Хроматография на агарозном геле

Обычная анионообменная хроматография оказалась непригодной для очистки РНК, содержащих более 100—150 нуклеотидных остатков. Поэтому рибосомальные и матричные РНК обычно разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном или агарозном геле. К достоинствам этого метода относится высокая скорость процесса и высокая разрешающая способность по отношению к одноцепочечным молекулам, различающимся по своим размерам. Аффинная хроматография основана на том, что высокая степень специфичности может быть достигнута за счет гибридизации или химических взаимодействий между молекулами РНК, находящимися в растворе, и соответствующими соединениями, ковалентно связанными с твердым носителем. [c.176]

В ионообменной хроматографии целлюлозоиониты применяются либо в виде порошка, которым заполняют колонку, либо в виде сефадексов и химически сшитых агарозных гелей в тонкослойной хроматографии (см. гл. IV). [c.117]

Молекулярно-ситовая хроматография. При данном виде хроматографии используется способность материалов с контролируемой пористостью сортировать и разделять компоненты смеси в соответствии с размерами и формой их молекул. Для осуществления процесса гель-хроматографии используются гели поперечно-емкостного декстрана (сефадексы и сефакрилы), поперечно-сшитые полиакриламидные гранулы (биогели), агарозные гели с выраженными в них цепями акриламидного полимера (ультрагели) и более жесткие поперечно-сшитые агарозы (СЬ-агарозы и сефакрилы-8), с помощью которых можно быстро разделить макромолекулы в соответствии с их размером. Степень удерживания растворенного вещества на колонке зависит от его способности проникать в поры геля. Поэтому при гель-фильтрации сначала выходят высокомолекулярные вещества, а затем вешества в порядке убывания их моле- [c.55]

Применение поперечносшитых агарозных гелей в общем аналогично применению таких же гелей с водородными мостиками (см. разд. 29). Преимущества сшитых гелей, наиболее полно выявляются при использовании их для получения биоспецифических сорбентов для аффинной хроматографии (см. носители Affi-Gel, разд. 120). [c.62]

Агарозные гели с привитыми углеводородными радикалами (алкил- и фе-пил-агарозы) предложены недавно для хроматографического разделения и очистки белков на основе неспецифического взаимодействия с гидрофобной поверхностью ( гидрофобная хроматография — см. Йон, 1972 и Хофсти, 1973). Фенил-агароза наряду с гидрофобным взаимодействием проявляет специфичность к ароматическим веществам (наприМер к белкам с фениловыми и тирозиловыми группами) иа основе я-л взаимодействия ароматических остатков. Элюирование веществ при гидрофобной хроматографии достигается изменением ионного состава раствора, понижением его ионной силы или полярности (например посредством включения этиленгликоля в состав элюента) или с помощью детергентов. [c.209]

B для аффинной хроматографии антител типа IgG и антигенов. Белок А (мол. масса 42 ООО, выделен из Staphylo o us aureus) иммобилизован на поперечносшитом агарозном геле (см. разд. 30) бромциановым методом. Белок специфически взаимодействует с молекулами иммуноглобулинов IgG некоторых подтипов. Так как взаимодействие белка А с IgG не затрагивает у последних той части молекулы, посредством которой связываются антитела, возникает возможность выделения и очистки антигенов на БСС с адсорбированным IgG соответствующего типа. Элюирование комплекса антиген антитело выполняют с помощью 3 М раствора изотиоцианата калия. [c.227]

Плоскостной электрофорез имеет те же преимущества, что и плоскостная хроматография, т. е. позволяет на одной элект-рофореграмме сравнивать одновременно несколько образцов. Методом электрофореза можно, как и в двумерной бумажной или тонкослойной хроматографии, разделять вещества в двух направлениях, в частности в буферах с различным значением pH. Возможен и другой вариант, когда для разделения в двух взаимно перпендикулярных направлениях используют различные носители. Например, сначала проводят электрофорез в узкой полоске агарозного геля, в котором подвижность молекул определяется их зарядом, а затем — в пластинке агарозного геля, в котором вещества разделяются в соответствии с размерами их молекул. Способы качественного и количественного анализа электрофореграмм сходны с используемыми в бумажной и тонкослойной хроматографии. Белки можно обнаруживать также с помощью моноспецифических антител (иммунофиксация). [c.29]

При хроматографии полисахаридов и высших олигосахаридов предпочтительным является использование элюентов с высокой ионной силой для предотвращения ассоциации молекул хроматографируемых веществ и их взаимодействия с сорбентом. Данный прием приобретает особое значение в анализе молекулярно-массового распределения, при проведении которого рекомендуется в качестве элюента 0,3%-ный [124] или 0,9%-ный раствор Na I [125]. Однако наиболее широкое применение для этой цели находит 1М Na I [132, 170—173], использование которого для элюирования колонок с полиакриламидными и агарозными гелями обычно обеспечивает достаточную воспроизводимость хро.матографических данных. Полученные таким образом результаты можно использовать при анализе олигосахаридов, образующихся при избирательном расщеплении изучаемых полисахаридов [171—173]. [c.33]

Для выделения различных мембранных структур используется и аффинная хроматография. Принцип этого метода заключается в способности выделяемого вещества специфически связываться с лигандом, пришитым к нерастворимому носителю, при пропускании раствора через матрицу. В качестве последней применяют сефарозы (агарозные гели), активируемые путем связывания различных лигандов кофакторов, ингибиторов, субстратов мембранных белков-ферментов, лектинов в случае выделения гликопротеинов гормонов, бромциана, конканавалина А — соответственно при получении мембран, антител или целых клеток, Элюирование исследуемого вещества осуществляют в условиях диссоциации комплекса лиганд — вещество и сохранения нативной структуры выделяемого соединения. [c.221]

Определение М белка невозможно до тех пор, пока его молекулы не примут форму беспорядочного клубка. Для этого надо разрушить дисульфидные связи либо путем восстановления или окисления надмуравьиной кислотой, либо проведения сульфитолиза. Хроматографию можно проводить в 0,17о-ном водном растворе ДСН, но лучшие результаты получаются при использовании 6 М гидрохлорида гуанидина (Gu-H l). Влияние этих детергентов на разделение показано на рис. 6.6 и 6.7 [7—9]. При этом обнаруживается хорошая корреляция между значениями М и коэффициентами распределения белков /С/ . Детально изучались особенности работы колонок TSKSW 3000 и 4000 (фирмы Тоуо Soda) в 6 М Gu-H l [28]. Полученные при этом данные хорошо совпадали с результатами разделения в агарозных гелях [10]. Обычно не рекомендуется использовать Gu-H l [c.204]

Свойства суперозы 6В, агарозного геля для высокоэффективной аффинной хроматографии [c.18]

Трудно представить себе биохимика, который не пользовался бы распределительной гель-хроматографией для фракционирования смеси молекул по их размерам. На рис. 12.14 схематически изображена одна гранула геля из тех, что используются в молекулярных ситах. Удобные в употреблении молекулярные сита с большими размерами пор, такие как сефадекс (сшитые поперечными сшивками полидекстраны) и биогель (сшитый поперечными сшивками полиакриламид), всегда имеются в свободной продаже. Для препаративных целей используются также гранулы из пористого стекла и агарозные гели. Применение подобных материалов дало в руки исследователей действенное средство для разделения смеси молекул на фракции, в которых молекулы имеют приблизительно одинаковые размеры. [c.294]

Эти проблемы можно свести к минимуму при зональном электрофорезе, где (как и в методе зонального центрифугирования) макромолекулы присутствуют вначале лищь в очень тонком слое. Конвекцию можно подавить с помощью градиента плотности, но гораздо большее распространение получил электрофорез в твердотельном носителе, насыщенном буфером. Некоторые носители лишь слабо или неспецифически реагируют с ма-кромолекулярными компонентами раствора к ним относятся бумага, целлюлоза для тонкослойной хроматографии и ацетат целлюлозы. В других материалах при движении молекул происходит отставание молекул одних типов от молекул других типов к ним относятся полиакриламидные и агарозные гели (в которых происходит сортировка молекул по размерам) и бумажные ионообменники (в которых осуществляется избирательная задержка заряженных молекул). [c.302]

Мы определили общее содержание железа в крови 10 особей моллюсков М. mus osa каждую особь исследовали дважды с помощью колориметрического метода Фишера и Прайса (Fis her, Pri e, 1964). Оказалось, что концентрация железа варьирует в пределах от 42 до 113 мкг/мл. Сначала, пытаясь охарактеризовать состояние железа в крови, мы обнаружили, что фракционирование с помощью хроматографии в агарозном геле дает единственный содержащий железо пик, соответствующий молекуле белка определенной величины. Затем путем центрифугирования в градиенте плотности сахарозы мы установили, что компоненты этого пика обладают коэффициентами седиментации, колеблющимися в широком диапазоне (от 66 до 20S). Такие свойства [c.97]

Для начинающего исследователя гель-фильтрация открывает значительно меньше возможностей, чем ионообменная хроматография. До известного предела используемый буфер не должен влиять на достигаемую степень разрешения и единственная важная переменная — это тип материала, т. е. интервал эффективного фракционирования, для которого предназначен данный материал. Предположим, что в распоряжении исследователя имеются два-три поперечно-сшитых декстрановых или агарозных геля (сефакрил, ультрагель), с которыми легко работать, и сразу же возникает вопрос — какой гель выбрать и каковы должны быть размеры колонки. Образец наносится в небольшом объеме, поскольку объем каждого белкового компонента будет увеличиваться из-за обсуждавшихся выше эффектов, связанных с диффузией и иеидеальностью потока. Так как эффективный объем фракционирования составляет приблизительно половину объема колонки, четкость разделения обусловлена тем, что образец наносится в малом объеме, который не должен превышать 3% общего объема колонки. Если объем еще меньше (вплоть до 1% общего объема колонки), то разделение получается несколько лучше. При объемах ниже 1% диффузия и [c.206]

Нри электрофорезе и хроматографии разделение фрагментов ДНК основывается на их различии по размеру и нуклеотидному составу. Если размер генома невелик, то образуется относительно небольшое число хорошо разделяющихся фрагментов (см. рис. 4.10) их легко вьщелить, собрав нужные фракции элюата с хроматографической колонки или вырезав кусочки агарозного геля. Однако если расщепляется крупный геном, то хорошо отделяются лишь некоторые фрагменты. Чаще получается непрерывный набор фрагментов всевозможных размеров (рис. 6.1, А). Чтобы понять, в чем тут дело, проведем простой расчет. Типичный гаплоидный геном млекопитающих содержит примерно [c.277]

Свойства агарозы были рассмотрены в первой книге >той серии, посвященной электрофорезу [Остерман, 19811. Однако ввпду центральной роли, которую играют агарозные матрицы в иекотор .г хроматографических методах (гель-фнльтрация, аффинная хроматография), имеет смысл привести здесь некоторые данные еще раз. Как и [c.53]

Агарозные гранулированные гели применяют для выделения и фракционирования очень крупных молекул, в том числе вирусов, бактериофагов, субклеточных частиц (например рибосом), белков, нуклеопротеидов, нуклеиновых кислот, полисахаридов, Ог других мягких гелей агарозы отличает болёе широкие интервалы фракционирования. Агарозы используют также в качестве носителей иоспецифических сррбентов для аффинной хроматографии (см. разд. 120), [c.62]

Теория и методология гель-хроматографии подробно обсуждается в ряде обзоров и книг Г1—9]. Этот метод позволяет разделять белки в соответствии с размерами их молекул. Первыми с колонки элюнруются самые большие молекулы, в то время как молекулы меньшего размера, способные диффундировать в поры матрицы, заполненные жидкой фазой, удерживаются на колонке. Размер пор матрицы геля определяет диапазон молекулярных масс макромолекул, способных проникать в частицы геля и выходить из них. Для фракционирования белков пригодны различные полиакриламидные, агарозные и декстрановые гели. [c.106]

В качестве матрицы в аффинной хроматографии наиболее широко используется агароза. Это очиш,енный линейный содержащий галактозу (рис. 1) аэрогель-ксерогелевый коллоид, выделяемый или из агара или непосредственно из содержащих агар морских водорослей. Агароза характеризуется хорошей гелеобразующей способностью она относительно биологически инертна и поэтому удобна в качестве носителей не только для аффинной хроматографии, но также и для гель-фильтрации. Агар и агароза — не синонимы, и различные агарозные препараты также могут значительно отличаться друг от друга по своим физико-химическим свойствам. Некоторые агарсодержащие морские водоросли приведены в табл. 1. [c.11]

Супероза 6В — агарозная матрица с высокой степенью сшивки, образующая очень жесткий гель. Эффективность этой матрицы в качестве носителя для адсорбентов, используемых для разделения в условиях высокоэффективной хроматографии, обусловлена наличием поперечных сшивок, а также однородностью частиц по размеру (который характеризуется узким интервалом 20—40 мкм). По данным фирмы-производителя (РЬагтас1а) в колонке (1,6X60 см) при скорости тока 0,3 мл/мин создается, как правило, обратное давление менее [c.18]

Следует подчеркнуть, что большинство препаратов иммуноглобулина определенного класса обычно содержит примеси Ig других классов, за исключением IgG, выделенных хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе, и IgM, выходящих в первом пике при хроматографии на сефадексе G-200. Поэтому рекомендуется проводить рехроматографию полученных препаратов на той же колонке и в тех же условиях, либо использовать какую-то иную процедуру, например электрофорез в агарозном блоке или гель-фильтрацию. Для той же цели можно применить и аффинную хроматографию на сефарозе с класс-специфической антисывороткой. Миеломные белки классов G, А и М и парапротеины при макроглобулинемии Вальденстрёма удается очистить одноэтапной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе или зональным электрофорезом, поскольку они являются основным компонентом сыворотки. Чистоту каждой фракции иммуноглобулинов исследуют с помощью иммуноэлектрофореза, двойной иммунодиффузии или радиоиммунным методом с класс- или подкласс-специфическими антисывороткамн. Чистые белки хранят при 4°С в присутствии 0,02% NaNs или замораживают растворы с концентрацией 10— 30 мг/мл. [c.72]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология