Детергенты градиенты

Этот метод заключается в постепенном осаждении белков на колонке с инертным носителем и последующем элюировании отдельных фракций подходящим элюентом. Отдельные белки существенно различаются по растворимости, которая может варьировать в широких пределах в зависимости от концентрации солей, детергентов и органических растворителей. Метод разделения, основанный на постепенном элюировании белков подходящим элюентом, в сущности является антиподом дробного осаждения, также применяющегося для разделения белков. В отличие от эксперимента в статических условиях элюирование в колонке дает более высокое разрешение, поскольку в плавном градиенте удается создать оптимальную концентрацию, достаточную для элюирования и в то же время препятствующую закупорке колонки осадком белка. Кайл с сотр. [68] разработали метод разделения, основанный на различной растворимости белков в растворах сульфата аммония, получивший название колоночная градиентная экстракция белков. Вначале белки переводят в осадок в виде слоев (или зон) на кизельгуре (Hyflo Super el) с возрастающей концентрацией сульфата аммония. Затем носитель с зоной выпавшего в осадок белка переносят в колонку и промывают все более разбавленными растворами сульфата аммония. По мере снижения концентрации соли белки постепенно растворяются и вымываются из колонки. Эффективность метода была продемонстрирована на ряде примеров. На рис. 35.4 приводится разделение белков сыворотки лошади. [c.451]

Методы выделения РНК (обзоры — см. в общем, довольно близки к методам выделения ДНК. Экстракцию клеток или субклеточных частиц для получения РНК проводят обычно фенолом остаточный белок часто удаляют обработкой детергентом или смесью хлороформа с октиловым спиртом. Отделение ДНК от РНК происходит обычно на стадии экстракции, так как можно подобрать условия, в которых РНК переходит в водный слой, а ДНК остается в интерфазе. Часто применяют для этой цели фракционное осаждение, реже — обработку препарата ДНК-азой. Различные типы клеточной РНК могут быть разделены фракционным осаждением, центрифугированием в градиенте плотности сахарозы методами хроматографии и электрофореза в геле [c.36]

Мочевину можно использовать в высокой концентрации (вплоть до 9 М). Она должна быть надежно очищена и деионизована с помощью бифункциональной ионообменной смолы. Неионные детергенты вводят в концентрации 1—3%. Будучи незаряженными, все эти добавки в первом приближении не сказываются на процессе образования градиента pH. Результирующая картина ИЭФ смеси белков при этом нередко заметно упрощается за счет исключения конфигурационной изомерии, приводящей к различной степени экранирования ионогенных групп белков и расщеплению их зон при фокусировании (см. выше). Чувствительность метода соответственно повышается. [c.24]

Длина волны, нм мембран хлоропластов с помощью детергентов (поверхностноактивных веществ, диссоциирующих гидрофобные связи), дифференциального центрифугирования в градиенте плотности сахарозы и других приемов удалось выделить и изучить белковые комплексы фотосистемы I (ФСI) и фотосистемы II (ФС II). [c.80]

Таким образом, необходимым условием взаимодействия искусственных мембран является локальное увеличение текучести бислоя. Все факторы увеличения текучести бислоя (внутримембранное поле, детергенты, осмотический градиент, температура, липидный состав, поверхностный заряд, механическое напряжение, углеводороды, двухвалентные ионы, ионный состав среды и др.) в той или иной мере могут оказывать влияние и на мембранное взаимодействие в системах искусственных мембран, содержащих популяции клеточных мембран или смесь последних с искусственными. [c.141]

Для очистки мембранной D-лактатдегидрогеназы Е. соИ хроматографией на оксиапатите [Pratt et al., 1979] был использован пологий линейный градиент концентрации (0—0,2 М) К-фосфатного буфера, pH 7,2 (500 мл для колонки размером 2,6 X 20 см). Растворимость белка обеспечивали включением в состав буфера детергентов (1% Тритона Х-100 и 0,1% ДДС-Na). Очистке на оксиапатите предшествовали освобождение фермента из ме.мбрин с помощью дезоксихолата натрия, хроматография на DE-52 и гель-фильтрация на сефадексе G-200. На всех хроматографических этапах очистки в составе элюентов тоже присутствовали детергенты. [c.234]

Методы с использованием хлористого цезия требуют существенных материальных затрат, но позволяют получить высокоочищенный вирус и работать с большими объемами образцов как в случае преформированного, так и формирующегося по ходу центрифугирования градиента. Использование ДДС-Na в качестве детергента не рекомендуется, так как додецилсульфат цезия нерастворим. Существенный недостаток градиентов хлористого цезия помимо высокой стоимости этой соли состоит в том, что в них может происходить модификация вирусов. В частности, имеются данные, что риновирусы могут поглощать ионы цезия и в результате приобретать аномально высокую плотность (1,4 г/мл вместо 1,34 г/мл, обычной для пикорнавирусов) [19]. Аналогичное явление описано и для полиовируса. [c.62]

Наряду с КЗЭ, при котором удается осуществить разделение только за счет разницы в подвижности, и который в настоящее время представляет собой наиболее распространенный метод, выделяют также капиллярный гель электрофорез (КГЭ) с капилляром, заполненным гелем. При этом на электрофоретическую миграцию молекул оказывает влияние матрица геля, и поэтому достигается селективное разделение молекул по размерам. Незаряженные молекулы можно разделять с помощью мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ). В данном случае к буферу добавляется детергент, и нейтральные молекулы распределяются между буфером и мицеллами в соответствии с их гидрофобностью. Разделение основано на подвижности мицелл, заряженных в большинстве случаев отрицательно. Поскольку в основе разделения лежит процесс распределения, можно с полным основанием говорить о хроматографическом методе. При изоэлектрической фокусировке (ИЭФ) происходит разделение в градиенте pH, формируемом добавлением амфолита к буферу в электрическом поле. Небольшое распространение получила пока электрохроматография (ЭХ), при которой применяется стационарная среда ВЭЖХ, а течение эдюента и перенос пробы происходит только за счет электроосмотического потока. В качестве самой старой капиллярной техники следует упомянуть изотахофорез (ИТФ), который в настоящее время вновь приобрел значение для концентрирования проб в КЭ. [c.7]

При элюировании в градиенте концентрации буфера и при изменении концентрации детергента в элюенте на объем капли влияет изменение плотности и поверхностного натяжения элюата. При необходимости в этом случае следует вводить определенную поправку. Некоторые модели коллекторов снабжены микропереключателем, подающим электрический импульс при достижении заданного числа фракций. Этот сигнал используют для смены элюента или изменения температуры в колонке. В случае необходимости такое устройство можно изготовить в лаборатории. Переключатель устанавливают на корпусе коллектора под фотоячейкой для отсчета капель. Он включается при помощи штырька, закрепленного на соответствующей пробирке. [c.312]

VIII. Гель-проникающая хроматография в градиенте детергента [c.452]

Однако наиболее важным и самым распространенным методом выделения и анализа ферментов является хроматография. Об этом можно судить по множеству публикаций и специальных обзоров, посвященных различным аспектам хроматографии ферментов. (См. обзор по колоночной хроматографии [20 и табл. 36.1.) В последние годы получили дальнейшее развитие новые высоко избиратетгьные методы выделения, такие, как аффинная хроматография [21—26 и гл. 7, 14], хроматография на гидроксиапатите [27 и гл. 35], хроматография на геле фосфата кальция [28 и гл. 35], гель-хроматография в градиенте детергента как метод очистки мембраносвязанных ферментов [29, 30], гель-проникающая хроматография [31 и гл. 5, 12], электрохроматог-рафические методы [11], ионообменная хроматография [32, 33 и гл. 6, 13], субетрат-специфичное элюирование [34]. [c.9]

Модификация метода Лоури, делающая его пригодным для измерения белка в пробах, содержащих сахарозу или ЭДТА, а также в препаратах мембран и липо-протеинов, описана Марквеллом и др. [91]. Эта методика основана на применении детергента (додецилсульфата натрия, ДСН) в составе щелочного карбонатного реактива для увеличения солюбилизации липоидных веществ и на использовании повышенного количества тартрата меди для предотвращения помех за счет сахарозы и ЭДТА. Методика применима в нескольких случаях, в том числе при определении белков во фракциях из сахарозных градиентов. [c.358]

Вполне понятно, что легкие и тяжелые фрагменты не представляют собой чистые фотосистемы I и II, а лишь в той или иной мере обогащены ими, чем и объясняется смешанный характер спектров флуоресценции (рис. 17). Вслед за Бордма-ном фрагменты хлоропластов, обогащенные фотосистемами I и II, были получены рядом авторов (Вернон, Митчел, Шлык и др.). Они использовали для дезинтеграции хлоропластов не только дигитонин, но и другие детергенты (тритон Х-100, додецилсульфат натрия), ультразвук, а также простое механическое раздробление хлоропластов. Затем фрагменты разделялись методами гельэлектрофореза или ультрацентрифугирования в градиенте плотности. [c.77]

Кристаллизация мембранных белков может быть реализована в том случае, когда белок удается очистить до гомогенного состояния без солюбилизации содержащих его мембран в детергентах. Именно к таким белкам относится Ыа" , К+-АТРаза наружного мозгового слоя почек млекопитающих, в частности свиньи. Этот фермент, являющийся натриевым насосом клетки и обеспечивающий создание трансмембранного градиента концентраций ионов натрия и калия, состоит из двух типов субъединиц а и (3, присутствующих в эквимолярных коли- [c.175]

Некоторые белки имеют тенденцию выпадать в осадок при величинах pH, равных их изоэлектрическим точкам, особенно если на колонку. с градиентом плотности нанесены большие количества белка. Оседающий бело может перемешать слои, расположенные ниже уровня его образования. Поэтому в тех случаях, когда заранее. известно, что определенные компоненты белковой смеси выпадут в осадок, электроды следует расположить таким образом, чтобы изоэлектрическая точка белка с наименьшей растворимостью была ниже изоэлектрических точек других изучаемых белков. Иногда осаждение белков можно предотвратить добавлением таких веществ, как мочевина в концентрации 2—8 М [128, 627, 1183] или неионные детергенты (твии 80, эмасол, бри 39, тритон Х-100) в концентрации 0,1—0,5% [886, 1343, 1344]. [c.133]

Если требуются более чистые препараты ДНК, то раствор-нуклеиновой кислоты после повторного растворения можно очистить в градиенте плотности s l/БЭ (приложение 4[И]). В разд. 4.2.3.1 приведен метод выделения небольших количеств ДНК из лиофилизированных тканей, а процедура крупномасштабного выделения описана в приложении 4[1]. Лишь при выделении ДНК из некоторых лиофилизированных тканей (например, листьев злаков) метод, основанный на использовании СТАВ, оказался не совсем удачным. В разд. 4,2.3.2 приведен другой метод, основанный на обработке содержимого клеток, разрушенных протеиназой в присутствии детергента (доде-цилсульфата натрия, ДСН), и последующем концентрировании ДНК путем осаждения спиртом. При этом обработка нуклеиновых кислот более мягкая, на всех стадиях удается избежать их чрезмерной деградации, и, таким образом, полученные препараты ДНК обладают довольно большой мол. массой (>100 т.п.н.), что вполне подходит для клонирования генома.. [c.240]

Ha рис. 12.7 представлены типичные результаты измерений упруговязкой релаксации ДНК. Обратите внимание на чрезвычайно большие времена релаксации молекул, массы которых составляют 10 и более а.е.м. Отличное согласие с экспериментом, полученное для ДНК с известными молекулярными массами, показывает, что формула (12.34) правильна. Данный метод с успехом использовали для определения молекулярных масс ДНК вплоть до зничений, близких к Ю . Гигантские молекулы ДНК с такой молекулярной массой (примером которых могут служить молекулы, выделенные из целых развернутых хромосом бактерий или эукариот) настолько непрочны, что их невозможно даже переместить из одного сосуда в другой. Для того чтобы их исследовать, необходимо клетки, содержащие такую ДНК, подвергнуть лизису непосредственно в ротационном вискозиметре и освободить ДНК in situ от связанных с ней белков посредством обработки детергентами и ферментативного расщепления. Для смешивания этих реагентов с клеточным лизатом можно использовать только конвекцию, поскольку любое перемешивание недопустимо. Естественно, приходится ограничиваться очень малыми скоростями ротора, чтобы уменьшить вероятность разрыва молекулы в градиенте скорости. Угол, на который повернется ротор за промежуток времени между включением вращающего момента и началом процесса релаксации, должен быть минимальным это всегда менее одного оборота. [c.282]

В условиях стабильного функционирования фотосинтетического аппарата быстрой деградации белка D1 должен сопутствовать такой же интенсивный его синтез (Gaba et a . 1987). Процесс присоединения вновь синтезированного белка D1 к комплексу ФСИ можно отслеживать, используя ради-активно меченный S-метионин, который добавляется в систему трансляции белка D1 in vitro, в результате чего он включается в состав этого протеина. Затем проводится анализ включения этого радиоактивно-меченного белка в различные формы комплекса ФСИ, полученные при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы тилакоидных мембран, предварительно солюбилизированных слабым детергентом />додецил /5-0-мальтозидом. [c.139]

Для выяснения специфичности фосфолипидов в поддержании АТФазной активности был использован метод замещения эндогенных липидных компонентов саркоплазматического ретикулума в ходе центрифугирования обработанных детергентом везикул в градиенте плотности сахарозы (G, В. Warren et al,, 1974), Ответ был однозначным фосфолипидное окружение АТФазы не оказывает специфического воздействия на АТФ-гидролитическую функцию. Для сохранения активности фермента требуется лишь, чтобы с ним было ассоциировано не менее 30 молекул фосфолипидов. Более того, почти все эти фосфолипидные молекулы без ущерба для функции могут быть замещены неионным детергентом (W. Dean, С, Tanford, 1977). [c.55]

Липосомы, полученные после удаления детергента из липидно-белкового раствора, очищают с использованием центрифугирования в градиенте сахарозы (Helenius et al., 1977). При этом [c.156]

Однако Уиллард и соавторы утверждают, что полного растворения основных белков (из гепатомы Новикова) не удается добиться с помощью мочевины, NP-40, умеренных концентраций ДДС-Na, а также с помощью цетавлона и ряда других детергентов катионной природы. Решить проблему растворения и фракционирования основных белков в системе формирующегося градиента pH удалось путем использования в качестве детергента 0,5%-ного раствора дипальмитоил-Ь-а-фосфатндилхолнна в сочетании с 9,5 М мочевиной [Willard et al., 1979]. [c.56]

При просчете фракций после центрифугирования в градиенте плотности раствора s l в толуол-тритоновом сцинтилляторе аликвоты следует разбавлять водой по крайней мере в отношении 2 1, причем объем разбавленного раствора не должен превышать 1 мл на 10 мл сцинтиллятора. Это связано с тем, что очень высокая концентрация соли мешает воде взаимодействовать с детергентом, поэтому раствор оказывается нестабильным. По той же причине насыщенные растворы сульфата аммония для просчета радиоактивности надо разбавлять в 10 раз ( ). Как уже упоминалось, 20—30%-ный раствор сахарозы, в зависимости от используемого сцинтиллятора, иногда тоже приходится разбавлять водой. [c.209]

Такие дефекты в структуре ПЛМ можно индуцировать различными факторами. Кроме влияния внутримембраино-го поля липосом структуру ПЛМ изменяют (и применяются в изучении процессов слияния) лизоЛипиды в виде ультразвуковой суспензии, детергенты, органические растворители, полиэтиленгликоль (ПЭГ, кстати, все чаще используется вместо вируса Сендай в процессах слияния клеток), оказывающий дегидратирующее воздействие на мембранные структуры, осмотический градиент. Существенными в процессах слияния являются факторы, изменяющие фазовое состояние липидов (уменьшение текучести бислоя препятствует, а увеличение — способствует слиянию), морфо- логия и размеры липосом, механическое напряжение в монослоях бислойной структуры, толщина и дипольный скачок лотенциала мембраны. [c.140]

Несколько типов субмитохондриальных препаратов сослужили службу в изучении функции митохондрий. Разрыв наружной мембраны может быть осуществлен посредством осмотического шока или обработки фосфолипазой. Таким образом, освобождается для исследования межмембранная жидкость. Более плотная, чем наружная, внутренняя мембрана и ограничиваемый ею матрикс могут быть отделены с помощью центрифугирования в градиенте плотности Внутреннюю мембрану удается разорвать при ее обработке такими детергентами, как дигитонин или дезоксихолат. В результате освобождаются составляющие матрикса, например ферменты цикла лимонной кислоты, а также удаляется большая часть цитохрома с и солюбилизируются различные компоненты мембраны. Если мембрана на короткое время подвергается воздействию ультразвуковых колебаний, получаются субмитохондри-альные частицы, изображенные ниже. Это пузырьки, имеющие вывернутую наизнанку по отношению к внутренней мембране пн-тактных митохондрий конфигурацию. [c.419]

При освещении АрН между тилакоидным компартментом и стромой составляет около 3—3,5 единиц и может быть измерено по поглощению слабого основания. Изменения pH в суспензии тилакоидов при смене света и темноты настолько значительны, что их можно без труда зарегистрировать обычным стеклянным электродом. В слабозабуференкой реакционной с1меси, содержащей 50 мкг Хл на 1 мл, при облучении светом, интенсивиость которого близка к насыщающей, быстро обнаруживается сдвиг pH на 0,2—0,3 единицы. При затемнении наблюдается медленный возврат рИ к величине, близкой к начальной, и эти подъемы и падения pH в ответ иа смену света и темноты могут продолжаться сколь угодно долго. Величина сдвига pH является функцией транспорта электронов. Ее можно увеличить, добавив кофакторы, которые усиливают транспорт электронов без прямого (вследствие восстановления) воздействия на pH. По мере уменьшения освещенности pH среды становится более кислым и возвращается к исходной величине при повторном включении полного света. Обработка детергентами и другие воздействия, в результате которых, как полагают, мембрана становится более проницаемой для протонов (и поэтому, по-видимому, ускоряется обратный поток), в большинстве случаев уменьшают сдвиг pH. Тот факт, что pH при освещении ие возрастает до бесконечности, а быстро достигает насыщения, говорит об усилении обратного потока протонов через мембрану по мере увеличения их концентрации с внутренней стороны. Обратное давление, обусловленное увеличением концентрации протонов с одной стороны мембраны, будет подавлять транспорт электронов, т. е. высвобождение протонов в среду с высокой их концентрацией (внутри) или изъятие из среды с низкой концентрацией (снаружи) будет затруднено. Усиление потока электронов под действием разобщителей является ответной реакцией на уменьшение обратного давления при снижении протонного градиента. [c.99]

Фотосистемы I и II различаются по своей структуре. При обработке мембран тилакоидов детергентами освобождаются преимущественно частицы, содержащие фотосистему I. Методом центрифугирования в градиенте плотности можно разделить частицы, обладающие только активностью фотосистемы I, и частицы, обогащенные активностью фотосистемы II. Большинство молекул хлорофилла связано со специфическими белками. Из частиц, содержащих фотосистему I, выделен комплекс, состоящий из 14 молекул хлорофилла а, связанных с белком 110 кДа. Второй вид комплекса, образованный частицами фотосистемы II, содержит 3 молекулы хлорофилла а и 3 молекулы хлорофилла Ь, связанные с белком 28 кДа. Наиболее хорошо охарактеризованный хлорофилл-белковый комплекс, выделенный из зеленых бактерий, состоит из трех субъединиц 50 кДа, каждая из которых содержит семь молекул бактериохлорофил-ла (рис. 19.11). Одна из функций белка в этих комплексах заключается в поддержании оптимальной геометрии для переноса энергии между хлорофиллами. [c.188]

Смотреть страницы где упоминается термин Детергенты градиенты: [c.119] [c.187] [c.216] [c.367] [c.453] [c.278] [c.32] [c.29] [c.132] [c.240] [c.124] [c.225] [c.185] [c.49] [c.259] [c.284] [c.104] [c.70] [c.70] [c.183] [c.286]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология