Осаждение белка спиртом

Выделение белков из клеток растений очень сложно и обычно заключается прежде всего в экстрагировании их изучаемого материала соответствующими растворителями. Как увидим дальше, отдельные группы белков растворимы в различных растворителях, и для их экстракции из растений в качестве растворителей используют воду, растворы солей, спирта, кислот и щелочей. Экстрагированные белки могут быть осаждены из растворов различными реактивами. В качестве осадителей белков используются органические растворители — спирт, ацетон концентрированные растворы минеральных солей, чаще всего растворы сульфата аммония кислоты — трихлоруксусная, фосфорновольфрамовая, пикриновая дубильные вещества, например таннин соли тяжелых металлов — ртути, меди, свинца. После осаждения белки отмывают и высушивают. [c.212]

II. Осаждение белков спиртом [c.22]

Существующие методы осаждения белка можно разделить на методы обратимого осаждения и методы, применение которых ведет к разрушению пространственной структуры белковых молекул. При высаливании белков, осаждении их спиртом и ацетоном на холоду получаются осадки, которые можно затем вновь растворить без потери биологических свойств белка. При осаждении кипячением, минеральными и органическими кислотами, солями некоторых тяжелых металлов белки теряют свои биологические свойства. [c.61]

Работа 47. Осаждение белка спиртом [c.66]

Интересно, что процесс денатурации белков, вызванный всеми перечисленными органическими веществами, не зависит от температуры и, для мочевины например, может иметь отрицательный температурный коэффициент. Этим они существенно отличаются от органических растворителей — таких, как, например, спирт или ацетон. Последние денатурируют и необратимо осаждают белок из растворов при комнатной и более высоких температурах. При критической температуре, лежащей около 65°, осаждение белка происходит при относительно невысоких концентрациях органических растворителей. Тем не менее, как уже указывалось в гл. I, нри температурах, близких к точке замерзания, можно производить фракционирование белков добавлением различных количеств растворителей, не вызывая их денатурации. Полагают, что осаждающее и денатурирующее [c.185]

Удобен следующий прием медленного добавления сульфата аммония при изоэлектрическом высаливании белков в забуференный рас твор белка опускают целлофановый мешочек с твердым сульфатом аммония, электролит диффундирует через мембрану и вызывает осаждение белка. Осадок белка, содержащий неорганическую соль, диали-зуют (дистиллированная вода) сульфат аммония удаляется и белок переходит в раствор. Для переосаждения используют описанный выше прием. Кристаллизации белка можно достичь после подходящего числа повторений этого процесса. Другой удобный метод переосаждения и иногда кристаллизации — добавление этилового спирта к раствору белка в изоэлектрической точке и охлаждение. [c.689]

Осаждение белков из растворов. При добавлении к водным растворам белков концентрированных растворов минеральных солей (например, сернокислого аммония) белки осаждаются высаливаются). Осаждение их происходит и при добавлении органических растворителей (спирта, ацетона). Во всех этих случаях белки не изменяют своих свойств и при разбавлении водой вновь переходят в раствор. [c.296]

Образование желчных пигментов. Билирубин образуется при распаде гемоглобина, который протекает в клетках ретикулоэндотелиальной системы — купферовских клетках печени, гистиоцитах соединительной ткани любого органа. Вначале происходит разрыв ме-тинового мостика между 1-м и 2-м пиррольными ядрами порфиринового кольца с одновременным окислением двухвалентного железа в трехвалентное. Образуется пигмент вердоглобин. Затем он теряет железо и глобин, порфириновое кольцо разворачивается в цепи и образуется пигмент зеленого цвета — биливерДин. Биливердин ферментативным путем восстанавливается в красно-желтый пигмент — билирубин. Образовавшийся пигмент называют свободным, или неконъюгированным. Он нерастворим в воде, поэтому в крови транспортируется в комплексе с альбумином. Для определения свободного билирубина в крови необходимо предварительное осаждение белка спиртом. Только после этого билирубин вступает во взаимодействие с диазореактивом, поэтому его иначе называют непрямым билирубином. Свободный (непрямой) билирубин не проходит через почечный барьер и в мочу не попадает. В печени он соединяется (конъюгирует) с УДФ-глюкуроновой кислотой. Эта реакция катализируется ферментом УДФ-глюкуронилтрансферазой. Образующийся глюкуронид билирубина получил название связанного, или конъюгированного, билирубина. Он растворим в воде, дает прямую реакцию с диазореактивом, поэтому иначе его называют прямым билирубином. Прямой (связанный) билирубин — это нормальный компонент желчи, попадающий в кровь в очень небольшом количестве. Он может проходить через почечный барьер, но в крови его очень мало, поэтому в моче он не определяется обычными лабораторными методами. Вместе с желчью прямой билирубин попадает [c.439]

Осаждение белков спиртом. Навеску (2—3 г) измельченной ножницами на холоде ткани переносят в гомогенизатор с 5 объемами охлажденного 96%-ного этанола гомогенат сливают в центрифужный стакан, оставляют при комнатной температуре на 20 мин, затем центрифугируют 10 мин при 3000 Надосадочную жидкость сливают в колбу с узким горлом (при обработке 2—3 г мышц объем колбы 200 мл, при получении экстракта из большой навески можно пользоваться делительной воронкой), осадок трижды промывают 15 мл [c.191]

Билирубин слаборастворим в водной среде, и, поступив в кровь, он специфически связывается с альбуминами плазмы крови, молекулы которых имеют два центра связывания билирубина — высоко- и низкоаффинный. Билирубин в комплексе с альбуминами носит название непрямого билирубина, поскольку для его определения в крови необходимо предварительное осаждение белков спиртом. После этого билирубин вступает во взаимодействие с диазореактивом Эрлиха. [c.419]

К обратимым реакциям осаждения следует отнести большинство реакций высаливания белков, а также осаждение их спиртом или ацетоном при непродолжительном действии этих реактивов на белок при низ кой температуре. [c.20]

Действительно, поразительна была простота получения препаратов. Р.Вильштеттер работал в течение многих дней для того, чтобы получить с Помощью чрезвычайно тонких и кропотливых методов препарат хотя и сравнительно высокой степени чистоты, но зато разведенный до чрезвычайности, с ничтожнейшим выходом. Новые методы сводились к элементарному приему, который был известен каждому студенту химику осаждению белка спиртом или ацетоном. [c.155]

Принцип. Метод основан на осаждении белков спиртом, экстрагировании холестерина хлороформом. При взаимодействии холестерина, уксусного ангидрида и концентрированной серной кислоты в безводной среде разживается интенсивно зеленая окраска. [c.69]

Операцию осаждения белков повторяют до тех пор, пока спирт перестанет что-либо осаждать. Тогда в последний раз вытяжку выпаривают до густоты сиропа и последний растворяют в небольшом количестве воды (например, в 50 см ). [c.195]

Спиртовые вытяжки соединяют вместе, а биологический материал промывают спиртом. Спирт присоединяют к слитым ранее порциям вытяжек. Извлечения отфильтровывают и сгущают до густоты сиропа под уменьшенным давлением или в фарфоровой чашке на водяной бане, имеющей температуру воды не выше 40° (во избежание разрушения таких веществ, как атропин, кокаин, и некоторых других соединений, имеющих характер сложных эфиров). Сиропообразную жидкость обрабатывают 96°, а еще лучше абсолютным спиртом, приливая его по каплям и перемешивая жидкость стеклянной палочкой. Спирт добавляют до тех пор, пока не прекратится осаждение белков. [c.121]

Жидкость отстаивают, фильтруют, фильтр промывают спиртом и фильтрат упаривают до густоты сиропа при описанных выше условиях. В сиропообразном остатке снова осаждают белки, жидкость отстаивают и фильтруют. Операцию осаждения белков повторяют до тех пор, пока спирт перестанет что-либо осаждать. Тогда вытяжку упаривают до густоты сиропа и обрабатывают 20—25 мл воды. Если при этом образуется осадок, его отфильтровывают и тщательно промывают небольшим количеством воды. [c.122]

В данной работе ИЭТ определяется по наибольшему помутнению белка, помещенного в буферные растворы с различными значениями pH. В растворе с значением pH, при котором белок лишен заряда, он выпадает в осадок. Осаждению белка способствует добавление этилового спирта, обладающего дегидратирующим действием. [c.36]

Способность белков осаждаться при известных условиях представляет интерес не только с точки зрения возможности их открытия с помощью реакций осаждения, но также и с точки зрения освобождения биологических жидкостей от белков в тех случаях, когда это необходимо в аналитических целях. Помимо осаждения белков кипячением в присутствии уксусной кислоты применяется также осаждение спиртом, ацетоном, высаливание белков из раствора концентрированными растворами нейтральных солей щелочных металлов, осаждение фосфорновольфрамовой кислотой, фосфорномолибденовой кислотой, трихлоруксусной кислотой и т. д. [c.277]

Полученные результаты отнести к белковому азоту в 10 лег исходного экстракта и, таким образом, получить количество осажденного белка (при той или иной концентрации метилового спирта) в процентах общего содержания белкового азота. [c.240]

Это выполняется чаще всего осаждением вытяжки спиртом (этиловым, изопропиловым), но возможны, естественно, и иные способы выделения ферментов из нее, например высаливанием. При осаждении спиртом необходимо вытяжку и спирт предварительно охлаждать (до 5°С), чтобы избегнуть инактивации ферментных белков. Кроме того, при этом способе нужно систематически регенерировать значительные количества спирта, что не представляет сложной задачи. Потери при регенерации составляют 1—2%. [c.176]

Многие органические растворители (спирты, ацетон, эфир и др.) осаждают белки из нейтрального или слабокислого раствора. Если к водному раствору белка прибавлять, например, этиловый спирт, то можно достигнуть такой концентрации его (неодинаковой для разных белков), когда происходит осаждение белка. Механизм действия спирта объясняют связыванием воды, что ведет к дегидратации мицелл белка и понижению их устойчивости в растворе. [c.22]

Осаждение белков из растворов можно производить также и прибавлением спирта, действующего как водоотнимающий фактор. Осадки, получаемые при действии спирта, в случае быстрого отделения белка от осадителя сохраняют свои исходные (нативные) свойства и, в частности, способность к обратному растворению в воде. При долгом же соприкосновении осадка со спиртом белок постепенно утрачивает ряд своих исходных свойств и переходит в нерастворимую в воде форму. [c.17]

Паули установлено, что при осаждении альбумина равными количествами спирта наименьшее количество его выпадает из тех растворов, вязкость которых достигает наибольшего значения. с Коагуляция белка электроли- 13 тами также зависит от вязкости 7 . растворов. С увеличением внутрен-него трения смеси белок—кислота требуется большая концентрация свободной кислоты для осаждения белка. В8 [c.127]

Основное место образования билирубина—печень, селезенка и, по-видимому, эритроциты (при распаде их иногда разрывается одна из мегиновых связей в протопорфирине). Образовавшийся во всех этих клетках билирубин поступает в печень, откуда вместе с желчью попадает в желчный пузырь (см. главу 16). Билирубин, образовавшийся в ютетках системы макрофагов, называется свободным, или непрямым, билирубином, поскольку вследствие плохой растворимости в воде он легко адсорбируется на белках плазмы крови и для его определения в крови необходимо предварительное осаждение белков спиртом. После этого билирубин вступает во взаимодействие с диазореактивом Эрлиха. [c.507]

После отгонки спирта в отгонной колбе остается некоторое количество сиропообразной жидкости. Получившийся сироп растворяют теплой водой (4 раза по 15— 20 мл) и количественно переносят в мерную колбу на 100 мл. Добавляют несколько миллилитров 10%-ного нейтрального уксуснокислого свинца (для осаждения белков), осаждают избыток свинца сульфатом натрия, фильтруют и в очищенном растворе проводят дифферен- [c.90]

Обратимое осаждение — высаливание, когда белки после осаждения могут быть вновь переведены в раствор добавлением новой порции растворителя, например воды. Осаждение белков вызывается этиловым спиртом, ацетоном, минеральны.ми солями (например, сернокислым аммонием). При обратимом осаждении свойства белков не меняются. [c.214]

Осаждение белков спиртом обратимо при условии, если нродесс проводили бс з нагренапия и воздействие реагента было кратковременным. Продолжительный контакт белка со спиртом ведет к необратимому осаждению, денатурации. [c.21]

Для лучшей очистки белков проводят их переосажде-ние. Для этого в центрифужные пробирки добавляют теплый раствор 0,2 н. NaOH и жидкость из пробирок вместе с осадком переливают в стакан. Пробирки несколько раз промыв-ают 0,2 н. NaOH, сливая раствор в тот же стакан. Жидкость в стакане нагревают при помешивании на водяной бане до 50° до полного растворения белков. Нерастворившиеся частицы (остатки клеток) отделяют центрифугированием. Для переосаждения белков в стакан с раствором белка добавляют 50%-ную трихлоруксусную кислоту до конечной концентрации 5%. Осажденные белки отделяют центрифугированием. Для очистки белков их продолжают промывать в центрифужных пробирках ацетоном (5—6 раз), горячим этиловым спиртом (1—2 раза) и эфиром (2—3 раза). После каждого добавления реактива проводят центрифугирование, а жидкость над осадком сливают. Затем препараты белков высушивают при комнатной температуре или очень слабом нагревании. В препаратах белков определяют общее содержание азота по Кьельдалю. [c.47]

При осаждении белков спиртом, ацетоном и концентрированными растворами минеральных солей белки не теряют способности снова переходить в раствор, чем ишроко пользуются для выделения [c.699]

Во многих работах концентрация сернокислого аммония, применяемого для выделения белков, выражается в процентах от насыщенного раствора. Например, раствор, содержащий равные части воды и насыщенного раствора сернокислого аммония, считается нолунасыщенным (50% насыщения). Этот способ обозначения не совсем точен, потому что насыщение до некоторой степени зависит от температуры раствора. Лучше поэтому выражать концентрацию сернокислого аммония более принятым в химии способом, например в молях. Кон и его сотрудники успешно применили метод фракционированного осаждения сернокислым аммонием и этиловым спиртом для разделения сывороточных белков. Этим способом ими было получено из сыворотки большое количество фракций, содержащих биологически активные белки (см. гл. VIII). При фракционировании больших количеств белка спиртовый метод имеет преимущества перед другими методами, так как большую часть спирта легко удалить испарением, тогда как удаление солей путем диализа требует много времени и труда. Существенной чертой нового метода является то, что при осаждении белков спиртом систематически варьируются ионная сила, концентрация водородных ионов, температура и диэлектрическая постоянная раствора. Варьируя вышеуказанные факторы, удалось выделить из кровяной сыворотки большое количество новых белков. [c.14]

Исследуя водные экстракты различных растений, Любименко в больщинстве случаев обнаруживал устойчивый белково-хлорофилльный характер этих растворов. Об этом свидетельствовали качественные реакции с растворами, аналогичные реакциям на белок (осаждение танином, спиртом, ацетоном и т. д.). Обработка раствора хлорофилла кислотами и веществами, вызывающими коагуляцию белков, также вела к потере их стойкости. От кипячения же раствор становился мутным, хотя осадок и не выпадал, а раствор приобретал еще более ярко-зеленый оттенок. Все это привело Любименко к убеждению, что в полученном из листьев водном коллоидальном растворе существует тесная связь между зеленым пигментом и белком и это соединение хлорофилла с белком в живых хлоропластах представляет собой цветной (зеленый) белок типа гемоглобина. Таким образом,— писал он,— связь пигмента с белками пластид более тесного характера, и потому мысль о химическом соединении в данном случае напрашивается сама собой. Если вспомнить, что и сходное с хлорофиллом красящее вещество крови также связано хи1 ически с белками, то мысль, что хлорофилл живых пластид есть цветное белковое соединение, не покажется невероятной 9 . Предполагаемому хлорофилл-белковому комплексу Любименко дал название натур ального, или естественного, хлорофилла в отличие от хлорофилла в молекулярном растворе. [c.183]

Переносят диски в прибор Сокслетта и экстрагируют 80%-ным этиловым спиртом в течение 2 ч (до полного обесцвечивания дисков). Спиртовой раствор упаривают в вакууме досуха, осадок переносят на фильтр и несколько раз промывают небольшими порциями воды. В фильтрат вносят небольшое количество 1 %-ной серной кислоты и гидролизуют на кипящей водяной бане при перемешивании в течение 30 мин (идет расщепление сахаров на гексозы). Кислый раствор нейтрализуют горячим раствором МаОН (по бромфенолу синему рН = 3,0- 4,6) при перемешивании. По исчезновении желтой окраски нейтрализацию заканчивают. Осадок отделяют центрифугированием, промывают 2—3 раза небольшими порциями дистиллированной воды и отбрасывают. К раствору (100—150 мл) из бюретки добавляют 10%-ный раствор ацетата свинца до полного осаждения белков. Раствор подогревают и фильтруют. В фильтрат вносят 0,5 г активированного угля и раствор при постоянном перемешивании кипятят 10—15 мин. Уголь отфильтровывают, промывают дистиллированной водой и отбрасывают. Фильтрат упаривают до 30—50 мл и пропускают через колонки с катионитом (10 г) и анионитом (10 г) со скоростью 2 мл мин. [c.529]

Трихлоруксусная кислота (A idum tri hlora eti um) lj OOH— кристаллическое вещество, плавящееся при 57°, очень гигроскопичное, со слабым запахом, легко растворимое в воде, спирте и эфире. Применяется часто в лабораторной практике для осаждения белка, в медицине—для прижиганий в ларингологической практике. [c.126]

Присутствие органических растворителей является помехой при определении активности почти всех ферментов. Поэтому при осаждении фермента растворителем (спиртом, ацетоном, диоксаном и т. п.) активность следует контролировать только после отделения осажденного белка, его растворения и удаления остатков спирта, ацетона и т. п. По сравнению с фракционированием в растворах солей обработка органическими, легко летучими веществами, имеет то преимущество, что получение готового препарата и его высушивание может быть вьшолнено сразу, без предварительного диализа растворов, а следовательно, без разбавления и частичной (дополнительной) инактивации, которые часто сопутствуют диализу. [c.146]

После того как буферные смеси приготовлены, в каждую пробирку добавляют по 2 капли раствора яичного белка и, перемешав содержимое пробирок, добавляют еще по 10 капель спирта. Содержимое пробирок снова тщательно перемешивают. Через 5— Омин отмечают пробирку с максимальным помутнением. Наиболее интенсивное помутнение, а следовательно, и максимальное осаждение белка наблюдается вблизи его изоэлектрической точки. [c.63]

Проламины выделяют по следующей методике. Спиртовой экстракт из мерной колбы переливают в прибор для отгонки спирта в вакууме. Спирт отгоняют при температуре 35°. После полного удаления спирта к оставшемуся раствору, в котором белки начинают выпадать в осадок, добавляют небольшое количество воды и оставляют в холодильнике в течение ночи. При этом основная масса белков выпадает в осадок. Для полного осаждения белков раствор насыщают ацетоном до 90% реакцию раствора доводят до слабощелочной, добавляя несколько капель 1 н. NaOH. Содержимое колбы переносят в центрифужные пробирки, колбы споласкивают ацетоном и осадок белков отделяют центрифугированием при 3—4 тыс. об/мин. в течение 5—10 минут. Затем белки в пробирках несколько раз промывают ацетоном и эфиром с последующим центрифугированием. Осадки белков высушивают в вакуум-эксикаторе. [c.53]

Свободные аминокислоты анализировали хроматографическихм методом. После предварительного осаждения белков свободные аминокислоты, содержащиеся в фильтрате, собирали на катионите КУ-1. С целью вытеснения аминокислот катионит обрабатывали 5%-ным раствором углекислого аммония. Полученный раствор с аминокислотами выпаривали досуха на водяной бане. Очищали смесь аминокислот 75%-ным этиловым спиртом и далее разгоняли на хроматографической бумаге (Ватман № 2) в восходящем направлении. В качестве растворителей использовали смесь чистого бутанола, ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении 4 1 1, фенол, насыщенный фосфатным буфером (pH 12), и воду. Четырехкратный разгон в первом из названных растворителей давал возможность выделить следующие аминокислоты 1) цистин-Ьцистеин, [c.138]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология