Глюкозооксидаза, ферментный электрод

Различные комбинации мембран на основе антител и ферментных электродов могут привести к созданию новых автоматизированных сенсоров, чувствительных к антигенам. Такие биосенсоры, возможно сопряженные с сенсорами ферментов печени, позволяют обеспечить быстрое и надежное наблюдение за кровеснабжением. На рис. 1.6 показан иммуносенсор на основе измерения потребления кислорода в присутствии глюкозооксидазы и глюкозы. Таким образом определяют содержание антител поверхностного антигена вируса гепатита В. Описаны и другие электроферментные методы для иммунологических исследований, и это направление, видимо, будет интенсивно развиваться (гл. 14). [c.18]

Это не единственный пример сочетания двух ферментов в ферментном электроде. Так, в работе [137, с. 69] на платиновый электрод нанесены щелочная фосфатаза и глюкозооксидаза, обеспечивающие селективную реакцию электрода на изменение концент- [c.130]

В амперометрических ферментных электродах используют, как правило, окислительно-восстановительные ферменты, относящиеся к классу оксидаз, и катализирующие окисление различных субстратов кислородом. При этом в процессе реакции происходит потребление кислорода, а продуктом является пероксид водорода или вода. К одному из наиболее ценных соединений, анализ которого важен в медицине, микробиологической или пищевой промышленности, относится глюкоза. Ее определение с использованием ферментного электрода основано на реакции окисления глюкозы кислородом или искусственным акцептором электронов, катализируемое глюкозооксидазой. В процессе ферментативной реакции, протекающей в тонкой пленке иммобилизованной глюкозооксидазы, непосредственно контактирующей с электрохимическим детектором, в системе изменяются такие параметры, как pH раствора, концентрация кислорода и пероксида водорода. Причем их изменение происходит в строгом соответствии с определяемой концентрацией глюкозы, что позволяет ее количественно определить по соответствующему калибровочному графику. В соответствии с этим можно выбрать тот или иной способ детекции. Изменение концентрации кислорода регистрируется кислородным электродом, отделенным от исследуемого раствора проницаемой для газов мембраной. Электрохимическая реа Сция происходит при потенциале электрода, соответствующем предельному диффузионному току кислорода. При регистрации пероксида водорода в конструкции электрода отсутствует полупроницаемая мембрана и анализ глюкозы проводят при потенциале электроокисления пероксида водорода. [c.81]

Принцип работы одного из типов анализатора заключается в следующем. Определяемые и меченные ферментом (каталазой или глюкозооксидазой) антигены конкурируют за центры связывания антител, иммобилизованных на мембране, окружающей кислородный электрод Кларка. После проведения иммунохимической реакции отмывают несвязавшиеся на мембране компоненты исследуемой смеси и вводят растворы субстратов фермента. Измеряемый ток на электроде пропорционален концентрации кислорода, поглощаемого (или выделяемого) в ферментативной реакции, осуществляемой связанным с антителами ферментным конъюгатом. Процедура регистрации иммобилизованных антител Позволяет использовать устройство многократно. Время анализа белковых антигенов (альбумин, инсулин) составляет 15 мин при чувствительности 5— [c.111]

Использование кислородного электрода Кларка для детектирования потери или образования кислорода в ферментативной реакции стало интересным шагом в развитии иммуноферментного анализа. В качестве ферментных меток чаще всего используют глюкозооксидазу и каталазу. [c.58]

На первой стадии глюкоза окисляется растворенным кислородом до -глюконолактона с образованием стехиометрического количества перекиси водорода, которая на второй стадии количественно окисляет о-дианизидин Существует большое количество модификаций метода с фотометрическим определением начальной скорости реакции на второй стадии или по конечной точке реакции, с использованием других субстратов пероксидазы — ферроцианида и других. В ряде модификаций вторая стадия проводится неферментативным способом. Помимо фотометрического широко используется также потенциометрический и амперометрический методы определения глюкозы с помощью глюкозоокси-дазы. Наиболее традиционным является применение кислородного электрода Кларка в сочетании с глюкозооксидазной мембраной. Совместная иммобилизация в мембране глюкозооксидазы и /3-глюкозидазы позволяют определять с помощью ферментного электрода активность целлюлазного комплекса Однако чувствительность ферментных электродов, как правило, ниже, чем у фотометрического метода с использованием глюкозооксидазы. [c.133]

Гюильбо и Любрано [253, 254] сконструировали ферментный электрод на глюкозу, пригодный для ее амнерометрического определения в крови. Этот метод основан на прямом амперометрическом измерении перекиси водорода, выделяющейся при окислении глюкозы в соответствии с уравнением (14.1). Электрод представляет собой платиновый диск, покрытый тонким слоем глюкозооксидазы, химически связанной с полиакриламидом этот слой удерживается на поверхности платины целлофановой пленкой, которая укреплена на корпусе электрода резиновым колечком. После погружения электрода в раствор глюкозы последняя диффундирует в слой геля, где идет реакция (14.1). Образовавшаяся перекись водорода диффундирует из этого слоя к поверхности платины и окисляется на нем. Величина тока пропорциональна концентрации перекиси водорода, а следовательно, и концентрации глюкозы. Электрод ежедневно подвергают предварительной обработке, которая состоит в следующем. Электрод [c.172]

Ферментный электрод, чувствительный к глюкозе, используется для измерений в неперемешиваемых растворах. Основу его составляет иодид-селективный мембранный электрод, на поверхность которого нанесен тонкий слой смеси иммобилизованных глюкозооксидазы и пероксидазы. При погружении такого электрода в раствор глюкозы на его поверхности протекают последовательные реакции (14.1) и (14.3). В результате возникает градиент активности иодида в приэлект-родном слое по отношению к активности в объеме раствора. Наличие градиента концентрации обусловливает диффузию иодида к электроду, и при постоянной концентрации в объеме раствора в системе устанавливается стационарное состояние. [c.174]

Из приведенных выше примеров наиболее хорошо изучена, по-видимому, глюкозо-оксидазная редокс-электродная система [3, 10-12]. Глюкозооксидаза катализирует реакцию между р-В-глюкозой и О2 с образованием глюконолактона и пероксида водорода. Как отмечено во введении, в биокаталитических ферментных редокс-элект-родных системах оксидоредуктазный фермент иммобилизован на поверхности электрода, а определяемое вещество находится в растворе. Другие редокс-системы могут включать 1) иммобилизацию кофактора фермента, например порфирина или флавина, на поверхности электрода в расчете на то, что содержащиеся в пробе апоферменты смогут катализировать окисление или восстановление иммобилизованных редокс-цент-ров 2) иммобилизацию фермента и медиатора на поверхности электрода. Работая с глюкозооксидазой, мы иммобилизовали фермент на электроде из благородного металла или углерода. Предполагается, что потенциал этих электродов зависит от концентрации глюкозы, кислорода и пероксида водорода в растворе, а также наличия функциональных групп на поверхности платины или углерода. Ниже приведена методика и результаты работы с глюкозооксидазным редокс-электродом. [c.134]

Рис. 13. Ферментные электроды а — ферментный электрод иа основе стеклянного электрода для измерения pH / — металлический электрод 2 — резиновое кольцо 3 — диализная пленка или другая полупроницаемая мембрана 4 — раствор фермента или слой полимерного геля, содержащего фермент 5 — стеклянная мембрана проницаемая для ионов водорода 6 — приэлек-тродный буферный раствор б — схема электрода для определения глюкозы / — катод 2 — электрод сравнения, находящийся во внутреннем буферном растворе 3 — полупроницаемая полимерная мембрана 4 — слой иммобилизованной глюкозооксидазы

Концентрация растворимого ферментного электрода (гл. 1) впервые была выдвинута Кларком и Лайонсом [6] в 1962 г. Однако лишь в 1971 г. была создан [50] первый работающий ферментный электрод на основе глюкозооксидазы, иммобилизованной в геле на поверхности полярографического кислородного электрода, который позволяет определять глюкозу в биологических жидкостях и тканях. Ферментные электроды могут работать и как вольтамперометрические, и как амперометрические датчики, то есть измеряется ток при приложенном постоянном напряжении. В 1969 г. Гилболт и Монталвв [19] предложили первый потенциометрический (измеряется потенциал системы без наложения внешнего напряжения) ферментный электрод для определения мочевины. С тех пор в литературе описано более ста различных электродов данные [c.120]

Мы исследовали ряд различных проводящих органических солей на предмет использования их в ферментных электродах [7]. Входящие в состав этих солей доноры и акцепторы электронов приведены ниже. Многие проводящие органические соли впервые были синтезированы Мелби и сотр. [24, 25], а их электрохимические свойства изучены в работах [19, 20]. Почти все полученные нами соли проявляют электрохимическую активность по отношению к глюкозооксидазе. Это открытие несколько удивило нас, поскольку мы полагали, что для эффективного переноса электрона взаимодействие между поверхностью и ферментом должно быть достаточно специфическим. На [c.160]

Ферменты, принимаюшие участие в окислении или восстановлении биологических молекул (оксидоредуктазы), либо содержат в активном центре группу, которая может окисляться/восстанавливаться, например железо, медь, флавин или хинон, либо выполняют свою биологическую роль совместно с каким-либо редокс-кофактором, например ЫАВ(Р) . Из-за трудности осуществления прямой электрохимической реакции между редокс-центром и голым электродом и отсутствия эффективных электро-каталитических поверхностей для рециклирования восстанавливаемого кофактора в первых ферментных электродах электрохимические процессы лишь косвенно влияли на активность фермента. Классическим примером является сенсор глюкозы па основе фермента глюкозооксидазы и полярографического кислородного электрода, предложенный Кларком и Лайонсом [15] в 1962 г. и усовершенствованный Апдайком и Хикссом [54] в 1967 г. (гл. 1). Глюкозооксидаза представляет собой РАВ-содержащий фермент (рис. 15.1), катализирующий окисление глюкозы в глюконовую кислоту [c.212]

Ферроцен представляет собой л-ареновый комплекс переходного металла, который состоит из атома железа, зажатого двумя циклопентадиениловыми кольцами. С электрохимической точки зрения это классическая редокс-пара (Е° = 165 мВ относительно н.к.э.), на физические и химические свойства которой можно влиять, вводя заместитель в любое из двух колец молекулярной системы [43]. Первый успешно работающий ферментный электрод на основе ферроцена содержал нерастворимое производное ферроцена и глюкозооксидазу [11]. Проще говоря, 1,Г-диметилферроцен внедрили в графитовый электрод, на котором химически иммобилизовали глюкозооксидазу (гл. 16). В этой конфигурации электрохимически генерированный ферроцений-ион действует как окислитель восстановленной глюкозооксидазы. Образовавшаяся при этом восстановленная форма ферроцена реокисляется на поверхности электрода в результате поляризации электрода при пропускании тока. Последовательность реакций, протекающих на электроде, можно представить в виде [c.214]

Все использованные в данной работе ферментные электроды включали глюкозооксидазные (ООО) мембраны, находящиеся в тесном контакте с платиновым диском. Ферментные мембраны получали либо ацилазидной активацией реконструированных коллагеновых пленок [16], либо помещая фермент между ацетилцеллюлозными пленками [11]. В последнем случае мембрану изготавливали в лаборатории. Исходный раствор содержал 5% диацетилцеллюлозы, 91,5% ацетона, 1% поливинилпирролидо-на, 2,5% воды 5 мг глюкозооксидазы (ЕС 1.1.3.4, фирма Boeringer, марка П) растворяли в 3 мл ацетатного буферного раствора. Изготовление мембраны включало ряд стадий 3 мл ацетилцеллюлозного раствора перемешивали с 0,2 мл ферментного раствора в течение 5 мин затем с помощью распылителя (5, 15 или 30 мкм) смесь наносили на стеклянную пластинку, чтобы получилась тонкая пленка. После высушивания (2-5 мин) мембрану промывали дистиллированной водой и хранили в ацетатном буферном растворе (pH 5,6). [c.555]

Используются также ферментные электроды на основе ингибирования активности глюкозооксидазы, перооксидазы, люциферазы. Для детектирования применяются следующие методы амперометрический, потенциометрический, термостатический, визуальный, метод радиоактивных индикаторов, биолюминесцентный, с использованием газо-полупроводниковых сенсоров [218]. [c.123]

О биосенсорах, т. е. сенсорах, включающих биологический материал (рис. 1.4), впервые сообщалось на симпозиуме New York A ademy of S ien es в 1962 г. [6]. В этом сообщении было предложено использовать ферментные преобразователи, встроенные в мембраны (так, что получается подобие сандвича), чтобы сделать электрохимические сенсоры (pH, полярографические, потенциометрические или кондуктометрические) более совершенными. В результате получились сенсоры, специфически чувствительные к определенным субстратам, поскольку они детектировали образование продукта ферментативной реакции или расход одного из участвующих в этой реакции веществ. Описана, в частности, комбинация глюкозооксидазы с Ог-электродом Кларка для определения глюкозы по убыли содержания кислорода при превращении глюкозы в глюконовую кислоту и пероксид водорода. [c.14]

До сих пор наше внимание было сосредоточено на системе с глюкозооксидазой, но и другие ферменты реагируют с электродами на основе проводящих органических солей. Из исследованных нами материалов [7] соль TTF T NQ дает наименьший фоновый ток, поэтому для дальнейшей работы была выбрана именно она. Этот электродный материал использовали в сочетании с четырьмя ферментными системами, содержащими флавиновую простетическую группу, FAD. Во всех случаях восстановленный фермент можно окислять непосредственно на электроде. Подробные сведения [c.166]

Растворимость кислорода в воде составляет примерно 0,25 мМ, а величина относительно кислорода для глюкозооксидазы необычайно велика-около 0,5 мМ [5]. Для того чтобы отклик электрода на увеличение концентрации глюкозы был линеен, реакция на электроде должна контролироваться скоростью диффузии глюкозы в ферментный слой. Однако из-за высокого (по отношению к низкой растворимости кислорода) значения Кщ отклик электрода становится нелинейным при концентрации глюкозы выше 1 г/л (рис. 19.1, а). Концентрация кислорода в ферментере обычно яамного ниже и может даже приближаться к нулю, вследствие чего ферментативная зеакция из лимитируемой глюкозой становится лимитируемой кислородом в неопределенной точке. Таким образом, глюкозный электрод, зависящий от диффузии сислорода, непригоден для работы в ферментере in situ. [c.283]