Формамид как денатурирующий

Краситель с формамидом (денатурирующая смесь с красителем) [c.56]

Во втором варианте авторы использовали более широкий (и крутой) интервал концентраций сахарозы (5—25%) и растворяли ее в буфере на основе 70%-ного раствора деионизированного формамида ( денатурирующий градиент ). При тех же значениях частоты вращения ротора и температуры центрифугирование пришлось вести 54 ч (вместо 22 ч). Поли (А)-РНК оказалась в середине пробирки, зат оба маркера (5S и 18S РНК) хорошо видны на градиенте. Использование формамида для полного разворачивания всех молекул РНК (полной денатурации) повышает точность определения s o.a с помощью маркерных РНК, однако за это приходится расплачиваться чуть ли не трехкратным увеличением продолжительности центрифугирования ввиду значительного увеличения плотности и вязкости среды. [c.236]

Другим эффективным денатурирующим агентом является деионизованный формамид. Если РНК, растворенные в 98%-ном формамиде, подвергнуть электрофорезу в низкопроцентных полиакриламидных гелях, также содержащих 98%-ный формамид, то подвижность РНК будет определяться размерами их молекул [89, 90]. С помощью этого метода было осуществлено как аналитическое, так и препаративное разделение многих матричных и рибосомальных РНК [78] (рис. 10.7). [c.179]

Одно из серьезных ограничений гель-электрофореза как метода выделения специфических фрагментов ДНК заключается в том, что молекулы, имеющие примерно одинаковую массу, но различную нуклеотидную последовательность, обладают, как правило, одинаковой электрофоретической подвижностью. Один из возможных подходов к решению этой проблемы основан на использовании предложенного в работе Фишера и Лермана [115] метода двумерного гель-электрофореза фрагментов ДНК. Сначала смесь фрагментов ДНК разделяют в соответствии с их размерами с помощью обычного гель-электрофореза, а затем в перпендикулярном направлении проводят электрофорез в 4%-ном полиакриламидном геле в градиенте концентрации формамида (от 4 до 30%) и мочевины (от 0,7 до 5,25 М). Разделение проводят при повышенной температуре. В этой методике использован эффект резкого уменьшения электрофоретической подвижности в результате денатурации или плавления части нативной молекулы ДНК. В ходе электрофореза во втором направлении фрагменты ДНК подвергаются воздействию все более жестких денатурирующих условий, и плавление части молекулы двухцепочечной ДНК сопровождается скачкообразным изменением ее подвижности. Связь между подвижностью фрагментов ДНК и их нуклеотидной последовательностью носит сложный характер и до сих пор окончательно не выяснена [115], [c.185]

Разработанный Лерманом и Фишером метод электрофоретического разделения близких последовательностей ДНК основан на использовании различий в температуре плавления, обусловленных нуклеотидными заменами [27, 28]. Они исходят из того факта, что последовательность оснований влияет на Гт области плавления и что конформация фрагмента ДНК обусловливает его подвижность в геле под действием электрического поля. Принцип метода — электрофорез ДНК в акриламидном геле фиксированной концентрации с линейно возрастающим к нижней части геля градиентом концентрации веществ, денатурирующих ДНК обычно мочевины или формамида (рис. 3, ). Электрофорезная камера нагревается до температуры примерно 60°С. [c.129]

Переход от упорядоченной к неупорядоченной структуре ДНК часто называют переходом спираль — клубок, хотя столь же часто применяется термин денатурация . При переходах спираль — клубок обычно отмечают изменения в каких-нибудь физических свойствах молекулы, например характеристической вязкости, оптической плотности, коэффициента седиментации и т. д. Обычно переход спираль — клубок происходит при нагревании, при изменении pH и концентрации солей, а также под действием химических денатурирующих агентов, таких, как мочевина и хлоргидрат гуанидина для белков и формамид, формальдегид и этиленгликоль для нуклеиновых кислот (рис. Ы1). Температу- [c.21]

Денатурирующие гели с формамидом [c.135]

В отличие от мочевины, формамид является весьма сильным денатурирующим агентом. Он полностью разрушает вторичную Структуру полинуклеотидов—как водородные связи, так и стэ- инг-взаимодействие между плоскостями гетероциклических ко-Мп нуклеиновых оснований. Электрофоретическая подвижность нуклеиновых кислот в гелях с формамидом зависит только от молекулярной массы, что открывает возможность ее определения р помощью маркеров и для высокомолекулярной РНК. [c.135]

Направление У — электрофорез в 1%-ном геле агарозы направление 2 — электрофорез в 4%-ном ПААГ, полимеризованном в градиенте концентрации денатурирующих добавок (0—7 М мочевины и О—40% формамида) [c.136]

Таким образом, следует иметь в виду, что введение высоких концентраций денатурирующих агентов (формамида и ДМСО) заставляет увеличить продолжительность центрифугирования в [c.237]

Два фрагмента ДНК, различающиеся лишь делецией, инсер-щией или заменой одного нуклеотида, или единственным неспаренным нуклеотидом, можно легко разделить при помощи денатурирующего градиентного гель-электрофореза, ДГГЭ [15, 17— 20, 27, 28]. Принцип метода заключается в разделении двухце-почечных фрагментов ДНК электрофорезом в стандартном акриламидном геле с линейным градиентом денатурирующих факторов — мочевины, формамида или температуры. Ниже приводятся теоретические основы метода. Здесь отметим только, что разделение очень похожих фрагментов в геле происходит из-за разных температур плавления их ДНК. [c.128]

Успешное прохождение ДНК-полимеразой трудных участков за счет тех или иных описанных выше ухищрений является только половиной дела, поскольку в новосинтезированной комплементарной цепи ДНК также будут присутствовать эти участки с потенциальной вторичной структурой. После денатурации цепей ДНК в этих местах одноцепочечной ДНК образуются шпилечные структуры, заметно меняющие электрофоретическую подвижность такой молекулы ДНК. Результатом будет видимая на конечном радиоавтографе компрессия отдельных полос, не позволяющая их однозначное прочтение . Проведение гель-электрофореза при повышенных температурах или с добавлением в буфер формамида в качестве дополнительного денатурирующего агента, кроме мочевины, в ряде случаев позволяет избежать эффект компрессии. Был также предложен способ ликвидации эффекта компрессии при электрофоретическом разделении продуктов секвенирующих реакций, заключающийся в проведении дополнительного эта- [c.114]

Пример 10, Выделение ДНК, кодирующей синтез РНК вируса миелобластоза птиц (AMV), из миелобластов цыпленка [Som, Nayak, 19781, В данном случае авторы решали обратную задачу. Очищенную из вируса и денатурированную РНК фиксировали на Br N-активированной сефарозе. Суммарную ДНК из миелобластов цыпленка денатурировали и одновременно освобождали от остатков РНК обработкой 0,3 М КОН (37 16 ч), дробили ультразвуком до фрагментов длиной около 300 нуклеотидов и сорбировали на РНК-сефарозе, 0,75 г сорбента, содержащего около 50 мкг вирусной РНК в 14 мл среды для гибридизации (50% формамида - -0,75 М Na I-f- [c.443]

К способам денатурации преимущественно химического типа относятся действия а) органических растворителей (ацетона, метилового, этилового и иных спиртов, пиридина, диоксана, эфира и др.) б) амидов, как например, мочевины, солей гуанидина, формамида, уретана и иных подобных веществ в) ионных детергентов, в частности анионных (алкил-сульфатов и т. п.) г) сали-цилата натрия и иных органических анионов, например трихлоруксусной кислоты д) минеральных солей, таких как СаС 2, Mg l2, K NS, которые при большой концентрации в растворе могут денатурировать белки е) солей тяжелых металлов. Кроме того, в качестве денатурирующих агентов обычно рассматривают протеазы, которые, по-видимому, могут вызывать денатурацию молекулы белка перед ее расщеплением. [c.160]

Денатурирующий фактор, если его действие не очень интенсивно, вызывает денатурационное превращение лишь у части молекул белка одновременно он обусловливает стабилизацию другой части этих молекул. Подобный эффект мы наблюдали на целом ряде белков — яичном, сывороточном альбуминах, эдестине, химотрипсиногене — под влиянием разнохарактерных денатурирующих факторов мочевины, нагревания, спирта, формамида, ряда солей, салицилата и бензоата натрия. В основе явления лежит, по-видимому, способность нативной макроструктуры к некоторым конформационным изменениям (переходам), происходящим при сохранении нативного типа укладки цепей. Можно полагать, что при денатурационной стабилизации в молекуле белка образуется измененная сеть связей повышенной прочности. Под влиянием денатурирующего фактора (например, нагревания) часть слабых связей разрывается, но так, что основной тип укладки цепей сохранен. [c.165]

Молекулы нативной и денатурированной ДНК связываются с гидроксиапатитом при низкой концентрации фосфата (0,01 — 0,03 М натрий-фосфатный буфер, pH 6—8). При 0,12—0,14 и 0,4—0,5 М концентрации указанного буфера элюируются соответственно одно- и двухцепочечные формы ДНК [101—104]. Присутствие других однозарядных анионов, по-видимому, не имеет значения, однако добавление в элюент мочевины и (или) детергентов, например додецилсульфата натрия, приводит к увеличению выхода высокомолекулярной ДНК. Концентрация ионов фосфата, при которой с колонки с гидроксиапатитом элюируются молекулы нативной или денатурированной ДНК, не зависит от температуры. Поэтому при фракционировании на таких колонках можно использовать как процессы денатурации ДНК (т. е. разделять комплементарные цепи ДНК, денатурированной непосредственно на колонке под действием температуры или денатурирующих агентов типа формамида), так и реассоциации ДНК (образования двойной спирали из отдельных цепей ДНК). Реассоциация главным образом зависит от концентрации комплементарных цепей и, следовательно, от частоты их повторов в рассматриваемой последовательности [105]. С помощью контролируемой реассоциации ДНК генома с оли-гонуклеотидными зондами (фрагментами РНК или ДНК) и последующего разделения полученных гибридов на колонках с гидроксиапатитом можно определить число повторяющихся или уникальных последовательностей этой ДНК [105]. [c.183]

При нейтральном или близких к нему значениях pH большинство вирусов диссоциирует лишь при добавлении сильных денатурирующих агентов. Добавлением мочевины или формамида до концентрации 8—10 М при pH 7—8 можно вызвать диссоциацию многих вирусов, а для отделения высвободившегося белка от вирусной РНК часто прибегают к методу осаждения белка сульфатом аммония. Белок ВТМ, выделенный таким способом при 20%-ном насыщении сульфата аммония, нерастворим даже в присутствии дитиотреитола, предотвращающего самоокисление. Денатурированный белок ВТМ успешно ренатурирует при растворении в 8 М растворе мочевины и последующем диализе против 0,02 М фосфата при pH 6 [7]. Под действием мочевины ренатурация белка может произойти даже после его обработки галоидоводородными солями гуанидина (4 М), которые относятся к более сильным денатурирующим агентам. У таких детергентов, как додецилсульфат натрия, наблюдается тенденция слишком прочно связываться с белками, что и является основным недостатком при их использовании для выделения белков. [c.50]

Двухцепочечную ДНК можно денатурировать любым способом. Однако если концентрация соли в ней выше, чем в буфере ТЕ, то мы рекомендуем проводить денатурацию щелочью. Если зонд повторно используется после длительной гибридизации в водном растворе, его можно денатурировать NaOH. Добавьте к зонду 1/10 объема 1,5 М NaOH и через 10 мин добавьте 1/10 объема 1,5 М НС1. Если зонд в формамиде, то можно использовать тепловую денатурацию. Зонд становится наполовину ренатурированным в соответствии с таким уравнением [c.128]

Добавьте 4 мкл-формамИда/красителя/ЭДТА в каждую ячейку (разд. 5) и денатурируйте йри 80 °С 10 мин перед нанесением на гель (рис. 2). [c.42]

Для проведения гибридизации клетки изучаемого штамма разрушают тем или иным способом (см. 8.1), выделяют ДНК, фрагментируют ее ультразвуком на кусочки длиной 300—350 пар оснований (определяется электрофорезом в 1%-ной агарозе), денатурируют нагреванием и закрепляют на нитроцеллюлозных фильтрах, ДНК сравниваемого штамма готовят таким же способом, вводят реактивную метку ник-трансляцией с помощью меченого нукле-озид-5 -трифосфата при одновременном действии ДНКазы 1 и ДНК полимеразы 1 Е. oli и используют для гибридизации. Ее чаще всего проводят по методу Денхардта в 20%-ном формамиде при 62° в течение 18—24 ч ( мягкая ренатурация ), отмывают от несвязавшейся меченой ДНК, и радиоактивность фильтров просчитывают в сцинтилляционном счетчике. Гибридизацию гомологичных ДНК принимают за 100% и рассчитывают проценты связанной исследуемой ДНК с ДНК реперного штамма. Процент связанной ДНК отражает степень гомологии молекул и служит показателем родства штаммов. Аналогичная реассоциация может быть осуществлена между молекулами ДНК и рРНК, поскольку двойные спирали образуются также между одноцепочечными ДНК и комплементарными цепями РНК. Подробнее методы описаны в справочном руководстве (Герхард и др,, 1984). [c.146]

Денатурациоиное картирование близко к картированию вторичной структуры. Последнее пока находит применение в основном при исследовании РНК, но может с успехом использоваться и для одиночных цепей ДНК. При картировании вторичной структуры выявляются не самые первые выплавляемые области, а те участки, которые плавятся в последнюю очередь. Они выглядят как шпильки или более сложные ветвистые структуры на фоне расплавленной одноцепочечной молекулы РНК. В идеальном случае наиболее стабильная область вторичной структуры РНК должна соответствовать наиболее стабильной области двойной спирали ДНК, которая кодирует эту РНК. Температура — не совсем подходящий параметр для картирования вторичной структуры вследствие кооперативности последних этапов температурного плавления и из-за слишком сильной реакционной способности формальдегида при температурах выше Т . Более подходящими оказываются денатурирующие органические растворители, и большинство работ было выполнено с использованием водных растворов формамида. [c.292]

I. При проведении электрофореза в денатурирующих условиях растворите образец в 90% формамиде, содержащем 0,02% маркерных красок. Прох ейте на кипящей бане I мин, быстро остудите, после чего нанесите на гель. [c.25]

Денатурацию нуклеиновых кислот успешно обеспечивает и более низкая концентрация формамида. Например, показано, что 3%-ный денатурирующий гель (С=11) для электрофореза РНК можно готовить на 65%-ном водном формамиде [Bean et al.. [c.137]

Интересное использование комбинации денатурирующих эффектов формамида и мочевины предложили Фишер и Лерман. По длине ПААГ создавали градиент концентрации формамида (О—40%) и мочевины (О—7 М) и вели электрофорез двунитевых рестриктов ДНК при 60°. Для каждого рестрикта в зависимости от его нуклеотидного состава на градиенте имеется точка, где происходит частичная денатурация ДНК. Как уже отмечалось, это приводит к резкому замедлению миграции, связанному С образованием локальных вздутий на гладкой молекуле ДНК. Рестрикт образует остро очерченную полосу. Таким образом, Осуществлялось фракционирование по составу рестриктов одина- <совой длины [Fis her, Lerman, 1979]. [c.137]

В одной недавней работе [Rave et al., 1979] был описан электрофорез поли (А)-РНК в денатурирующем геле агарозы, содержащем 67о формальдегида в 0,04 М Na-фосфатном буфере. РНК перед нанесением на гель денатурировали в 50%-ном растворе формамида с 6% формальдегида в том же буфере при 60 в течение 5 мин. Затем препарат быстро охлаждали и добавляли в него, как обычно, глицерин и бромфеноловый синий. В электродные резервуары заливали такой же буфер, содержащий 3% формальдегида. После окончания электрофореза гель вымачивали в течение 5 мин в воде при 60 . Этого было достаточно для снятия формальдегида с РНК, которую затем, после частичного щелочного гидролиза, переводили диффузией из геля на диазобумагу по методу Олвина [Alwine et al., 1977]. Несмотря на предшествующую обработку формальдегидом, поли (А)-РНК на диазобумаге успешно гибридизуется с ДНК. [c.139]

При центрифугировании денатурированной ДНК или однонитевых РНК бывает необходимо предотвратить их реассоциацию и агрегацию за счет образования случайных водородных связей между основаниями. Для ДНК это осуществляют подщелачива-нием раствора NaOH (до 0,1 М). В случае РНК щелочь непригодна (гидролиз ), но можно создать градиент плотности растворением сахарозы не в воде, а в концентрированных растворах формамида или диметилсульфоксида (ДМСО), иногда даже в 100%-ном формамиде или ДМСО, Полученные градиенты называют денатурирующими градиентами сахарозы . Следует помнить, что ДМСО ядовит и легко проникает через кожу, поэтому работать необходимо в перчатках. Кроме того, ДМСО разрушает нитроцеллюлозные и поликарбонатные пробирки. Из него необходимо удалять следы тяжелых металлов перемешиванием в течение 1,5 ч с 3%-ной суспензией бифункциональной ионообменной смолы. Перед нанесением на градиент препараты нуклеиновых кислот целесообразно прогревать в течение 2— 3 мин при 80 для разрушения уже образовавшихся агрегатов. [c.212]

Смотреть страницы где упоминается термин Формамид как денатурирующий: [c.243] [c.442] [c.443] [c.177] [c.179] [c.269] [c.392] [c.168] [c.168] [c.392] [c.135] [c.139] [c.140] [c.140] [c.237] [c.280] [c.79] [c.174] [c.323] [c.54]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология