Осаждение белка хлороформом

Работа 49. Осаждение белка хлороформом [c.67]

При действии электролитов или органических растворителей (спирт, хлороформ) на растворы белков происходит их осаждение (свертывание). Нагревание же приводит к необратимому осаждению и утрате многих свойств. Такое явление получило название денатурации белка. Под этим подразумевается такое превращение белка, которое приводит к потере его естественных свойств. Следствием такого процесса является нарушешге структуры белковой молекулы. Первичная структура каким-либо изменениям в этом случае не подвергается. [c.427]

М. Ц. диссоциирует на субъединицы прп обработке его восьмпмолярным р-ром мочевпны лпбо при диализе против ацетатного буфера pH 4,0, содержащего аскорбиновую или этилепдпаминтетрауксус-ную к-ту. Выделение Ц. производят фракционированием белков сывороткп крови сульфатом аммония, осаждением спиртом в изоэлектрич. состоянии балластных белков, избирательной денатурацией белков хлороформом II спиртом и последующей экстракцией Ц. пз конечного осадка солевым р-ром (см. также Металлопротеиды). [c.411]

Балластные белки обычно осаждают одним из известных методов фракционирования — избирательной денатурацией. Если фермент устойчив к нагреванию (например, рибонуклеаза выдерживает нагревание до 90° С без инактивации), проводят термическую денатурацию инертных белков, нагревая экстракт определенное время при 50—70° С. Применяют также кислотную денатурацию (подкисляют экстракт до pH 5 или ниже), если выделяемый фермент не инактивируется при данном pH используют и обработку экстракта хлороформом или смесью хлороформа и спирта. Денатурированные балластные белки отделяют от фермента центрифугированием или фильтрацией, а затем из водного раствора путем дробного осаждения (в основе которого лежит различная растворимость белков-ферментов) выделяют фракцию, обладающую наибольшей ферментативной активностью. [c.200]

В том случае, если после осаждения белков требуется из фильтрата удалить трихлоруксусную кислоту, то это достигается кипячением фильтрата, в результате чего трихлоруксусная кислота разлагается на хлороформ и угольный ангидрид, которые улетучиваются. [c.27]

После охлаждения экстракт, содержащий аминокислоты, переносят в делительную воронку. Туда же для осаждения белков добавляют трехкратный объем хлороформа. Смесь встряхивают в течение 5 минут. После этого воронку со смесью выдерживают в течение 16— 20 часов в прохладном помещении. При такой обработке белки осаждаются, а образовавшийся чистый верхний слой отделяют и используют для анализов. [c.40]

Для выделения используют небольшие объемы ночных культур. Методика включает ферментативную обработку агробактерий с последующим удалением белков из экстракта смесью фенол/хлороформ и концентрирование нуклеиновых кислот путем осаждения этанолом. Описанная ниже методика успешно использовалась для ряда штаммов агробактерий. В следующем разделе 1.12 представлены результаты расщепления суммарной ДНК, агробактерий ферментами рестрикции и примеры анализа по Саузерну последовательностей плазмид, содержащихся в различных мини-препаратах тотальной нуклеиновой кислоты агробактерий. [c.76]

Часто приводимым примером осаждения белка органическим растворителем, но на этот раз не смешивающимся с водой, является денатурация гемоглобина хлороформом (ср. [7] и, например [36]). Очистка ферментов эритроцитов осложняется тем, что более 90% общего белка эритроцитов составляет гемоглобин. Встряхивание гемолизата со смесью этанол — хлороформ приводит к полной денатурации гемоглобина. Незначительное количество хлороформа смешивается с водной фазой и оказывает сильное специфическое денатурирующее действие на молекулы гемоглобина. Таким образом, первой стадией выделения эритроцитарного фермента часто служит обработка гемолизата хлороформом, что приводит к удалению основного загрязняющего белка — гемоглобина. [c.90]

Операцию осаждения белков повторяют до тех пор, пока спирт пе перестанет что-либо осаждать. Тогда еще раз вытяжку упаривают до густоты сиропа и обрабатывают 20—25 мл воды. Если при этом образуется осадок, его отфильтровывают и тщательно промывают небольшим количеством воды. Из водного раствора нутем повторных извлечений (3—4 раза) небольшими порциями по 10—15 мл хлороформа сначала из кислой, а затем из щелочной жидкости экстрагируют интересующие судебного химика вещества. [c.147]

Принцип. Метод основан на осаждении белков спиртом, экстрагировании холестерина хлороформом. При взаимодействии холестерина, уксусного ангидрида и концентрированной серной кислоты в безводной среде разживается интенсивно зеленая окраска. [c.69]

В используемых в настоящее время методах [60] применяется и ряд других предосторожностей, например гомогенизация ткани проводится в глициновом буфере (pH 10,4) с хлороформом при 2—4°. Обработка для освобождения от белка применяется повторно и проводится, как и скоростное центрифугирование, при низкой температуре. Конечной стадией очистки является осаждение этанолом. [c.186]

Маточный раствор после осаждения белка два раза извлекли равными объемами хлоро( )орма. Образования эмульсии не наблюдалось. После отгонки хлороформа получено 2.33 г суммы экстрактивных веществ, представлявшей собой смолистую слегка коричневую полукристаллическую массу. Из этой смеси после переработки по обычной методике получено 0.04 г сильно загрязненного колхамшвс т.пл. 169-175°. Из вьргяжки нейтральных веществ получено 0.21 г смолистого вещества, из которого не удалось получить колхицина или [c.219]

При осаждении белков упомянутыми выше способами очень трудно отделить осажденный денатурированный белок от вещества, примененного для осаждения. Этого затруднения можно избежать, если для денатурации и осаждения белков использовать их тепловую коагуляцию или метод Севага [31]. Метод Се-вага состоит в том, что белок денатурируется и переводится в нерастворимое состояние путем встряхивания с хлороформом. Избыток хлороформа удаляется выпариванием. [c.19]

Смесь хлороформ/октанол используют для денатурации и осаждения белков. Октанол добавляют для улучшения смачивающих свойств хлороформа, а также в качестве поверхностно-активного вещества для предотвращения вспенивания СТАВ. Вместо октанола можно использовать изоамиловый спирт, это зависит от того, какой запах вам более неприятен После экстракции органическими растворителями и центрифугирования водная фаза должна быть прозрачной. В противном случае необходимо центрифугировать либо в течение большего промежутка времени, либо при больших скоростях. СТАВ растворим в хлороформе, поэтому для поддержания требуемой концентрации добавляют 107о-ный СТАВ. (10%-ный СТАВ очень вязкий, и перед использованием его рекомендуется нагреть до 56°С). [c.244]

Источником получения ДНК обычно является ви-лочковая железа (тимус) телят, т. к. в ее клетках ядра составляют больше половины объема. Для получения РНК удобнее всего использовать дрожжи. Н. к. всегда тесно связаны с белками в нуклеопротеидных структурах. Для их освобождения проводят денатурацию белков добавлением к взвеси клеток (предварительно вскрытых путем разрушения их оболочки ) р-ра фенола высокой концентрации, а также нек-рых детергентов (напр., додецилсульфата) или хлороформа. Обычно фенольная депротеинизация ведется так, что фенола дается большой избыток и после отстаивания или центрифугирования образуются два слоя внизу — фенол, насыщенный водой, сверху — вода, насыщенная фенолом. Денатурированные белки сосредоточиваются в нижнем слое и у границы раздела, Н. к.— в верхнем водном слое, откуда их осаждают спиртом. При фенольной экстракции возможно частичное фракционирование Н. к. на ДНК (растворяется преимущественно при pH9) и РНК (растворима и при рН5). Однако полностью отделить ДНК и РНК друг от друга удается только дополнительным воздействием специфическими гидролитич. ферментами ДНК-азой и РНК-азой. Эти ферменты добьхваются из поджелудочной железы рогатого скота, подвергаются тщательной очистке и кристаллизации. Действуя ДНК-азой, разрушают ДНК и получают чистую РНК. С помощью РНК-азы очищают ДНК от РНК. После ферментативной обработки полученные продукты снова подвергают фенольной депротеинизации с последующим осаждением Н. к. спиртом. [c.189]

В современных методиках выделения ДНК (обзоры — см. ) основной стадией является обычно экстракция биологического материала фенолом 9. При этом ДНК после разделения слоев переходит в водный слой или остается в виде осадка в интерфазе, а большая часть белка денатурирует и переходит в фенольный слой. Для удаления белка из препаратов ДНК используют также обработку детергентами смесью хлороформ — изоамиловый (или октиловый) спирт а также инкубацию с протеолитическими ферментами, например с проназой РНК отделяют от ДНК фракционным осаждением спиртом и обработкой препарата рибонуклеа-зами. Большая часть полисахаридов обычно удаляется при фракционном осаждении этанолом или изопропанолом в некоторых случаях приходится применять дополнительную очистку (экстракция метилцеллозольвом, фракционирование цетавлоновых солей, электрофорез). [c.29]

Получение хондроитин-4-сульфата в крупных масштабах основано на экстракции ткани раствором щелочи, удалении белков и фракционном осаждении смеси полисахаридов спиртом. Первоначально для экстракции полисахарида использовали холодный 2%-ный раствор едкого кали или едкого натра [4, 5]. В методике с более мягкими условиями исполь- <уются растворы нейтральных солей [4, 6], но при этом экстрагируется. [ИШЬ незначительная часть хондроитин-4-сульфата, если хрящ не был предварительно выдержан в течение 4—6 недель ири 0° [7]. Ниже приво- 1ится методика, предусматривающая экстракцию растворами нейтральной соли и слабой щелочи [7]. Удаление белка из раствора достигается осаждением фосфорновольфрамовой кислотой 18], денатурацией амиловым спиртом и хлороформом 151 (см. стр. 261) и адсорбцией на каолине с пред- арительной обработкой формальдегидом [9] или без нее [7]. Последний метод описан ниже. [c.347]

Гиалуроновую кислоту можно освободить от примеси хондроитинсульфатов осаждением цетилпиридинийхлоридом или адсорбцией на ЭКТЕОЛА-целлюлозе. В крупномасштабных опытах при высаливании сульфатом аммония в присутствии пиридина [2] получают продукт, ие содержащий каких-либо сульфатов (содержание 3 << 0,1%). В настоящем разделе описан новый метод [2], предусматривающий растворение ткани при обработке пепсином и трипсином, последующее удаление белка смесью амилового спирта и хлороформа и окончательную очистку осаждением сульфатом аммония в присутствии пиридина. [c.368]

Фракцию клеточных стенок суспендируют в 100 мл насыщенного хлороформом трис-буфера. Добавляют дезоксирибонуклеазу (0,5 мл раствора с концентрацией 1 мг/мл) и рибонуклеазу (1,0 мл раствора с концентрацией 5 мг/мл) и инкубируют суспензию при 37 °С 30 мин. Добавляют 100 мкг кристаллического трипсина и продолжают инкубацию при той же температуре еще б ч. Клеточные стенки осаждают центрифугированием и промывают, как описано выше. Осаждение и промывание повторяют до получения гомогенного слоя. Для удаления денатурированных белков добавляют трипсин. Этот фермент вызывает автолиз пептидогликана некоторых бактерий. В этом случае при центрифугировании осадка не образуется. Если это наблюдается, обработку трипсином проводить не следует. Выделение пептидогликана из большинства грамотрицательных бактерий требует большого количества клеточного материала (20—30 г) из-за низкого содержания этого полимера в бактериях и его повышенной чувствительности к автолизу. Методика получения 150 мг пептидогликана из клеток Е. oli описана Вейделем и др. [56], [c.330]

Экстракт можно легко получить из осажденных центрифугированием эритроцитов после промывания их изотоническим раствором Na l (0,9%, 0,15 М) и повторного центрифугирования. Клетки разрушают осмотическим шоком в воде (2 объема воды на 1 объем отцентрифугированных клеток). Однако около 90% белка, переходящего в раствор, составляет гемоглобин, и если вы занимаетесь очисткой другого белка, то очень полезно применить метод селективного удаления гемоглобина. Для денатурации гемоглобина успешно применяется смесь этанол-хлороформ [7]. [c.44]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология