Разделяющий гель

Буфер для приготовления разделяющего геля — 1,5 М трис-НС1 буфер, содержащий 0,4%)-ный ДСН, pH 8,8. [c.121]

Раствор образца перед нанесением либо сгущают, например добавляя сахарозу, либо вводят в слой геля при его полимеризации (рис. 12.9). За слоем, содержащим образец, следует слой фокусирующего геля с равномерной низкой концентрацией полиакриламидного геля. В этом слое компоненты образца после их миграции из геля с образцом концентрируются в зону, в которой они с различной степенью разделения следуют друг за другом. На этом этапе сфокусированные компоненты образца переходят в следующий слой более концентрированного разделяющего геля. Электрофоретическая подвижность макромоле-кулярных соединений уменьшается до такой степени, что низкомолекулярный замыкающий ион догоняет концентрирован- [c.301]

Сложную картину с большим числом полос наблюдают при электрофорезе препарата тяжелого меромиозина в присутствии додецилсульфата натрия. В этом случае представляет интерес сопоставить данные по электрофорезу препарата ТММ (тяжелого меромиозина) в диссоциирующих и в недиссоциирующих условиях. Нативный электрофорез в этом случае проводят в трис-глициновом буфере (pH 8,9) на пластинах с 5%-ным разделяющим гелем и 2,5—3%-ным концентрирующим гелем. В этом случае препарат тяжелого меромиозина дает в основном одну полосу, расположенную недалеко от старта, с м. м. 350 ООО Да. Это свидетельствует о том, что, несмотря на наличие многочисленных внутренних разрывов в полипептидных цепях, возникших в результате протеолиза, фрагменты цепей держатся вместе за счет нековалентного взаимодействия. При этом обеспечивается функциональная целостность структуры (сохранение АТФазной активности). [c.397]

Как видно из рис. 102, экспериментально полученные зависимости согласуются с теорией. Однако, было обнаружено, что сильное влияние на правильную последовательность миграции (маленькие молекулы перед большими) и подвижность анализируемых веществ оказывают также температура, сила поля и концентрация геля. В экстремальных случаях может наблюдаться инверсия последовательности миграции, т.е. более длинные фрагменты ДНК движутся сквозь разделяющий гель быстрее, чем меньшие фрагменты ДНК. Это нежелательное явление можно в общем случае [c.104]

I — слой геля с образцом 2 — фокусирующий гель 3 — разделяющий гель 4 — нижний электрод, платиновая проволока 5 — верхний электрод, платиновая проволока 6 — верхняя электродная ячейка 7 — верхний электролит В — нижняя электродная ячейка 9 — нижний электролит 10 — стеклянная трубка и — кольцевое резиновое уплотнение. Полярность электродов установлена для электрофореза анионов для разделения катионов, например основных белков, полярность должна быть обратной. [c.301]

Электрофорез проводят в стеклянных трубках длиной около 70 мм с внутренним диаметром около 5 мм. Перед употреблением трубки тщательно промывают смесью хромовой и серной кислот или горячей азотной кислотой, водой и в заключение ацетоном. Сухие трубки держат вертикально и дно их закрывают резиновым уплотнением так, чтобы резина не входила в трубку. В качестве уплотнения можно использовать резиновые крышки к флаконам для сыворотки, перевернув их наоборот. Исходные растворы для приготовления геля (см. табл. 12.6 и 12.7) хранятся при 4°С в темных бутылях, которые выдерживают при комнатной температуре и откачивают водоструйным насосом, чтобы уменьшить содержание кислорода, ингибирующего полимеризацию. Если нижняя часть столбика геля не достаточно ровная, то в каждую трубочку вводят 0,1 мл 40%-ного раствора сахарозы и осторожно покрывают смесью для полимеризации разделяющего геля (табл. 12.7) до заранее отмеченной высоты, например 50 мм, т. е. около 2 мл смеси для полимеризации. Далее этот слой сразу же очень осторожно из шприца с тонкой иглой (по стенке трубки) покрывают 0,1 мл воды. Во время полимеризации трогать трубки не рекомендуется. После завершения полимеризации разделяющего геля воду удаляют ватным тампоном. Сухую поверхность разделяющего геля сначала промывают примерно 0,1 мл раствора для приготовления промежуточного геля (табл. 12.8), затем вводят 5 мм слоя (0,2 мл) раствора для приготовления промежуточного геля и быстро и осторожно покрывают 0,1 мл воды. Трубку освещают сверху флуоресцентной лампой со спектром дневного света, удаленной максимум на 50 мм. После окончания фотополимеризации слой воды удаляют, а поверхность геля промывают либо буферным раствором из верхней электродной камеры (табл. 12.9), если образец наносят в растворе, либо вновь раствором для приготовления фокусирующего геля, в который вместо воды добавляют образец. Если анализируются химически лабильные соединения, например ферменты, образец лучше наносить в виде [c.302]

Состав растворов для получения разделяющих гелей при дискретном электрофорезе (приведенные номера систем [c.304]

Для разделяющего геля и нижней эл. тродной камеры (анода) используют разбавленный (см.ниже) буфер А. Для концентрирующего геля и образца применяют разбавленный буфер Б. Буфер В используют неразбавленным, и он предназначен для верхней электродной камеры (катода). [c.229]

Растворы гелей готовят так, как указано для 10%-ного разделяющего геля [c.229]

Этот раствор дегазируют в вакууме водоструйного насоса Раствор 4 Смешивают 2 ч. раствора 1 с 1 ч. раствора 2 и дегазируют Для приготовления раствора концентрирующего геля смешивают равные объемы растворов 3 и 4. На поверхность разделяющего геля пипеткой наносят 0,5-1-сантиметровый спой концентрирующего геля. Сверху наносят еще 1-санти-,метровый спой дегазированной воды и гель оставляют полимеризоваться в неподвижном вертикальном состоянии приблизительно на 20 мин, после чего слой воды удаляют. [c.230]

Методика. Раствор разделяющего геля готовят, смешивая две части раствора 1 с одной частью раствора 2. [c.254]

На стадии расфокусирования зоны переходят из концентрирующего геля в разделяющий. В разделяющем геле компоненты подвергаются просеиванию , и, следовательно, их подвижность уменьшается из-за более высокой концентрации акриламида. Это резко нарушает стационарные условия, которые определяют существование стопки зон при изотахофорезе. Разделяющий гель готовят в разделяющем буферном растворе (фаза гамма), который содержит компонент 3 и противоион 6, pH разделяющего геля должен отличаться от pH фазы бета (при миграции к аноду быть более высоким). По мере того как фаза бета мигрирует в разделяющий гель, создается новая фаза — ламбда. По мере перемещения движущейся границы (ламбда/гамма) компонент 1 фазы дзета вступает в разделяющий гель, его подвижность становится больше подвижности белков, и компонент 1 начинает двигаться впереди них. Таким образом, появляется новая фаза пи и новая движущаяся граница (пи/ламбда), через которую проходят все зоны белков. Они разделяются в соответствии с их индивидуальными скоростями, определяемыми величиной pH фазы пи, проводимостью и величиной приложенного напряжения. Высокому разрешению при таком разделении белков способствуют несколько факторов а) узкая стартовая зо- [c.122]

Пока исследуемая смесь не вошла в разделяющий гель, устанавливается начальное напряжение, равное 50 В затем напряжение повышают до 145 В на весь [c.157]

Далее готовят разделяющий гель. Поверхность концентрирующего геля дважды быстро промывают смесью для получения разделяющего геля, а затем с помощью шприца заполняют трубку этой смесью так, чтобы получился выпуклый мениск, стараясь избежать образования пузырьков воздуха. Затем конец трубки плотно заклеивают полимерной пленкой. Всю эту процедуру необходимо провести в течение 5 мин после образования концентрирующего геля. Как только полимеризация закончится (через 30—40 мин), осторожно снимают колпачок, переворачивают трубку и аккуратно вставляют ее в резиновый колпачок нижним концом. Из другого конца, ставшего теперь верхним, удаляют раствор сахарозы и промывают поверхность концентрирующего геля смесью такого же состава. Затем наносят образец, включенный в смесь для приготовления стартового геля, и осторожно наливают электродный буфер до верхнего края трубки, не допуская перемешивания двух слоев. [c.263]

Разделяющие гели можно хранить в течение нескольких дней, но после добавления концентрирующего геля и исследуемого образца в стартовом геле электрофорез следует начать не позже, чем через 1 ч. Электродные буферы можно использовать многократно, но анодный и катодный буферы необходимо хранить отдельно. После нескольких анализов или при изменении pH приготавливают свежие буферные растворы. Гели анализируют либо непосредственно в трубках, либо после извлечения из них. [c.264]

Методика. Разделяющий гель, содержащий ДСН, приготавливают так, как это описано выше для электрофореза в неоднородной ( прерывистой ) системе. Однако в данном случае концентрирующий гель не используется и образец наслаивают непосредственно на поверхность разделяющего геля. [c.273]

В приборе, изготовляемом производственным объединением Хийу Калур Эстонской ССР, гель полимеризуют в специальной гелевой ячейке-кассете (рис. 11,/4,3). Для ее создания в выполненную из пластика рамку вставляют два стекла. Зазор между стеклами можно регулировать специальными прокладками толщиной 1, 2 или 3 мм, задающими толщину пластины полиакриламида. Стекла плотно вставляют в рамку и ячейку герметизируют с помощью специальных прокладок ггз силиконовой резины. В зазор между стеклами заливают смесь для полимеризации (см. с. 95). Если разделение проводят в геле только одного типа, раствор заливают в кассету доверху и сразу же между стеклами вставляют специалы ую пластинку — гребенку . Зубцы ее образуют углубления на поверхности геля, в которые впоследствии вносят образцы белка. Если в работе используют два типа гелей (концентрирующий и разделяющий), то в кассету сначала на высоту 85—95 мм от дна заливают раствор для полимеризации разделяющего геля. На него осторожно наслаивают воду и кассету оставляют в вертикальном поло- [c.97]

Приготовление геля. Для полимеризации 30 мл разделяющего геля (12,5%) смешивают 12,5 мл раствора акриламида, 7,5 мл буфера разделяющего геля и 10 мл воды. После деаэрирования (5—10 мин на водоструйном насосе) к смеси добавляют 16 мг персульфата аммония и 18 мкл ТЕМЕД. Полученный раствор заливают либо в гелевую ячейку для вертикального электрофореза в пластине (с. 97), либо в трубки (с. 95). На поверхность раствора наслаивают воду. После полимеризации удаляют воду шприцом или фитилем из фильтровальной бумаги. Готовят смесь для концентрирующего геля. Смешивают 4 мл раствора № 1 с 5 мл буфера концентрирующего геля и добавляют [c.122]

Перед каждым циклом электрофореза в капилляр осторожно вносят микропипеткой 5%-ный верхний гель высотой 2 мм. Этот гель полимеризуют под действием света в течение 5—10 мин. Перед тем как внести образец, излишнюю воду, скопившуюся на поверхности геля, отсасывают. Затем на несколько минут вносят небольшое количество раствора Б (см. разд. 7.2.1), разбавленного в отношении 1 8, и тоже отсасывают. Микропипеткой вносят 0,5—1,5 мкл образца. Таким образом, капиллярная трубка малого объема и диаметром 200 мкм содержит 0,5 мкл образца, 0,07 мкл верхнего геля и 0,5 мкл разделяющего геля. Капиллярная трубка диаметром 400 мкм содержит 1,7 мкл образца, 0,3 мкм верхнего геля и 2,5 мкл разделяющего геля. [c.282]

Состав образцов справа — 0,1 мг смеси ингибиторов протеаз, выделенных из картофеля (Solanum tuberosum L.), слева — 0,1 мг концентрата катепсина Е курицы. Электрофорез в 7,6%-ном разделяющем геле при pH 8,9 (см. табл. 12.6). Пробы помещены в гель образца, полимеризация которого катализировалась рибофлавином (состав геля соответствует фокусирующему гелю из табл. 12.8). Зоны детектируют окрашиванием 1%-ным раствором амидового черного (Амидошварц 10 В, Мерк, Дармштадт). [c.340]

Диск-электрофорез проводили по методу [3, 4] в аппарате Кеапа , в котором угольные электроды заменены платиновыми. Белки разделяли в щелочной среде (т мс-глициновый буфер, pH 8,3, разделяющий гель, pH 8,9) при температуре 5—7° и силе тока из расчета 5—8 мА на одну электрофоретическую трубочку. Белковые компоненты характеризовали по относительной электрофоретической подвижности (ОЭП), толщине (Т, см) и интенсивности окрашивания зон в столбиках геля. [c.85]

Разделение полинуклеотидов в геле основано на различиях в размере, форме и подвижности. Выделение тРНК из суммарного экстракта РНК нужно проводить в таком геле, который препятствует движению высокомолекулярных РНК. Поэтому применяют стандартную методику Ричардса и сорт. Ri hards et ai,,, 1965), в которой используют ступенчатую буферную систему с 5%-ным концентрирующим гелем и 10%-ным разделяющим гелем, модифицированную таким образом, чтобы создать pH 8,2, а не 8,9. [c.228]

Материалы. Исходные вещества те же, что и при электрофорезе в полиакриламидном геле экстрактов тРНК (см. выше). Буферы А, Б и В готовят так, как описано в гл. 10, а растворы для получения 15%-ного разделяющего геля -следующим образом [c.289]

Для гель-электрофореза в присутствии ДСН имеется большой набор буферных систем. Лучшее разрешение дают концентрированные буферные системы, у которых верхний (электродный) буфер содержит ионы, обладающие большой подвижностью и движущиеся через гель в виде передней зоны, или фронта. К моменту вхождения в разделяющий гель белки сжимаются этим движущимся фронтом в узкую полосу, а войдя в него, задерживаются за счет того, что гель обладает свойствами сита . Описанная ниже система представляет собой модификацию концентрирующей буферной системы, предложенной Лэмли [5]. См. также разд. 26.5.1. [c.156]

М трис-буфере, доведенном НС1 до pH 8.8. Полимеризация инициируется удалением воздуха из раствора и добавлением тетраметилэтилендиамина (до 0,8%) и персульфата аммония (до 0,015%). Пока не произойдет полимеризация, разделяющий гель держат под слоем воды. Воду выливают и наслаивают концентрирующий гель, или гель для нанесения, содержащий 4,5% акриламида, 0,12% бисакриламида и 0,1% ДСН в 0,125 М трис-буфере, доведенном НС1 до pH 6,8. Этот гель по-лимеризуется добавлением тетраметилэтилендиамина (до 0,125%) и персульфата аммония (до 0,05%). Перед полимеризацией, чтобы сформировать лунки для проб, в концентрирующий гель вставляют тефлоновую (фторопластовую) гребенку. После полимеризации образовавшиеся лунки промывают несколько раз электродным буфером, содержащим небольшое количество бромфено-лового синего. При этом удаляется непрореагировавший персульфат, а границы лунок слегка окрашиваются, так что их можно видеть при нанесении проб. Верхний электродный буфер содержит 0,182 М глицин, 0,0255 М трис (конечное значение pH 8,3) и 0,1% ДСН. Нижний электродный буфер содержит те же компоненты, за исключением ДСН. [c.157]

Самый распространенный недостаток электрофореза в полиакриламиде состоит в искривлении полос вследствие неправильно проведенной полимеризации. Чтобы этого не было, гелевые растворы нужно тщательно дегазировать перед заливкой, а верхнюю кромку разделяющего геля после полимеризации несколько раз промывать, чтобы удалить все остатки незаполимеризовавше-гося геля. Реактивы для электрофореза бывают разными по чистоте, и для того, чтобы время полимеризации было всегда постоянным, необходимо увеличивать или уменьшать количество персульфата аммония. Для разделяющего геля оптимальное время полимеризации составляет 30 мин. При большей длительности гель становится мягким или не полностью полимеризуется, а при меньшей — полимеризация может пройти неравномерно, что приведет к появлению волнистых белковых полос. Персульфат аммония очень гигроскопичен и не отличается стабильностью. Рекомендуется готовить исходный концентрированный раствор персульфата аммония (50 мг/мл), который хранят в замороженном состоянии порциями по 1 мл. Такой раствор стабилен в морозильной камере в течение нескольких месяцев. [c.158]

Электрофорез проводят либо в цилиндрических колонках, заполненных гелем (в стеклянных трубках), либо на пластинках размерами 10ХЮ см, покрытых слоем геля толщиной 1—4 мм. Гель состоит из трех слоев внизу располагается разделяющий гель, в середине — концентрирующий (гель-прокладка) и вверху — стартовый гель, содержащий образец. Каждый слой представляет собой полиакриламид с определенной степенью сшивки. Гель образуется в трубке или на пластинке из раствора, содержащего акриламид (мономер), М,М -ме-тиленбисакриламид (БИС), буфер, сшивающий и поли-меризующий агенты. Полимеризацию катализируют либо химическим способом, используя персульфат аммония, либо фотохимическим — с помощью света, который вызывает образование свободных радикалов в присутствии кислорода. [c.259]

Разделение белков в прерывистой системе зависит от двух основных факторов 1) различий в подвижности белков, обусловленных присущим поперечно-сшитым гелям молекулярно-ситовым эффектом, обеспечивающим разделение молекул в соответствии с их размерами, и 2) различий, связанных с зарядом молекул. Кроме того, необычно четкие зоны образуются благодаря концентрированию белков в виде очень узкой полосы или диска перед вхождением их в разделяющий гель. Таким образом, величина молекулярно-ситового эффекта зависит от степени поперечной сшивки, которая в свою очередь определяется концентрацией сшивающего акриламида. Концентрирование белков в виде узкой полосы, перед тем как они входят в разделяющий гель, характерно для прерывистого электрофореза. Оно происходит в результате искусного использования неоднородного ( преры- [c.259]

Рис. 16.10. Слои геля и поведение ионов при диск-электрофорезе в полиакриламидном геле. А. Образец в геле. Б. Образец, сконцентрированный иа границе раздела между гелем-прокладкой и разделяющим гелем. В. Образец, разделенный на полосы в коиие процесса.

Первоначальная процедура заполнения трубок ак-риламидом, описанная Орнстейном [67] и Дэвисом [64], начиналась с полимеризации разделяющего геля в нижней части трубки. Позже была предложена методика [66], по которой разделяющий гель полимеризуется в верхней части трубки, так как при этом образуется более однородная граница раздела между концентрирующим и разделяющим гелями. Заполнение трубки проводят следующим образом. В резиновый колпачок наливают 0,2 мл 40%-ного раствора сахарозы и плотно прижимают трубку к дну колпачка, для того чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха. Трубку устанавливают в вертикальное положение затем готовят около 0,15 мл смеси для получения концентрирую -щего геля (см. ниже) и с помощью небольшого шприца с иглой (длина 8 см, внутренний диаметр 0,6—0,8 мм) наслаивают эту смесь на раствор сахарозы. На поверхность концентрирующего геля осторожно наливают немного воды так, чтобы не произошло перемешивания этих двух слоев и между ними образовалась резкая граница. Высокое разрешение достигается в основном благодаря образованию четкой ровной границы между [c.262]

На слой разделяющего геля нанести 0,2 мл концентрирующего крупнопористого геля (7 %), который готовят смешиванием 1 объема Б (24 мл 1 н НС1, 2,99 г трис и 0,23 мл ТЕМЕД на [c.271]

В лаборатории Лаурелла был разработан метод электрофореза в агарозном геле для разделения белков. Подробное описание прибора и методики можно найти в работе Йоханссона [630]. Электрофорез проводят в 17о-ном геле толщиной 1 мм на охлаждаемой водой стеклянной пластинке. Для охлаждения используют пластмассовую коробку с циркулирующей в ней водой (температура не выше 15 °С). Электрический контакт между разделяющим гелем и сосудами с буфером осуществляется через агарозные мостики. Канавки в геле для внесения 3— 10 мкл пробы, содержащей 10—100 мкг белка, получают при помощи сделанного из стальной бритвы шаблона с прямоугольными зубцами. Его помещают на пластинку сразу же, как только выливают а нее теплый раствор агарозы. Градиент напряжения при электрофорезе составляет 15—20 В/ом. [c.63]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология