, согласуются по всем характеристическим точкам с экспериментальными спектрами КД при использовании в качестве одного из стандартов поли ( -серина) [35]. Подобные данные по анализу соответствия кривых по нативным белкам и полипептидам многочисленны, и они дают информацию о степени конформационной упорядоченности этих веществ в растворах [36]. Эти данные не дают, конечно, ответа на вопрос, какая именно часть первичной структуры а-спирализована, какая отвечает -форме и какая— неупорядоченной, однако основываясь на последовательности аминокислотных остатков белка или полипептида, можно строить рискованные предположения о том, где эти конформации локализованы. Как отмечалось в разд. 23.7.2.4, аминокислоты белков разделяются на те, которые при включении в полипептиды способствуют принятию упорядоченной конформации, и те, которые тому не способствуют. Такая информация получена при рассмотрении [c.437]

Однотипные ядра, например протоны, в разных частях молекулы имеют разное магнитное окружение и резонируют при различающихся значениях В. Это дает возможность при высокой разрешающей силе Я МР-спектрометра получить отдельные сигналы для каждой группы однотипно расположенных в молекуле ядер. В качестве примера на рис. 92 приведен фрагмент протонного ( 11) спектра ЯМР фермента рибонуклеазы в области, где резонируют протоны, связанные с атомами С2 и С4 имидазольных колец остатка гистидина. Все четыре остатка гистидина, находящиеся в молекуле фермента в положения.ч 12, 48, 105 и 119, дают отдельные сигналы, отличающиеся на несколько миллионных долей (м.д.) от магнитной индукции, создаваемой магнитом ЯМР-спектрометра. [c.314]

Рис. 14.8. Спектры рибонуклеазы бычьей поджелудочной железы (220 МГц)

Рис. 8.4. Спектр ЯМР С ПФ нативной (а) и денатурированной (б) рибонуклеазы А [26].

Таким образом, результаты этих опытов показывают, что конформация молекулы, обусловливающая ее ферментативную активность, полностью определяется последовательностью аминокислот в полипептидной цепи. Для того чтобы остатки цистеина соединились правильно, пе нужно никакого специального фермента. Образование специфических дисульфидных связей требуется, по-видимому, лишь для стабилизации активной конформации, а не для ее возникновения. В результате восстановления и последующего окисления рибонуклеазы образуется продукт, имеющий ту же ферментативную активность, ультрафиолетовый спектр, характеристическую вязкость, дисперсию оптического вращения и те же иммунологические свойства, что и нативный фермент. Пептидные карты, получаемые после ферментативного расщепления этих двух веществ, также идентичны. Если 6l.i расположение дисульфидных связей в нативной и реконструированной рибонуклеазе было различным, пептиды, содержащие такие связи, не могли бы попасть, на одинаковые места карты. [c.279]

При добавлении мочевины к воде показатель преломления среды увеличивается. Учитывая это, объясните, почему при добавлении малых количеств мочевины к водному раствору рибонуклеазы в ее разностном спектре наблюдается небольшой сдвиг при 285 ммк в красную область спектра, а при увеличении концентрации мочевины до 5 М — резкий сдвиг в голубую область. [c.301]

Пример необратимого изменения конформации, отображающегося на кривой титрования, уже был приведен для случая рибонуклеазы (см. рис. 32). Более наглядным примером может служить гемоглобин (рис. 172). Обратимая часть кривой титрования соответствует в данном случае относительно небольшому количеству групп, которые в обычных условиях титровались бы в кислой области. Гораздо большее количество титруется в необратимой области, зависящей от времени, при рН=3,5. То, что при этом pH происходит изменение конформации, подтверждается также спектрами поглощения. Природа такого изменения еще не выяснена. [c.640]

Рис. 14.1. Спектр раствора рибонуклеазы в ОгО (40 МГц) [1].

Как известно, функция рибонуклеазы состоит в гидролитическом расщеплении рибонуклеиновых кислот и олигонуклеотидов. Как мы видели, это один из первых белков, изучавшихся с помощью ЯМР, хотя спектры, полученные на ранних стадиях, не обнаруживали характерных деталей. Рибонуклеаза близка по размеру (молекулярная масса 13700, 124 аминокислотных остатка) и форме к лизоциму и является удобным объектом для изучения методом ЯМР. В ее молекуле имеются 4 дисульфидных мостика, 18 остатков основных аминокислот (10 Лиз, 4 Apr и 4 Гис) и только 10 остатков кислых аминокислот (5 Глу и 5 Асп). Таким образом, в растворе при нейтральных pH молекула заряжена положительно. По сравнению с лизоцимом она содержит несколько меньше а-спиральных структур и больше -структур (остатки 42—49, 71—92 и 94—110). В дополнение к 4 Гис имеются также 6 Тир и 3 Фен, но нет остатков триптофана. Полная трехмерная структура рибонуклеазы известна из рентгеноструктурных исследований, проведенных двумя группами авторов [37, 38, 38а]. Форма ее глобулы близка к сферической имеется большая щель, в которой происходит связывание субстрата. С одной стороны этой щели расположены в непосредственной близости друг от друга остатки Гис-12, Гис-119 и Лиз-7, а с другой стороны находится Лиз-41. По данным подробных химических исследований все эти четыре остатка входят в активный центр. [c.363]

Спектры ПМР белков чрезвычайно сложны, однако в их расшифровке достигнуты весьма значительные успехи [170—175]. На рис. 2-41 приведены спектры ПМР -фермента рибонуклеазы, полученные при 60 и 220 МГц. Как легко видеть, при более высокой частоте разрешение выше. Обращает на себя внимание и тот факт, что после тепловой денатурации фермента (до 72,5°С) многие сигналы спектра, снятого при 220 МГц, оказываются более узкими. Это означает, что в результате денатурации все однотипные боковые группы белка попадают в примерно эквивалентное окружение. Кроме того, было показано, что спектры ПМР для белков, находящихся в кон- зормации статистического клубка, хорошо соответствуют спектрам, которые можно получить, исходя из стандартных химических сдвигов отдельных аминокислот [171], что согласуется с изложенным выше. [c.187]

РИС. 2-41. Спектр ПМР для нативной рибонуклеазы, снятый при 60 МГц (А) и 220 МГц (Б) и для денатурированного фермента, снятый прн 220 МГц (В). Концентрация фермента в НзО составляла 11%, pD = 7.5 (А) н 6,8 (Б). Эталон —соль Тьера (Ma Donald С. С., Phillips W. D., J. Am. hem. So ., 89. 6333, 1967). [c.187]

Самый ценный вывод, который был сделан на основании данных, полученных методом рентгеноструктурного анализа, состоит в том, что основной группой, отщепляющей протон от 2 -гидроксила, является Н1з-12, в то время как кислотная группа, отдающая протон уходящему 5 -кислороду, принадлежит Н1з-П9 [59]. (Любопытно, однако, что синтезированное производное рибонуклеазы с М -карбоксиметилированным остатком Н13-12 проявляет некоторую каталитическую активность — факт, в связи с которым возникает ряд вопросов [60].) Характер зависимости активности рибонуклеазы от pH согласуется с предложенным механизмом, поскольку найдены два значения р а (5,4 н 6,4), соответствующие двум группам, состояние ионизации которых контролирует активность фермента. (На основании ЯМР-спектров, показанных на рис. 2-42, было получено значение р/Са, равное 5,8.) Вблизи двух остатков гистидина расположен остаток Ьуз-41. Возможно, его положительный заряд используется для частичной нейтрализации отрицательного заряда на атомах кислорода фосфатной группы, облегчая атаку нуклеофильным агентом. С точки зрения химии рибонуклеазы интересен тот-факт, что под действием бактериальной пептидазы отщепляется фрагмент, содержащий двадцать аминокислотных остатков. Этот 5-пептид . Может воссоединяться с остальной частью молекулы с образованием активного фермента, называемого рибонуклеазой 5. Структура этого, фермента была определена методом дифракции рентгеновских лучей и по существу оказалась аналогичной структуре нативной рибонуклеазы. [c.121]

Эффекты Коттона от хромофоров боковых радикалов (т. е. от группировок, поглощающих при большей длине волны, чем амидные хромофоры цепи) могут быть использованы для выяснения некоторых локальных конформационных особенностей. Увеличение КД рибонуклеазы при 240—320 нм было отнесено за счет влияния боковых радикалов остатков тирозина, расположенных тесно друг к другу и находящихся в глубине третичной структуры [40]. Введение хромофора в Л -концевую группу олигопептида иллюстрирует этот же подход. Имеющие концевую -тиобензоильную группу пептиды Ph (S)NH HR O. .... имеют в спектрах КД поглощение [c.438]

Влияние лигандов, в том числе органических веществ, на структуру и свойства белков очень разнообразно. Известно, что низшие спирты, амины, амиды и другие вещества вызывают развертывание белковых глобул [128, 130], понижают температуру термического перехода глобула — клубок [131, 132] (в случае рибонуклеазы) и перехода тройная спираль — клубок (для коллагена) [133]. Существуют многочисленные наблюдения, показывающие, что образование комплексов белка с большим числом ПАВ [134—137] может сопровождаться частичной дезорганизацией молекулы белка, проявляющейся в изменении растворимости, вязкости, УФ-спектров, оптического вращения [138—146], Полная дезорганизация белка (денатурация) наблюдается при взаимодействии с большими количествами додецил- и тетрадецилсульфата натрия [142—145]. С другой стороны, известно и стабилизирующее действие органических соединений на структуру белка. Например, в работах [146—149] установлено, что низкие концентрации ПАВ стабилизуют белки против денатурации мочевиной в кислых и щелочных областях pH. Авторы [150] наблюдали стабилизирующее действие стероидов. В работе [151] также отмечалось стабилизирующее действие малых концентраций ПАВ на структуру белка и разрушающее больших. [c.28]

Ковальски [4, 5] и Мендел [7, 8] сообщили о заметных изменениях в спектрах рибонуклеазы, снятых при 60 и 100 МГц. Изменения, главным образом, проявляются в сужении пиков при расщеплении дисульфидных мостиков или при нагревании водного раствора белка выше температуры 65 °С, при которой обычно происходит денатурация. Мак-Дональд и Филлипс [9—11, 24] показали, что если раствор денатурированного белка с неповрежденными ди-сульфидными мостиками охладить ниже температуры ренатура-ции, то при повторном свертывании цепей в спектре на частоте 220 МГц появляется много новых резонансных сигналов и изменяется распределение интенсивностей пиков по всему спектру. Это видно из рис. 14.8. Здесь (а) —спектр рибонуклеазы поджелудочной железы быка, построенный по спектрам составляющих его аминокислот, подобно тому, как это показано для лизоцима на рис. 14.4, а. Спектр (б) относится к термически денатурированному [c.363]

Четыре остатка Гис рибонуклеазы были оттитрованы и отнесены по отдельности. Мы видели, что два из них (Гис-12 и Гис-119) входят в активный центр. Брэдбери и Шерага [6] первые показали (на 60 МГц), что протоны при С-2 гистидиновых остатков этого белка дают раздельные сигналы и можно провести титрование имидазольных колец так, как это описано в разд. 13.2 для свободного гистидина и в разд. 14.2.3 для единственного остатка гистидина в лизоциме. Жардетский и сотр. расширили эти наблюдения [21, 39—42]. Ароматическая область спектра (100 МГц) раствора рибонуклеазы в ОгО с дейтероацетатным буфером при четырех значениях pH, соответствующих величинам р/< гистидиновых имидазольных колец, приведена на рис. 14.9. Протоны при С-2 дают четыре раздельных пика слева от основного спектра при pH=4,95 [c.365]

Рис. 14.9. Спектры (100 МГц) 0,012Л1 раствора рибонуклеазы в ВгО с дейтероацетатным буфером [21] а —При рН=4,95 (100 прохождений при накоплении) б —при рН=5,37 (14 прохождений) в —при рН=6,93 (51 прохождение) г —при рН=8,12 (57 прохождений). Пики 1—4 принадлежат протонам при С-2 четырех остатков гистидина, пик 5 — протону при С-4 имидазола. Широкий резонансный сигнал справа включает пики трех других С-4 протонов имидазола. а также пики шести остатков тирозина и трех остатков фенилаланина. Химические сдвиги приведены относительно ГМДС (внешний эталон).

Рис. 14.10. Кривые титрования сигналов протонов при С-2 и С-4 гистиди-ноеых остатков рибонуклеазы, соответствующие спектрам на рис. 14.9.

Пепсин, папайи и субтилизип обладают низкой специфичностью. Поэтому, за исключением пепсина, в этих ферментах, трудно обнаружить примеси других ферментов. В случае пепсина это не имеет большого значения, так как оптимум его активности наблюдается при pH 1,8—2,2, в то время как возможные примеси других ферментов проявляют свое действие в среде, близкой к нейтральной. Влияние примесей может быть ослаблено уменьшением времени переваривания исследуемого белка ферментом. Пепсин разрывает пептидные связи, соседние как с глутаминовой кислотой или глутамином, так и с фенилаланином или тирозином. Иногда отсутствие специфичности проявляется в том, что он гидролизует связи аланин — аланин и аланин — серии. Папаин обладает аналогичной низкой специфичностью с еще более широким спектром активности. Субтилизин также имеет широкий спектр активности, гидролизуя связи, которые расщепляют трипсин, химотрипсин и пепсин. Однако его особым преимуществом является способность гидролизовать нативные белки. Следовательно, с его помощью могут быть обнаружены дисульфидные моспжи, например в инсулине и рибонуклеазе. [c.395]

ИЛИ совсем не обмениваться. В тех случаях, когда атомы водорода участвуют в водородных связях или находятся в гидрофобных областях вне контакта с растворителем, их нормальная скорость Обмена снижается. Для определения скорости обмена дейтерированный белок растворяют в Н2О и через определенные интервалы времени измеряют плотность растворителя, которая зависит от относительного содержания дейтерия. Можно также использовать в подобных экспериментах радиоактивный тритий или определять скорость обмена по уменьшению интенсивности амидной полосы поглощения в инфракрасной области при 1550 м , которое наблюдается при растворении белка в D2O. Последний способ является наиболее удобным. Определение скорости изотопного обмена можно производить и по другим полосам поглощения в инфракрасной области, а также с помощью магнитного ядерного резонанса. В случае малых полипептидов для этой цели можно использовать спектры комбинационного рассеяния. Следует учесть, что эти методы приводят к правильному результату только в тех случаях, когда изотопное замещение не вызывает изменения конформации белка. Например, для нормальной рибонуклеазы температура перехода в воде при pH 4,3 равна 62°, а для дейтерированной, растворенной в D2O, она равна 66°. Таким образом, дейтерирование способствует сохранению спиральной конформации. Поэтому при анализе экспериментов по изотопному обмену, проводимых при 65°, необходимо учитывать изменение относительного содержания фракций белка, имеющих различную конформацию. Во избежание подобных осложнений следует проводить опыты в условиях, исключающих возможность конформационных переходов. [c.295]

Белки. Спектры ЭПР у-облученных при 77° К бе.чков зависят от аминокислотного состава макромолекул. Так, в желатине, гемоглобине, проколлагене, протамине, в составе которых нет серусодержащих аминокислотных остатков, зарегистрированы симметричные многокомпонентные спектры с g = =2,0036. В спектрах фиброина шелка, пол и-у-метил- -гл утамата, поли-у- бен-зил- -глутамата, пепсина, миозина есть синглеты с g = 2,006 -ь 2,008. Белки,. имеющие в составе большое количество серусодержащих аминокислотных остатков (рибонуклеаза, трипсин, яичный и сывороточный альбумин, лизоцим), дают асимметричный спектр с неразрешенной структурой [193—196]. Исчезающие при действии света парамагнитные центры можно отнести к захваченным зарядам [196]. Кроме того, предпо.чагают образование радикалов [c.308]

В принципе сканирующим методом можно получить больще всего сведений, так как он дает информацию об электронной структуре активного центра и о конформации фермент-субстратных комплексов. Однако его практическое использование часто затрудняется сложностями при разрещении широких перекрывающихся линий в спектрах больших белковых молекул, а также еще и необходимостью выполнения измерений протонного резонанса в DsO, для чего обычно требуется неоднократная лиофилизация белка. Первое осложнение преодолевается применением новейшей техники с большой разрешающей способностью [59]. О ее воз-можностях можно судить по работе Ярдецкого с сотр. [60], посвященной механизму действия рибонуклеазы. Предварительные эксперименты такого рода были выполнены и с аденилаткиназой (разд. 3.3). [c.671]

В устройстве, показанном на рис. 2.2, недиспергиро-ванный луч падает на образец, и при поглощении излучения его температура повышается. Повышение темпера- туры может быть значительно уменьшено, если поменять местами источник и детектор. Выходящий из спектрометра диспергированный луч, который с помощью отражательного микроскопа собирается на образце, обладает меньшей энергией, чем весь луч, поэтому прогрев образца незначителен. Подобную конструкцию использовал Эл лиот [35] при наблюдении инфракрасного спектра единичного кристалла рибонуклеазы, на которую сильно воздействует теплота, поглощенная от недиспергирован-ного луча. Котц и сотр. [30] использовали подобное соображение в микроспектрометре Перкин — Эльмер , схема которого показана на рис. 2.3. [c.26]

Другая серия работ, проводимых в лаборатории Д. Г. Кнорре (С. К. Василенко и др.), направлена на установление первичной структуры олигонуклеотидов и т-РНК. Основу этих исследований составляет остроумное использование фосфодиэстеразы змеиного яда. Олигонуклеотиды тина Pup(Pup)nPyp, образующиеся при гидролизе РНК панкреатической рибонуклеазой, после снятия З -концевой фосфатной группы подвергали неполному перевариванию фосфодиэстеразой. При этом образуется набор олигонуклеотидов разной длины, причем конце вой нуклеотид в смеси находится в виде нуклеозида. Полученные фрагменты отличаются по величине и могут быть разделены ионообменной хроматографией. Сравнение спектров олигонуклеотидов, содержащих т я (т + 1) нуклеотидов, позволяет определять т + 1)-й нуклеотид. Таким образом, сравнивая попарно олигонуклеотиды, можно определить последовательность в исходном олигонуклеотиде. Работа выполнена совместно с Институтом химии природных соедипений АН СССР. [c.522]

Благодаря дифференциальной активации генов образуется мРНК, которая участвует в морфогенезе и называется морфогенетической. На примере ацетабулярии исследователи часто демонстрируют морфогенетическую функцию РНК в опытах с рибонуклеазой и актиномицином. Необходимость синтеза белка для проявления морфологического действия РНК доказывается опытами с пуромицином. При прививках или трансплантации ядер изменяется также специфический для каждого вида, электрофоретически различимый изоферментный спектр в соответствии с видовой принадлежностью имеющегося клеточного ядра. [c.391]

Бпервые спектр ЯМР белка наблюдали Саундерс и сотр. [1] для раствора рибонуклеазы в ОгО. Эти измерения были выполнены на приборе с рабочей частотой 40 МГц. В спектре было обнаружено 4 широких пика (рис. 14.1) без тонкой структуры. Отнесение сигналов было проведено обычным способом О. Жардецким и С. Д. Жардецким [2]. Бови с сотр. [3] описали спектры растворов многих белков в трифторуксусной кислоте на частоте 40 МГц. В этом растворителе белки имеют полностью развернутую структуру. В спектрах удалось наблюдать и отнести уже девять пиков. Наблюдалось также сужение резонансных линий в спектре раствора бычьего сывороточного альбумина в ОгО при развертывании в присутствии мочевины. Ковальски наблюдал спектры многих белков на частоте 56,4 МГц [4] и выполнил, в частности, важное исследование цитохрома с на частоте 60 МГц [5]. В спектре последнего он наблюдал пики, появляющиеся на несколько миллионных долей в более сильном поле от эталонного сигнала ДСС (см. [c.348]

Смотреть страницы где упоминается термин Рибонуклеаза спектр ПМР: [c.188] [c.70] [c.181] [c.88] [c.181] [c.142] [c.348] [c.348] [c.385] [c.386] [c.70] [c.405] [c.205] [c.206] [c.206] [c.359] [c.321] [c.628] [c.192] [c.196] [c.22] [c.192] [c.348]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология