Элюирование детергентами

Подготовка ДЭАЭ-целлюлозы для хроматографии в С1 "-форме производится так же, как указано выше, но уравновешивание колонки, растворение фракционируемого материала и элюирование осуществляют буферными растворами, содержащими 8М мочевину. В качестве стартового буферного раствора в данном случае используют буферный раствор трис-НС pH 8, содержащий 0,05 М С1 и 8 М мочевины. Чтобы предотвратить агрегацию и ассоциацию молекул фракционируемого материала в присутствии мочевины, к буферному раствору добавляют 0,1% додецилсульфата натрия. В полученном растворе, содержащем оба детергента (мочевину и додецил-сульфат натрия), растворяют фракционируемый материал, который диализуют против того же раствора в течение 24 ч. [c.207]

Анионообменная хроматография используется, в частности, для скоростного анализа фосфатов в детергентах. С помощью этого метода орто- и пирофосфаты и другие их производные могут быть разделены и определены количественно на смоле дауэкс 1-Х8 [13]. Катионообменная хроматография широко используется для разделения щелочных металлов элюированием их водными смесями НС1 и этанола [14]. [c.231]

Хлороформ — пропанол Выделен активный детергент. Поря- [183] этанол — ода док элюирования обратен по отно- [c.435]

Особый вид аффинной хроматографии включает использование гидрофобных взаимодействий между доступными гидрофобными центрами белка и гидрофобными лигандами на носителе [31—34]. В этом случае десорбция происходит при уменьшении ионной силы и увеличении pH или при элюировании растворами этиленгликоля и детергентов. [c.110]

VII. Специальные случаи. Иногда особенности взаимодействия антигена с антителом позволяют проводить элюирование в очень мягких условиях. Например, описан образец МКА к антигену Н-2, связывающих его в колонке в присутствии неионного детергента при этом можно было проводить элюирование дезоксихолатом, хотя последний обычно не связывается с не- [c.178]

После экспериментов, включающих элюирование детергентами, фирма Pharma ia рекомендует проводить следующую процедуру промывки для регенерации сорбентов, используемых в гидрофобной хроматографии (объемы соответствуют объему колонки) [c.279]

Разделены масляная, пропноновая, [27] уксусная, пировиноградная и муравьиная кислоты (в порядке элюирования), по 0,5—5 мг Разделены масляная, пропионовая, [83] уксусная, пировиноградная и муравьиная кислоты (в порядке элюирования). Детергенты, элюирующиеся с муравьиной кислотой, можно отделить при последующем элюировании этой фракции 15%-ным раствором бутанола в СНС1з Впервые достигнута чувствительность [73, 77] до 10- % кроме перечисленных выше кислот выделен еще ряд соединений [c.409]

Биохимическая характеристика [12]. -адренэргического рецептора (Pi), как и никотинового ацетилхолинового рецептора, оказалась возможной благодаря двум счастливым открытиям. Так, обнаружилось, что эритроциты птиц являются богатым исходным хматериалом этих рецепторов и что детергент дигитонин растворяет рецептор, не дезактивируя его. Эритроциты индюка содержат 0,2 пмолей -рецептора/мг мембранного белка ме-тодом аффинной хроматографии яе только можно очистить его в 12 ООО раз, но и (как ясно показывает кривая элюирования на рис. 9.10, а) отличить от аденилатциклазы, которая не является составной частью рецептора, а представляет собой отдельную субъединицу. Ранее аналогично был выделен аффинной хроматографией GTP-связывающий компонент. [c.271]

На рис 3-24 приведена хроматограмма многоядерных ароматических углеводородов, полученная при их разделении на колонке с динамически модифицированным силикагелем в режиме градиентного элюирования В качестве детергента использовался бромид цетнлтриметнламмония (цетримид) Характеристики колонок с силикагелем, динамически модифицированных цетримидом, аналогичны характеристикам колонок с химически привитым октадецилсиланом [c.73]

При элюировании в градиенте концентрации буфера и при изменении концентрации детергента в элюенте на объем капли влияет изменение плотности и поверхностного натяжения элюата. При необходимости в этом случае следует вводить определенную поправку. Некоторые модели коллекторов снабжены микропереключателем, подающим электрический импульс при достижении заданного числа фракций. Этот сигнал используют для смены элюента или изменения температуры в колонке. В случае необходимости такое устройство можно изготовить в лаборатории. Переключатель устанавливают на корпусе коллектора под фотоячейкой для отсчета капель. Он включается при помощи штырька, закрепленного на соответствующей пробирке. [c.312]

Этот метод заключается в постепенном осаждении белков на колонке с инертным носителем и последующем элюировании отдельных фракций подходящим элюентом. Отдельные белки существенно различаются по растворимости, которая может варьировать в широких пределах в зависимости от концентрации солей, детергентов и органических растворителей. Метод разделения, основанный на постепенном элюировании белков подходящим элюентом, в сущности является антиподом дробного осаждения, также применяющегося для разделения белков. В отличие от эксперимента в статических условиях элюирование в колонке дает более высокое разрешение, поскольку в плавном градиенте удается создать оптимальную концентрацию, достаточную для элюирования и в то же время препятствующую закупорке колонки осадком белка. Кайл с сотр. [68] разработали метод разделения, основанный на различной растворимости белков в растворах сульфата аммония, получивший название колоночная градиентная экстракция белков. Вначале белки переводят в осадок в виде слоев (или зон) на кизельгуре (Hyflo Super el) с возрастающей концентрацией сульфата аммония. Затем носитель с зоной выпавшего в осадок белка переносят в колонку и промывают все более разбавленными растворами сульфата аммония. По мере снижения концентрации соли белки постепенно растворяются и вымываются из колонки. Эффективность метода была продемонстрирована на ряде примеров. На рис. 35.4 приводится разделение белков сыворотки лошади. [c.451]

Однако наиболее важным и самым распространенным методом выделения и анализа ферментов является хроматография. Об этом можно судить по множеству публикаций и специальных обзоров, посвященных различным аспектам хроматографии ферментов. (См. обзор по колоночной хроматографии [20 и табл. 36.1.) В последние годы получили дальнейшее развитие новые высоко избиратетгьные методы выделения, такие, как аффинная хроматография [21—26 и гл. 7, 14], хроматография на гидроксиапатите [27 и гл. 35], хроматография на геле фосфата кальция [28 и гл. 35], гель-хроматография в градиенте детергента как метод очистки мембраносвязанных ферментов [29, 30], гель-проникающая хроматография [31 и гл. 5, 12], электрохроматог-рафические методы [11], ионообменная хроматография [32, 33 и гл. 6, 13], субетрат-специфичное элюирование [34]. [c.9]

Агарозные гели с привитыми углеводородными радикалами (алкил- и фе-пил-агарозы) предложены недавно для хроматографического разделения и очистки белков на основе неспецифического взаимодействия с гидрофобной поверхностью ( гидрофобная хроматография — см. Йон, 1972 и Хофсти, 1973). Фенил-агароза наряду с гидрофобным взаимодействием проявляет специфичность к ароматическим веществам (наприМер к белкам с фениловыми и тирозиловыми группами) иа основе я-л взаимодействия ароматических остатков. Элюирование веществ при гидрофобной хроматографии достигается изменением ионного состава раствора, понижением его ионной силы или полярности (например посредством включения этиленгликоля в состав элюента) или с помощью детергентов. [c.209]

Последующее развитие ионообменной методики связано с применением автоматических устройств, описанных Лундгреном и Лёбом 136 ]. Метод, рекомендованный для производственных анализов смесей конденсированных фосфатов в составе детергентов, основан на градиентном элюировании и непрерывном анализе элюата с помощью автоанализатора. Прибор программируется для проведения кислотного расщепления полифосфатов, присутствующих в элюате. Образующийся при этом ортофосфат выделяется путем диализа и взаимодействует с молибдатом аммония. Фосфорномолибденовая кислота восстанавливается гидразинсульфатом голубая окраска восстановленного раствора используется для непрерывных колориметрических измерений, результаты которых регистрируются автоматически. Прибор калибруется с помощью смесей известного состава. Образцы, содержащие только орто-, пиро- и три(поли)фос-фат, могут быть проанализированы в течение 1 ч. В присутствии триметафосфата для анализа требуется обычно 2 ч. Точность метода 3% от количества основного компонента. Для компонентов, присутствующих в меньших количествах, точность определения несколько ниже. [c.394]

По разработанным ранее рецептурам в буферные растворы рекомендовалось добавлять детергент типа Brij-35, способствующий растворению газов в колонке. Однако при его добавлении несколько ухудшалось разделение (например, пары глицин — аланин) в результате изменения скорости элюирования некоторых аминокислот. Замена молотых и порошкообразных смол [c.52]

В методе ТСХ имеются свои трудности и ограничения. Одного этого метода недостаточно для полной и точной идентификации органических веществ-загрязнителей, экстрагируемых из водных истем. ТСХ следует использовать в сочетанииХС некоторыми другими аналитическими методами. Невозможно разработать простую и универсальную методику для выделения и разделения, например, всех классов органических пестицидов. Более того, подчас возникают трудности при разделении смеси пестицида и продуктов его разложения. То же можно сказать о фенолах, детергентах и т. д. В связи со значительной разницей в полярностях индивидуальных соединений использование однокомпонентных элюентов для ТСХ-разделения крайне нежелательно. Чтобы подобрать оптимальные условия разделения применительно к конкрет ной системе, необходимы предварительные опыты. Для каждой рассматриваемой системы следует определять Rf. При анализе следов веществ часто возникают ошибки, связанные с недостаточно высокой техникой эксперимента. Бевеню с сотр. [36] успешно исследовали многие проблемы, возникающие при проведении лабораторных анализов проб воды. Исследователи имели дело в основном с органическими пестицидами, но полученные ими результаты можно распространить на другие вещества-загрязнители. Первая проблема связана с размером пробы. Если экстрагируют небольшую быстро отобранную пробу объемом до 3,8 л, то из-за малого количества выделяемого вещества-загрязнителя становится невозможным детектирование с помощью проявляющего реагента, поскольку опрыскивание обычно дает результаты для микрограммовых количеств. Вторая проблема связана с удалением зоны вещества с подложки и элюированием вещества растворителем для последующего газохроматографического анализа. Посторонние помехи ( шумы ) усиливаются на диаграмме регистратора, если не принять специальных мер по полной очистке от органических загрязнений растворителей, стеклянной посуды и другого оборудования, а также ТСХ-адсорбентов. Так, органические растворители с маркировкой чистые нельзя использовать для анализа следов пестицидов, присутствующих в нанограммовых или пикограммовых количествах. Эти растворители перед использованием необходимо дважды перегонять в системе из стекла. [c.500]

Как правило, выделение и очистку мембранных белков проводят в присутствии детергентов. Присутствие дигитоннна или додецилсульфата натрия в небольших концентрациях не влияет на эффективность аффинной хроматографии. Однако в каждом конкретном случае необходимо учитывать влияние детергента на процесс сорбции, элюирования и особенно на метод определения биологической активности, применяемый до нанесения образца на колонку. Использование буферных растворов, не содержащих детергентов, может привести к неспецифической сорбции белка на сорбенте вследствие его агрегации, что существенно повлияет на степень очистки. [c.185]

При проведении аффинного элюирования необходимо учитывать некоторые аспекты взаимодействия лиганд — макромолекула. Увеличение концентрации соли может значительно уменьшить биоспецифическое взаимодействие, но может также ослабить последующее взаимодействие со свободным лигандом при аффинном элюировании. Увеличение концентрации соли уменьшает неспецифические ионные взаимодействия, но может также усиливать гидрофобные взаимодействия, особенно при наличии на сорбенте полиметиленовых вставок. Если важную роль при связывании играют гидрофобные взаимодействия, то более эффективным может быть уменьшение концентрации соли. Кроме того, можно использовать изменение pH или введение агентов, уменьшающих поверхностное натяжение (для ослабления гидрофобных и вандерваальсовых взаимодействий). В качестве последних могут применяться неионный детергент, такой, как тритон Х-100 до 1%-ной (об./об.) концентрации в буфере, зтиленгликоль [10—50% (об./об.)] или относительно небольшие количества этанола [до 5% (об./об.)]. Маловероятно, чтобы эти вещества могли вызывать изменения константы ассоциации с заряженными лигандами. После предварительного уравновешивания колонки указанным буфером в него вводят лиганд для аффинного элюирования. Очевидно, могут быть использованы также аллостерические модифицирующие агенты или ингибиторы взаимодействия лиганд — макромолекула, причем приведенное выше обсуждение по применению свободного лиганда полностью относится и к указанным агентам. [c.114]

Систематические исследования по оптимизации элюирования белков с алкил-агароз выявили множество факторов, влияющих на элюирование были найдены агенты, понижающие полярность, специфические деформаторы , мягкие детергенты кроме того, изучалось влияние концентрации денатурирующих веществ, изменения pH, температуры, ионной силы и состава буфера. Поскольку доступность гидрофобных положений на поверхности белка обусловлена, по-видимому, его конформацией, а удерживание белков на алкилагарозах зависит в основном от липофильности, размера, формы и локализации этих положений, то способы элюирования, описанные выше, могут приводить либо к непосредственному разрушению гидрофобных взаимодействий между адсорбентом и белком, либо к изменению конформации белка, либо к комбинации обоих эффектов. [c.183]

Для элюирования антигенов клеточной поверхности мы в нашей практике обычно используем 50 мМ H I-диэтиламиновый буфер, pH 11,5, содержащий 0,5% дезоксихолата, и сразу же после элюирования нейтрализуем элюат глицином. Затем определяем поглощение при 280 нм и измеряем антигенную активность препарата. Выход препарата обычно составляет около 50% от количества антигена, нанесенного на колонку. Фракции элюата концентрируем ультрафильтрацией и, если необходимо, освобождаем от дезоксихолата с помощью диализа. Однажды при очистке Т-лимфоцитарного антигена, названного MR ОХ-34, мы не смогли определить в элюате ни антигенной активности, ни даже поглощения при 280 нм. При этом в экстракте, элюированном с колонки после нанесения антигена, антигенной активности тоже не было. Мы попробовали провести элюцию 0,5 М пропионовой кислотой без детергента и добились успеха, причем с хорошим выходом антигенной активности (А. F. Williams, неопубликованные данные). То же самое было в случае с крысиным антигеном D4(W3/25). Элюирование щелочным буфером дало неудовлетворительные результаты, но пригодным оказался 0,1 М H l-глициновый буфер, pH 2,5 [30]. При этом с колонки элюировался белок с нужной мол. массой,, однако его антигенная активность частично была потеряна. Критериями очистки в данном случае служил сам факт утраты антигенной активности исходного экстракта после нанесения на колонку, а также элюирование из нее белка с известной мол. массой. [c.179]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология