Выделение ДНК митохондрий и хлоропластов

В этом разделе кратко рассматриваются методы работы, используемые для выделения ферментов, структурно связанных с нерастворимыми компонентами клетки, такими, как митохондрии, хлоропласты, плазмалемма, эндоплазматический ретикулум и ядерные мембраны. Эти методы не применяются к водорастворимым ферментам, заключенным внутри органелл, например к белкам митохондриального матрикса, а лишь к ферментам, ковалентно связанным или прочно ассоциированным с частицами. Существенной степени очистки по сравнению с исходным материалом можно добиться, многократно промывая гомогенат буфером, в котором данный фермент не растворяется. После этого возможны два подхода к решению проблемы. Можно фракционировать осадок методом дифференциального центрифугирования (седиментация или градиент плотности), с помощью электрофореза или молекулярных сит . [c.52]

Кардиолипин впервые был выделен из ткани сердечной мышцы. Установлено, что он локализован почти исключительно в митохондриях и играет важную роль в структурной организации и функционировании дыхательных комплексов. Кардиолипин является также обязательным компонентом бактериальных клеточных мембран и хлоропластов растений. [c.296]

Ядра, митохондрии и хлоропласты растений, как сообщалось, также синтезируют белок. Ядра, тщательно выделенные из гороха, включают в белок меченый лейцин в присутствии других белковых аминокислот и АТФ. Синтез белка в митохондриях растений показан не очень убедительно, так как не было исключено загрязнение данной фракции рибосомами. Препараты хлоропластов, как обнаружено, также катализируют включение аминокислот в белок. [c.482]

Выделенные из различных объектов рибосомы очень сходны по структуре и составу. Обычно они представляют частицы сферической формы диаметром 150—350 А. В рибосомах содержится 50—60% белка и 40—50% рибонуклеиновой кислоты. В отличие от митохондрий и хлоропластов липидов в рибосомах нет. Молекулярный вес их частицы составляет около [c.35]

Внеядерная ДНК (обзоры — см. ° ). Хотя, по цитохимическим данным, основная масса ДНК сосредоточена в клеточном ядре, было показано присутствие ДНК и в других субклеточных частицах Этот цитохимический вывод подтвержден выделением ДНК из митохондрий и хлоропластов. [c.34]

Некоторые (Кок, Колесников) считают, что реакция выделения кислорода может катализироваться теми же ферментами, что и поглощение кислорода в процессе дыхания митохондрий. По мнению этих авторов, в хлоропластах за счет энергии света может осуществляться обратная дыханию реакция, сопровождающаяся выделением Ог- Колесников (1967), например, утверждает, [c.175]

Ферменты могут синтезироваться в ядре, в цитоплазме, в хлоропластах, а также, возможно, в митохондриях и цитоплазматической мембране. Они могут также накапливаться в любой из указанных структур или в основном веществе цитоплазмы и в клеточной оболочке кроме того, они могут секретироваться клеткой. Выделение ферментов, связанных с какими-нибудь субклеточными структурами, естественно было бы начать с предварительного выделения соответствующих структур. На практике такой способ не всегда является лучшим, так как бывает связан с необходимостью центрифугирования больших объемов при высоких скоростях. [c.98]

Согласно другой гипотезе, предполагается, что циклическое выделение и поглощение О2 в хлоропластах или митохондриях протекает с участием ферментов транспорта электронов и сопряжено с генерацией АТФ. Этот дополнительный АТФ может быть необходим для синтетических процессов, происходящих на свету. [c.582]

Двухцепочечная кольцевая ДНК — ДНК, выделенная из вируса полиомы, бактериофага РМ2, митохондрий и хлоропластов. Как промежуточная репликативная форма, принимающая участие в биосинтезе линейной двухцепочечной ДНК. она обнаружена в составе бактериофага Я,. Некоторые плазмиды также содержат двухцепочечные кольцевые ДНК. [c.47]

Размеры рибосом, выделенных из различных органелл, варьируют. Митохондриальные рибосомы низших эукариот, таких, как грибы, имеют несколько большие размеры, чем рибосомы Е. соИ. В митохондриях растений рибосомы лишь ненамного меньше, чем в окружающей цитоплазме. Однако в митохондриях млекопитающих и амфибий их размеры еще меньше и составляют 60S. Эти рибосомы характеризуются более низким содержанием РНК (25-31%). Рибосомы хлоропластов приблизительно такого же размера, как и рибосомы бактерий, хотя с более высоким содержанием РНК. [c.104]

Наличие ДНК в митохондриях и хлоропластах было непосредственно продемонстрировано ее выделением из очищенных препаратов этих органелл. Особенности на- [c.281]

Дыхательные ферментные комплексы сопрягают транспорт электронов, сопровождающийся выделением энергии, с откачиванием протонов из матрикса. Создаваемый при этом электрохимический протонный градиент доставляет энергию для синтеза АТР еще одним трансмембранным белковым комплексом-АТР-синтетазой, через которую протоны возвращаются в матрикс. АТР-синтетаза - это обратимый сопрягающий комплекс в норме он преобразует энергию потока протонов, направленного в матрикс, в энергию фосфатных связей АТР, но при уменьшении электрохимического протонного градиента он способен также использовать энергию гидролиза АТР для перемещения протонов из матрикса наружу. Хемиосмотические механизмы свойственны как митохондриям и хлоропластам, так и бактериям, что указывает на исключительную важность их для всех клеток. [c.459]

Еще один способ получения информации о клетках связан с химическим исследованием выделенных клеточных органелл. Если осторожно растереть клеточную массу в соответствующей среде, то по крайней мере часть клеточных органелл можно выделить в интактном виде. Органеллы, имеющие различную плотность, разделяют центрифугированием при постоянно возрастающем числе оборотов (рис. 2.1). Например, такие тяжелые частицы, как ядра и хлоропласты, осаждаются при сравнительно небольших скоростях, соответствующих центробежным силам, в 1000—3000 раз превышающим силу земного притяжения (1000—3000 д) митохондрии переходят в осадок примерна при 10 000 д, рибосомы — приблизительно при 30 000 д, а для [c.22]

Выделение ДНК из хлоропластов и митохондрий [c.4]

В разных пробирках ресуспендируют осадки (используя при необходимости гомогенизатор Поттера или кисточку) в буфере для выделения органелл (30 мл для хлоропластов и 8 мл для митохондрий) путем центрифугирования в ступенчатом градиенте сахарозы. [c.260]

В течение нескольких минут постепенно разводят (чтобы избежать осмотического шока) фракцию органелл тремя объемами охлажденного до 4°С буфера для выделения органелл. Переносят препараты хлоропластов и митохондрий в разные пробирки объемом 38 мл и осаждают органеллы соответственно при 2000 и 10 000 в течение 15 мин при 4°С. [c.261]

Эти методы служат для разрушения клеток и выделения ферментов в раствор. Если фермент локализован в органеллах, метод может быть использован только при условии, что органеллы также разрушаются. С другой стороны, может понадобиться предварительное выделение самих органелл, что позволит избавиться от загрязнения цитоплазматическими ферментами перед экстракцией фермента из органелл. Для этого требуется менее сильное воздействие. Предварительное растворение поверхностных коллагеновых и целлюлозных структур препаратами гидролитических ферментов позволяет в дальнейшем разрушать клетки более мягкими способами, сохраняя целостность органелл. Примером подобной методики служит получение препаратов митохондрий из таких тканей, как скелетная или сердечная мышцы, под действием протеолитических ферментов [6]. Однако эта методика применима только для получения препаратов в небольших масштабах и больше подходит для. метаболических исследований органелл, чем для очистки ферментов. Выход очищенных органелл может быть очень низким, поэтому во многих случаях лучше сначала разрушить всю ткань, а затем уже приступить к выделению нужного фермента из сложной смеси белков в экстракте. Таким образом, ферменты митохондрий и хлоропластов часто получают из тканевого гомогената, а не из выделенных органелл. [c.42]

Кислородный электрод используют для исследования реакций, сопровождающихся выделением или поглощением кислорода. Эксперимент, как правило, занимает не более часа. Иногда, правда, проводят длительные исследования, например наблюдение за уровнем содержания кислорода в процессе роста микроорганизмов. Для работы такого рода необходимы приборы несколько иной конструкции. Менее продолжительными являются опыты по определению активности ферментов и исследования на митохондриях и хлоропластах. [c.241]

Гомогенат, освобожденный от ядер и хлоропластов, используется далее для выделения митохондрий. Полное осаждение митохондрий достигается центрифугированием при 10 ООО g в течение 10—20 мин. Полученный таким образом препарат митохондрий загрязнен пропла-стидами. Митохондрии в свою очередь можно очистить с помощью центрифугирования в градиенте плотности при этом используют менее концентрированные растворы сахарозы и более длительное центрифугирование. [c.11]

Перед выделением хлоропластов целесообразно выдерживать растения (1—4 дня) в темноте для снижения содержания крахмала. Хэнсон с сотрудниками [5] в качестве удобного источника для выделения митохондрий рекомендует использовать клетки суспензионной культуры. [c.261]

Хлоропласты синтезируют АТР в принципе так же, как митохондрии транспорт электронов сопряжен в них с перекачиванием протонов, а энергия аккумулируется в возникающем электрохимическом протонном градиенте, использующемся для образования АТР с помощью АТР-синтетазы. В одном из ранних и наиболее убедительных тестов на хемиоосмотическое сопряжение электронного транспорта и синтеза АТР использовались тилакоидные везикулы, выделенные из хлоропластов щпината. [c.91]

Предпринималось много попыток расчленить и вновь реконструировать субмитохондриальные фосфорнлирующие частицы. Первым из достижений было удаление нескольких факторов сопряжения , из которых наиболее известен фактор сопряжения р1 (разд. Д,1). Удаление фактора р1 из субмитохондриальных частиц всегда ведет к потере им способности синтезировать АТР, но перенос электронов остается незатронутым. Фосфорилирующую способность можно снова восстановить,, добавляя р1 к мембранным препаратам. Следовательно, р1 теснейши образом связан с синтезом АТР. Этот важный белок был выделен из митохондрий и из хлоропластов в виде гомогенных частиц с мол. весом 285 ООО. В его состав входят, по-видимому, полипептидные цепи пяти различных типов с молекулярными весами / 60 000, 56 000, 36000, 17000 и 13 000 [78. 79]. [c.409]

В 1954 г. Даниэль Арнон со своими сотрудниками в Калифорнийском университете в Беркли обнаружил, что при фотосинтетическом переносе электронов в освещаемых хлоропластах шпината из ADP и фосфата синтезируется АТР. Одновременно и независимо от них Альберт Френкель в Университете штата Миннесота наблюдал синтез АТР в освещаемых хроматофорах (мембранных пигментсодержащих структурах), выделенных из фотосинтезирующих бактерий. Обе группы исследователей пришли к выводу, что какая-то часть световой энергии, улавливаемой фотосинтетичес-кими системами этих организмов, трансформируется в энергию фосфатной связи АТР. Этот процесс стали назьшать фотосинтетическим фосфорилированием или фотофосфорилированием в отличие от окислительного фосфорилирования, протекающего в дышащих митохондриях. [c.698]

В опытах с листьями наземных растений в замкнутой системе (фиг. 38, Б) имеются еще более сложные источники ошибок. Здесь один и тот же воздух в течение продолжительного времени циркулирует, проходя последовательно через прибор для измерения концентрации и через листовую камеру. Поэтому фотосинтез происходит при непрерывно уменьшающейся концентрации СОа и скорость его в любой момент времени можно определить, исходя из известного объема системы и наклона кривой, описывающей изменение концентрации СО2 во времени. Этот наклон определяется не только скоростью поглощения и выделения СО2 (соответственно хлоропластами и митохондриями), но и наружной концентрацией СО2 в данный момент времени, предшествующими изменениями этой концентрации во времени и, наконец, всеми значениями внутреннего сопротивления движению СО2. При наличии,очень точного метода определения концентрации объем замкнутой системы можно сделать достаточно большим относительно поверхности листа для того, чтобы снижение концентрации происходило крайне медленно (и вместе с тем поддавалось измерению). В противном случае видимый фотосинтез следует измерять в открытой или, еще лучше, в полузамкнутой системе (см. ниже), так как в этих случаях можно поддерживать постоянную скорость фотосинтеза, пополняя запас СО2 в воздухе по мере его расходования. Следует указать, что те же самые рассуждения приложимы и к опытам с открытой и замкнутой системами, в которых измеряются изменения концентрации кислорода, поскольку выделение кислорода обычно считается эквивалентным поглощению СОг- Однако теоретичесю [c.85]

При такой обработке разрушаются не только клеточные стенки, но и ядерные мембраны и происходит освобождение субъядерных компонентов. При такой обработке сильно повреждаются также ядрышки. Профильтрованный гомогенат затем центрифугируют нри таких скоростях, которые недостаточны для осаждения митохондрий (4000 g в течение 30 мин). Полученный осадок содержит крахмальные зерна, на которые наслоены хроматин и фрагменты ядер. Хлоропласты и фрагменты хлоропластов, если они присутствовали в исходной ткани, также обнаруживаются в этом осадке. Студенистый слой отделяют от нижележащего крахмального слоя, ресуспендируют в среде для растирания и вновь центрифугируют несколько раз для удаления крахмала. Неочищенный хроматин затем очищают центрифугированием в градиенте плотности сахарозы (0,0— 1,8 М). Для полного осаждения хроматина необходимо центрифугирование в течение 2 час при 22 ООО об/мин на 8р1псо 8 У 25 [25]. Нехромосомный материал удаляется главным образом на этой последней стадии, которая может быть повторена. Непосредственное выделение хроматина из тканей не требует большой затраты времени и позволяет получить до 95% присутствовавшего в исходной ткани хроматина, причем степень чистоты препарата в данном случае такая же, какая достигается и нри выделении хроматина из изолированных ядер. [c.31]

В выделенной из Euglena ДНК присутствует еще одна сателлитная фракция, сохраняющаяся в клетках, лищенных хлоропластов (рис. 5.22). Этот тип ДНК локализован в митохондриях - органеллах, ответственных за дыхательную активность клеток. В митохондриях в процессах окислительного фосфорилирования и в цикле трикарбоновых кислот образуется большая часть АТР (аденозинтрифосфата) клетки. АТР-это основной источник энергии, расходуемой на все метаболические реакции клетки. Митохондрии, так же как и хлоропласты, способны к саморепликации. В их ДНК закодировано множество функций, необходимых для нормальной дыхательной активности. [c.153]

Так как большинство генов, кодирующих белки современных митохондрий и хлоропластов, находится в ядерном геноме, можно думать, что в ходе эволюции эукариот значительная часть генов органелл была перенесена в ядерную ДНК. Это позволило бы объяснить, почему некоторые из ядерных генов, кодирующих митохондриальные белки, сходны с генами бактерий. Так, например, у курицы М-концевая аминокислотная последовательность митохондриального фермента супероксиддисмутазы гораздо больше похожа на соответствуюший сегмент супероксиддисмутазы бактерий, чем на К-концевой участок того же фермента, выделенного из цитозоля тех же эукариотических клеток. Еще одним указанием на то, что подобные переносы участков происходили в ходе эволюции, служат обнаруженные в ядерном геноме некодирующие последовательности ДНК, имеющие, вероятно, недавнее митохондриальное происхождение очевидно, что эти последовательности были интегрированы в ядерный геном как балластная ДНК. [c.500]

В растительных клетках около 80% калия содержится в вакуолях. Он составляет основную часть катионов клеточного сока. Поэтому калий может вымываться из растений дождями, особенно из старых листьев. Небольшая часть этого катиона (около 1 %) прочно связана с белками митохондрий и хлоропластов. Калий стабилизирует структуру этих органелл. При калиевом голодании нарушается ламеллярногранулярное строение хлоропластов и дезорганизуются мембранные структуры митохондрий. До 20% калия клетки адсорбируется на коллоидах цитоплазмы. На свету прочность связи калия с коллоидами выше, чем в темноте. В ночное время может наблюдаться даже выделение калия через корневую систему растений. [c.245]

Большинство таких индикаторов ярко окрашены в окисленном состоянии и бесцветны в восстановленном (хотя имеются и исключения, такие как соли тетразолия и виологены). Эти индикаторы можно применять для определения окислительно-восстановительного потенциала отдельного раствора, а также исполь вать в качестве доноров или акцепторов электронов, причем в этом случае можно следить за скоростью реакции окисления или восстановления. По скорости восстановления красителя, наблюдая за окраской раствора, определяют также ферментативную активность (например, сукцийатдегидрогеназы). Применение индикаторов дает возможность изучать процессы переноса электронов в хлоропластах, митохондриях, бактериальных и дрожжевых клетках и даже в тканевых срезах и гомогенатах. Для определения степени окисленности или восстановленности обычно применяют спектрофотометрические методы, хотя можно следить и за поглош,ением или выделением газа, если оно имеет место в процессе реакции. [c.232]

Для выделения рибосом микросомы обрабатывают дезоксихолатом—реагентом, растворяющим липиды и, следовательно, разрушающим микросомы затем рибосомы осаждают в изотонических буферных растворах центрифугированием при 100000 g в течение 1 ч. При разрушении других субклеточных частиц (ядра, пластиды, митохондрии) из них также могут быть выделены рибосомы. В настоящее время выделение рибосом осуществлено из многочисленных объектов—представителей животного и растительного мира, а также микроорганизмов. Форма и структура рибосом, вьшеленных из разных источников, сходна, но по значению константы седиментации их делят на два класса 70S и 80S. Первые найдены у всех прокариот, а также содержатся в ядрах, митохондриях и хлоропластах эукариот вторые локализованы в цитоплазме только эукариот. [c.285]

Группа соединений, являющихся производными бензохинона, по структуре и своей биологической активности близки витаминам Е и К. Для животных характерен убихинон, который был впервые выделен в 1955 году. У растений кроме убихинона, локализованного в митохондриях, выделен пластохинон из хлоропластов (рис. 7.5-7.7). Бензохи-ноновый скелет придает витамину Q электроноакцепторные свойства, а полиизопреноидный хвост - шпидорастворимость. [c.98]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология