Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия ДСН-электрофорез

Рис. 1.11. Зависимость между молекулярной массой и относительной подвижностью белка при диск-электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (в полулогарифмической системе координат).

С помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) можно определить размеры и субъединичный состав белков [27] [c.215]

Изоэлектрическое фокусирование обладает наивысшей разрешающей способностью, когда-либо достигавшейся при разделении белков цо зар5 дам [58—64, 92]. Этот метод позволяет разделить белки, велйчины р/ которых различаются всего на 0,01 ед. pH. Иногда Для такого разделения бывает достаточно различия между двумя структурами на одну заряженную группу. При помощи метода изоэлектрофокусирования можно также обнаружить другй различия в зарядах, которые, строго говоря, не связаны с макроскопической егомогенностью белков. Вот некоторые из факторов, обусловливающих такие различия посттрансляционная модификация первичной структуры (например, дезамидирование), связывание лигандов, химическая модификация, вариации в небелковых компонентах, например липидах, углеводах и других простетических группах, ассоциация и диссоциация, изменения окислительно-восстановительного состояния металлоферментов. Если при анализе картины изоэлектрофокусирования иметь в виду эти факторы, то полученные данные могут приобрести дополнительную ценность, поскольку в принципе они позволяют обнаружить микрогетерогенность белковых структур. В настоящее время метод изоэлектрического фокусирования применяют в сочетании с другими электрофоретическими методами, например в сочетании с электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, для получения двумерных карт разделяемых компонентов. В одном направлении производят разделение белков в соответствии со значениями их рД а в другом — в соответствии с размерами их молекул, т. е. в соответствии с их молекулярными массами. При помощи этих методов можно охарактеризовать смеси, содержащие тысячи белков [94]. Еще несколько лет тому назад разделение с таким высоким разрешением было просто немыслимо, а в настоящее время этот метод анализа находит все более широкое и все более успешное применение в различных биохимических исследованиях. [c.126]

Для построения калибровочной кривой при определении молекулярных масс используют белки-стандарты тропонин С (18 000 Да), тропонин I (24 000 Да), тропонин Т (38 000 Да), яичный альбумин (42 000 Да) и бычий сывороточный альбумин (68 000 Да), а также стандартный набор для определения молекулярной массы белков. При электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия препарат миозина дает расположенную почти у старта интенсивную полосу тяжелых цепей с м. м. ок. 20 ООО Да и три слабые, но отчетливые полоски легких цепей с м. м. ок. 20 ООО Да для самой тяжелой из них и около 16 000 Да — для самой легкой. Подвижность этих полос в описанных выше условиях высока, поэтому при достаточно большой продолжительности электрофореза эти полоски могут обнаружиться почти у фронта красителя (бромфенолового синего). [c.397]

Определение белкового состава. В большинстве случаев выделяемые мембранные фракции содержат большой набор белков с различной молекулярной массой. Тем не менее определение белкового состава с использованием электрофореза в полиакриламидном геле (в присутствии додецилсульфата натрия) может оказать- [c.66]

Известно несколько способов нахождения количества молекул гаптена, пришитых к носителю. Самый простой спектрофотометрический способ заключается в регистрации изменения поглощения раствора конъюгата при определенной длине волны по сравнению с исходным белком-носителем. Можно также рассчитать соотношение компонентов конъюгата из данных по молекулярной массе, полученных электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия или по аминокислотному гидролизу конъюгата. Если конъюгат получили путем пришивки гаптена к аминогруппам белка-носителя, то его состав можно определить по титрованию свободных аминогрупп в исходном белке и конъюгате. Наиболее точный расчет состава конъюгата получается с помощью радиоизотопного метода, в котором используют меченный радиоактивным изотопом гаптен. [c.177]

При использовании диск-электрофореза в полиакриламидном геле для определения молекулярной массы белков также строят график зависимости между логарифмом молекулярной массы калибровочных белков и подвижностью белковых частиц в полиакриламидном геле, а затем, определив подвижность исследуемого белка, по графику находят его массу (рис. 1.11). Электрофорез проводят в присутствии детергента додецилсульфата натрия, так как только в этом случае наблюдается прямая пропорциональная зависимость между молекулярной массой и подвижностью белков. Белки с четвертичной структурой при этих условиях распадаются на субъединицы, поэтому метод находит широкое применение для определения молекулярной массы субъединиц белка. [c.46]

Электрофорез проводят в пластинах полиакриламидного геля в присутствии додецилсульфата натрия на приборе для электрофореза с вертикальным расположением пластин производства объединения Хийу Калур (ЭССР). Основные и рабочие растворы готовят по методике Лэммли (с. 121). [c.397]

Присутствие ММФ в препаратах НАД-киназы из скелетных мышц кролика было продемонстрировано также при фракционировании на колонке с сефадексом С-200 (3), а значения молекулярных весов олигомеров фермента были уточнены с помощью метода электрофореза в линейном градиенте концентрации полиакриламидного геля (ПААГ) [16]. Результаты, полученные при исследовании фермента двумя указанными методами, показали, что в частично очищенных препаратах НАД-киназы присутствуют олигомеры фермента с молекулярными весами 31000, 65000, 94 ООО, 60 ООО, 220 ООО, 350 ООО. Наименее ассоциированной формой НАД-киназы является белок с молекулярным весом 31 ООО, который, по-видимому, можно считать субъединицей фермента на том основании, что после обработки додецилсульфатом натрия двух низкомолекулярных фракций, снятых с колонки (31 ООО, 5 000), и последующего электрофореза на электрофореграммах не был обнаружен белок с молекулярным весом, меньшим 30 ООО. [c.138]

Сукцинат убихинон-редуктаза (СУР) катализирует окисление сукцината убихиноном. По данным электрофореза, в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия фермент состоит из 3 —4 полипептидов. Субъединицы с молекулярными массами 70 000 и 28 000 Да представляют собой собственно сукцинатдегидрогеназу, в субстратсвязывающем центре которой происходит дегидрирование сукцината низкомолекулярные компоненты комплекса И (м. м. ок. 15 000 Да) придают сукцинатдегидрогеназе реактивность по отношению к убихинону, чувствительность к специфическим ингибиторам и, по-видимому, принимают участие в связывании фермента с мембраной. Выделение препарата СУР основано на экстракции фермента из мембраны с помощью неионного детергента тритона Х-100 и концентрировании препарата охлажденным ацетоном. Дальнейшее фракционирование сульфатом аммония и очистка на кальдий-фосфатном геле позволяют получить фермент в высокоочищенном состоянии с каталитической активностью около 25 мкмоль окисленного сукцината в 1 мин на [c.423]

При электрофорезе белков плазматических мембран в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (гл. 2, разд. 3.6) получают от 1 до 6 четко выраженных полос и, как минимум, еще 35 менее интенсивных полос, соответствующих мол. весам в интервале от 10 000 до 360 000 [28]. Однако некоторые очень важные мембранные белки, апример (Na+-f К+)-зависимая АТРаза (разд. Б.2.в), присутствуют в столь незначительных количествах (в одном эритроците их содержится всего несколько сотен молекул [3, За]), что эти белки не удается идентифицировать на электрофореграмме. Митохондриальные мембраны могут иметь еще более сложный состав, чем плазматические, тогда как состав миелина несколько проще. [c.352]

В середине 60-х годов был разработан модифицированный метод электрофореза - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ). Этот метод был существенным щагом вперед по сравнению с обычными методами анализа белков, известными к тому времени. При использовании данного метода белки мигрируют в инертном матриксе - полиакриламидном геле с высоким содержанием поперечных сщивок. Обычно гель готовят полимеризацией мономеров непосредственно перед использованием. Размеры пор геля могут быть подобраны произвольно с тем, чтобы гель мог замедлить миграцию определенных молекул. При этом белки находятся в растворе, содержащем мощный, отрицательно заряженный детергент - додецнл-сульфат натрия или ДСН (8В8) (рис. 4-48). [c.215]

Ниже описываются три общепринятых метода разделения нептидов. Первый из них ПААГ — ДСН-электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН), обычно в одномерном варианте. Разрешение пептидных фрагментов достигается благодаря различиям в их относительных подвижностях, не всегда отражающих истинные молекулярные массы. Очень важно, что электрофореграмму фрагментов одного белка можно сравнивать с электрофореграм- [c.223]

При электрофорезе в полиакриламидном геле заряд белков не играет решающей роли в определении подвижности данной макромолекулы — особенно при электрофоретическом разделении кислых белков, обычно диспергированных в 0,1%-ном растворе додецилсульфата натрия. В этих условиях основные группы белка образуют комплексы с додецилсульфатом натрия и благодаря этому белки, подобно нуклеиновым кислотам, ведут себя главным образом как полианионы. Разделение в этом случае происходит в основном за счет различий в молекулярных весах, причем более мелкие компоненты движутся впереди более крупных. Путем стандартизации таких гелей с помощью белков или нуклеиновых кислот известного молекулярного веса можно с достаточной точностью определить молекулярный вес неизвестных компонентов [435]. Следует особо отметить, что если исследуемый белок состоит из двух или большего числа цепей, связанных друг с другом дисульфидными связями, и если разделение при этом проводят, как обычно, в присутствии сильных денатурирующих и восстанавливающих агентов, то полученные данные относятся к молекулярным весам структурных субъединиц или даже пептидных цепей. [c.62]

Разделение заряженных соединений с помощью электрофореза можно проводить не только в растворе, но и в различных пористых инертных средах, таких, как крахмал, силикагель, полиакриламидный гель, смоченная фильтровальная бумага. Раствор смеси веществ обычно наносят в виде четкого пятна или зоны, а затем проводят электрофорез, добиваясь иногда полного разделения всех компонентов смеси. Этот процесс, называемый зонным электрофорезом, применяют как для аналитических, так и для препаративных целей. Электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия широко используют для определения молекулярных масс полипептидов (разд. 5.1.7) метод иммуноэлектрофореза рассмотрен в гл. 30. [c.163]

Выделение иммуноглобулинов, связанных с поверхностью клетки, а также их внутриклеточных предшественников (или предшественников секреторных Ig) всегда сопряжено со значительными трудностями. Радиомаркирование, позволяющее выявить следовые количества Ig, облегчает решение этой задачи. После маркирования клетки солюбилизируют в детергенте и обрабатывают лизаты сывороткой анти-Ig, полученной у другого вида иммунные комплексы обычно осаждают затем второй антисывороткой к Ig первой антисыворотки. Меченые клеточные lg, находящиеся в преципитате, исследуют методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН) в присутствии восстанавливающих агентов или без них (Laemmli 1970). Меченые полипептидные цепи, разделенные в геле, опре- [c.77]

Электрофоретическому разделению веществ мешает их диффузия. Среда, в которой мигрируют молекулы, сама по себе в какой-то мере препятствует диффузии, однако еще в большей степени можно подавить этот эффект и одновременно увеличить подвижность сравнительно небольших молекул с помощью высокого напряжения (высоковольтный электрофорез). В некоторых случаях гели выполняют роль сит. Например, в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия разделение предварительно дентурированных белков происходит в соответствии с размерами их молекул. При проведении электрофореза в градиентном геле разделяемые вещества мигрируют в направлении уменьшения диаметра пор геля, и поэтому с увеличением расстояния от старта задерживаются все более мелкие молекулы. [c.28]

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ЭПАГ) стал повседневной процедурой для определения компонентов сложных молекулярных смесей. Электрофоретический перенос полосы на нитро-целлюлозную мембрану (Вестерн-блоттинг) обеспечивает возможность не только тестирования специфичности антител, но и позволяет сконцентрировать макромолекулярный иммуноген для последующего введения его животным. Показано, что окрашенные на белок, вырезанные и тонко измельченные по- [c.52]

Поскольку гель-фильтрация дает безусловно лучшие выходы при разделении крупных пептидов, чем ионообменная хроматография, оптимальный метод расщепления белка в двухстадийном анализе (рис. 10.2) удобно выбирать на основе результатов аналитического электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДНС), При четком разделении полос в геле целесообразно для препаративного фракционирования пептидов применять гель-фильтрацию. Электрофорез в ПААГ в присутствии ДСН используется также для ко1ггроля полноты процесса расщепления белка химическими реагентами. [c.349]

Характеристика очищенных антител. При использовании in vivo к качеству моноклональных антител предъявляются очень высокие требования. Поэтому характеристике получаемых для этих целей в производственном масштабе антител следует уделять самое тщательное внимание. Необходимо, например, разработать методы определения пикограммовых количеств возможных примесей (например, ДНК или РНК). Если же моноклональные антитела предполагается использовать для диагностических целей, важнее удостовериться в их функциональной пригодности. Как правило, для того чтобы показать, что препарат антител удовлетворяет принятым стандартам, его характеризуют двумя методами -изоэлектрическим фокусированием и электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. [c.49]

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия — это основная процедура во всех обсуждаемых ниже методах двумерного разделения. Описание прибора и основных принципов разделения было сделано ранее (Taka s, 1979). Ниже будет сказано лишь об особых деталях метода, которые применяются в нашей лаборатории и дополняют процедуру, описанную в упомянутой статье. [c.73]

Меченные радиоизотопом надосадочные жидкости всех гибридных культур анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и методом изоэлектрофокусирования. Двадцать культур гибридных клеток продолжали секретировать миеломный IgG, который синтезировала родительская миелома, одиннадцать культур — дополнительный IgM, две культуры — дополнительные молекулы IgG и две — только дополнительные легкие цепи шесть — не секретировали дополнительных Ig-цепей. Один из синтезируемых гибридами IgM и один IgG2b вызывали гемолиз бараньих эритроцитов. Антител к ТНФ-группе не было обнаружено. [c.405]

Важно иметь в виду, что прогресс в биохимии зависит от разработки новых методов анализа, очистки и определения структуры. Например, в области биохимии липидов произошел настоящий переворот после введения в практику гяэо-жвдкостной и тонкослойной хроматографии. Анализ мембранных и многих других белков был крайне затруднен до тех пор, пока не появился метод электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПЭГ) применение додецилсульфата натрия приводит к солюбилизащш (растворению) ряда белков, которые ранее не удавалось перевести в растворимое состояние. После такой солюбилизации уже можно проводить электрофорез. Разработка методов клонирования и секвенирования (определения последовательности мономеров) ДНК произвела подлинную революцию в изучении нуклеиновых кислот и вообще в биологии. [c.16]

Б. Один из вариантов экспериментальной проверки возражения вашей коллеги состоит в том, чтобы разрушить незамкнутые тени эритроцитов до того, как они будут подвергнуты обработке проназой. Если спектрин устойчив к действию проназы, его подвижность при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии детергента, додецилсульфата натрия, не должна измениться. Если, однако, спектрин локализован на цитоплазматической поверхности мембраны и расщепляется проназой, его подвижность должна значительно измениться. Эти контрольные эксперименты были проделаны и показали, что спектрин чувствителен к про-назе. [c.316]

В течение второго периода, длившегося с середины 60-х до середины 70-х гг., на очистку интерферона не жалели усилий. Важным достижением, полученным в ходе этих работ, которые наконец увенчались успехом [126], было осознание того, что существует не один, а несколько молекулярных видов каждого из интерферонов человека (а и р). Это подготовило почву для последующего открытия семейств интерфероновых генов (см. ниже). Использовали два приема, оказавшихся решающими для очистки интерферона иммуноаффинную хроматографию и нечувствительность интерферона к додецилсульфату натрия (ДСН) последняя позволила применить электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии ДСН как эффективный заключительный этап очистки. Электрофорез показал, что интерфероны, точнее р-интерферон, представляют собой гликопротеины. По данным Дорнера и сотр. [58], довольно широкая полоса, которую дает р-интерферон в геле с ДСН, существенно сужается, если интерферон сначала обработать гликозидазами. [c.37]

БАМ высокой мол. массы — БАМ-1 ( — 350 кДа) и -БАМ-2 ( 270 кДа) — дают при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия гетерогенную картину. БАМ-2 разделяется на два компонента, а БАМ-1 состоит по меньшей мере из трех жомпонентов. БАМ-1 содержит также полипептиды меньшего размера (называемые легкими цепями 1 и 2), которые имеют мол. массу приблизительно 30 и 28 кДа и присутствуют в соотношении 1 1. БАМ-1 распространен, по-видимому, более широко, чем БАМ-2 он обнаруживается как на микротрубочках интерфазных клеток, так и в митотическом веретене [21]. [c.21]

Смотреть страницы где упоминается термин Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия ДСН-электрофорез: [c.17] [c.118] [c.144] [c.145] [c.268] [c.337] [c.124] [c.195] [c.245] [c.57] [c.58] [c.9] [c.9] [c.36] [c.206] [c.10]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология