Сывороточный альбумин хроматография

После установления условий проведении количественной нингидринной реакции Муру и Штейну удалось в 1948 г. разделить 2,5 мг гидролизата сывороточного альбумина быка с помощью распределительной хроматографии на колонке с крахмалом. Элюат был разделен на 4(Ю фракций, в каждой фракции проведена нингидринная реакция, и из интегральных кривых поглощения, соответствующих отдельным аминокислотам, рассчитывались их молярные доли в смеси. На коллег-современников большое впечатление произвели высокая скорость анализа (I нед), малое количество анализируемого вещества и малая погрешность ( 3%). [c.59]

Тизелиус [126] сообщил, что белки, ферменты и другие высокомолекулярные вещества в присутствии растворов солей адсорбируются весьма сильно на некоторых адсорбентах, которые в растворах, не содержащих соли, имеют очень слабое сродство к этим веществам или вообще не адсорбируют их. Шепарду и Тизелиусу [114] удалось полностью адсорбировать овальбумин и сывороточный альбумин на колонке из силикагеля путем увеличения ионной силы растворов, из которых адсорбировались белки. В той же лаборатории была исследована распределительная хроматография ряда белков на колонках из фосфата кальция [128]. [c.331]

Обратимые реакции с низкомолекулярными соединениями характерны не только для ферментов, но также и для белков сыворотки. Здесь особый интерес представляют исследования по связыванию сывороточными белками фармацевтических препаратов и металлов (см. литературу, приложение III). Описанные в литературе опыты по качественному и количественному изучению таких комплексов также свидетельствуют о том, что гель-хроматография оказалась полезной и в этой области. В некоторых экспериментах сухой сефадекс вносили в раствор обоих компонентов. Сочетание в этих опытах гель-фильтрации с центрифугированием (см. гл. II), несомненно, позволило бы получить еще более точные результаты. На колонках изучалось взаимодействие триптофана и некоторых его производных с сывороточным альбумином, при- [c.148]

РАЗДЕЛЕНИЕ О, Е-ТРИПТОФАНА АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ НА КОЛОНКЕ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМ НА АГАРОЗЕ БЫЧЬИМ СЫВОРОТОЧНЫМ АЛЬБУМИНОМ [c.367]

Наибольшей скоростью прохождения колонки обладают компоненты, не способные проникнуть в зерна гелевой фазы. Сефадексы 0-10 и 0-15 служат для фракционирования низкомолекулярных веществ, первый из них используется для веществ с молекулярным весом до 700, а второй — до 1500. Гели сефадекса 0-25 не способны поглощать, а следовательно, и задерживать перемещение по колонке веществ с молекулярным весом 3500— 4500. Этот предел для сефадекса 0-50 лежит в области значений молекулярных весов 8000—10000, а для сефадекса 0-75 эта величина достигает 40000—50000. Медленно перемещаются по колонке низкомолекулярные вещества, для которых коэффициент распределения между гелевой и жидкой фазами приближается к единице. Во многих случаях компоненты смеси при хроматографическом разделении на сефадексах следуют в порядке уменьшения их молекулярных весов. Однако наблюдается иногда и специфическое сорбционное взаимодействие разделяемых веществ с матрицей сефадекса, что влечет за собой увеличение коэффициента распределения К и снижение скорости перемещения по колонке. Так, замедление движения хроматографических зон наблюдается у основных пептидов и аминокислот в основных растворителях и кислых аминокислот и пептидов в кислых растворителях. Наблюдается также повышение степени удерживания в колонке ароматических веществ при гельфильтрации [22]. Ряд белков, таких как рибонуклеаза, лизоцим, трипсин, бычий сывороточный альбумин, в отсутствие солей также сорбируется и удерживается сефадексом при хроматографии. В связи с этим целесообразно проводить элюирование на сефадексах растворами солей или кислот. [c.202]

Введение, Сывороточные альбумины обычно относят к транспортным белкам организма, и исследование их связывающих свойств, т. е. сродства к различным эндогенным соединениям и лекарствам, вызывает интерес многих фармакологов и биохимиков. Исследование равновесия в растворах продемонстрировало энантиоселективные свойства альбуминов [7], но изучение возможностей, которые открывает применение этих свойств в хроматографии, началось лишь в самое последнее время [8— [c.143]

Смит II соавторы с помощью аффинной хроматографии очищали рецептор прогестерона человека. Содержание рецептора в матке составляет лишь 0,002% суммарного белка, и оп весьма лабилен. В качестве лиганда использовали 11-дезоксикортикостерон. Гормон сажали на Br N-активнрованную сефарозу 41 в виде конъюгата с бычьим сывороточным альбумином. Полученный таким образом аффинный сорбент инкубировали 18 ч с частично очищенным цитозолем матки, промывали 0,4 М КС1 и элюировали мкМ раствором меченного тритием прогестерона. Рецептор выходил в комплексе с гормоном. Операция обеспечивала очистку в 10 ООО раз. Вместе с предварительной 6-кратной очисткой цитозоля осаждением сульфатом аммония это позволило авторам получить гомогенный препарат рецептора [Smith et al., 1981). [c.434]

Рис. 38.2. Хроматография экстракта Р-меченых нуклеиновых кислот из Е. oli на метилированном сывороточном альбумине [54].

С помощью гель-хроматографии уже давно уда лось установить наличие ассоциатов в некоторых белковых препаратах. Педерсен [96] на сефадексе G-150 выделил и охарактеризовал чистый димер из старых препаратов сывороточного альбумина. Компоненты, выходящие с колонки еще раньше, представляли собой тример и тетрамер сывороточного альбумина (см. [163]). После того как чистую рибонуклеазу А в 50%-ной уксусной кислоте лиофилизировали, а затем фракционировали на сефадексе G-75, в элюате было обнаружено несколько активных фракций. Главный пик соответствует исходному мономеру белка, тогда как остальные компоненты, судя по объемам выхода, являются ассоциатами [97]. Очевидно, аналогичное явление образования димера и других полимеров обна> ружили Зигель и Монти [98] при исследовании уре-азы. Хроматографией на сефадексе G-200 им удалось из кристаллического фермента (Sigma, тип С 1) выделить несколько более быстро движущихся фракций. На основании объемов выхода для них с помощью уравнения Эккерса [59] был вычислен радиус по Стоксу это дало возможность определить молекулярный вес. Таким образом был установлен чрезвычайно интересный факт из препарата, помимо уреазы (мол. вес 483 000), удалось выделить ее димер и тример. По-видимому, в свободном объеме элюировались также продукты еще более высокой степени агрегации. [c.175]

Однако обнаружено, что хроматография химотрипсина на незамещенной сефарозе не дает достаточных доказательств отсутствия неспецифической сорбции. Напротив, Хофсти [12] показал, что сефароза с иммобилизованным метиловым эфиром е-амино-капронил-о-триптофаном сорбирует, например, сывороточный альбумин или у-глобулин полностью неспецифически. [c.68]

Другим примером влияния концентрации аффинного лиганда является аффинная хроматография смеси лактатдегидрогеназы и сывороточного альбумина на N -(6-аминогексил)-5 -АМР — сефарозе [8]. При высоких концентрациях лиганда (1,5 мкмоль 5 -АМР в 1 мл) для элюирования с )ермента необходимо введение NADH ( удар ). При низких концентрациях (0,125 мкмоль 5 -АМР в 1 мл) десорбция фермента достигается просто градиентом концентрации (от О до 1 моль/л) хлорида калия. Дальнейшее уменьшение количества прикрепленного лиганда (0,025 мкмоль 5 -АМР в 1 мл) приводит к прогрессивному увеличению доли лактатдегидрогеназы, элюируемой исходным уравновешивающим буфером даже перед наложением линейного градиента солей. В то же время [c.75]

Ограниченная диффузия возникает, если молекулярная диффузия в порах матрицы затруднена из-за экранирования подхода макромолекул к прикрепленному аффинному лиганду. Экспериментально вклад этой диффузии можно определить с большим трудом, но для аффинной хроматографии на очень пористых носителях эти трудности становятся минимальными. На практике для достижения равновесных условий желательно, чтобы скорость потока была по возможности низкой. Например, при скорости потока 400 мл/ч для выделения стафилококковой нуклеазы на колонке объемом 20 мл небольшие количества нуклеазы появлялись в первом пике вместе с белковыми примесями, особенно если общая концентрация белков в образце была высока (20—30 мг/мл) [5]. Однако даже при такой высокой скорости потока нуклеаза полностью сорбировалась, если наносился менее концентрированный образец. Зависимость связывания лактатдегидрогеназы на №-(6-аминогексил)-5 -АМР — сефарозе от скорости потока пссле-дована Лоу и др. [21]. Было найдено, что увеличение скорости потока относительно мало влияет на сорбцию. При высоких скоростях потока эффективность колонки (ВЭТТ), а также связываемость р уменьшаются. Влияние скорости потока более заметно в небольших колонках, с которых часть белка с ферментативной активностью элюируется со свободным объемом. Влияния концентрации инертного белка (бычьего сывороточного альбумина) при высоких скоростях потока (67 мл/ч) также не обнаружено. [c.84]

Колоночная хроматография с использованием иммобилизованного бычьего сывороточного альбумина, присоединенного непосредственно к сефарозе 4В, сывороточного альбухмина, присоединенного к сукциниламиноэтилагарозе, или обезжиренного сывороточного альбумина (по методу Чена [195]), присоединенного также к [c.368]

Считается, что сефароза устойчива в области pH 4—9 с ней не рекомендуется работать при температурах иже 0°С или выше 40 °С. Сефароза устойчива к действию концентрированных растворов солей или мочевины. Куатреказас [14] указывает,, что на частицы агарозы существенно не влияет продолжительное воздействие 6М раствора гуанидинхлорида или 7М раствора мочевины. Поэтому агарозные аффинные сорбенты можно отмывать от белков этими денатурирующими растворами. В течение 2—3 ч при комнатной температуре на агарозу не действуют 0,1М гидроксид натрия или 1М хлорная кислота. Ни 50%-ный (по объему) водный диметилформамид, ни 50%-ный (по объему) водный этиленгликоль не меняют структуру агарозы. Эти растворители полезны при аффинной хроматографии относительно плохо растворимых в воде соединений, например тироксина и стероидов. Аффинные сорбенты на основе сефарозы можно хранить при 4° С в виде водной суспензии с до бавкой антибактериального агента. Длительность хранения определяется лишь стабильностью связанного аффинного лиганда. Однако агарозные аффинные сорбенты полностью разрушаются при высушивании или замораживании. Согласно данным Аксена и Эрнбека )[3], эти сорбенты можно лиофилизовать, если добавить к ним декстран, глюкозу и сывороточный альбумин. Химическая стабильность биогеля А такая же, как у сефарозы. [c.16]

Щелочные боросиликатные стекла можно выщелочить кислотой и щелочью и получить системы с очень однородными по размеру порами в диапазоне 170—2500 А [2196, 219в]. Благодаря узким распределениям по размерам пор пористые частицы стекол обладают уникальными свойствами, позволяющими проводить исследование самого механизма гель-проникающей хроматографии [230], а такн е проводить фракционирование конкретных систем. Обычно можно применять смеси стекол различной степени пористости. На пористых стеклах были проведены разделения искусственных смесей вирусов растений и бычьего сывороточного альбумина [230 а], а также фракционирование образцов полистирола и нолиизобутилена молекулярного веса 10 000-3 400 ООО [2306]. [c.137]

Под дополнительными методами имеются в виду методы хроматографии на колонке (гл. 4), электрофореза и гель-проникающей хроматографии (гл. 5). В первом случае разделение исследуемых полимерных образцов происходит на основании зависимости растворимости от молекулярного веса и химического состава. Нетрудно понять механизм разделения по молекулярным весам, поскольку растворимость уменьшается при увеличении молекулярного веса. Но растворимость зависит также от присутствия в полимере полярных групп в связи с этим при наличии химической неоднородности происходит фракционирование и по составу молекул. Если полярность групп в разных звеньях макромолекулы примерно одинакова, то фракционирование определяется главным образом величиной молекулярного веса. При больших различиях в степени полярности разных групп влияние полярности может оказаться более сильным, чем влияние молекулярного веса, и разделение на фракции сможет осуществляться преимущественно по химическому строению. Именно на этом было основано разделение сывороточного альбумина лошади и яичного альбумина в водном фосфатном растворе на фракции с различным содержанием.кислых фосфатных групп [17]. Белки с большим содержанием серы были разделены методами хроматографии на фракции с различным содержанием серы и азота [18]. Влияние на результаты фракционирования сродства между исследуемым соединением и материалом носителя было изучено на примере рацемической смеси поли-4-метилгексена-1 [19]. При фракционировании методом хроматографии [c.299]

Хроматография на метилированном сывороточном альбумине [551, 552] была весьма успешно применена для фракционирования информационной РНК (соответствующей по составу клеточной ДНК) самого различного молекулярного веса [553]. Легко достигнуто отделение низкомолекулярной транспортной РНК от микросо-мальной РНК [558] возможно также дальнейшее фракционирование транспортной РНК [568]. [c.370]

Использование колонок с силикагелем, содержащим иммобилизованный бычий сывороточный альбумин, для оптического расщепления методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [c.142]

Рис. 5. Аффинная хроматография с конкурентным зональным элюированием для системы с бивалентным связыванием. Зоны (100 мкл) мономера [ ]IgA (бивалентное связывание) наносми на фосфорилхолин-сефарозу с высокой плотностью лиганда (7X25 мм, [Ь]=5-10-5 моль/л), уравновешенную МаСЬ натрийфосфатным буфером (содержащим 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина) фосфорилхолин имел следующие концентрации (моль/л) 7 — 0 2—1 10- 5 —2,5-10-6 4 — 5,010- 5 — 7,5-10- 5—1,0-10-5. Элюирование осуществляли при комнатной температуре буфером, содержащим указанное количество растворенного конкурентного фосфорилхолина. В правом верхнем углу по данным элюирования построена зависимость 1/(К—Уо) от концентрации фосфорилхолина. Константы диссоциации /Сь и /Сп рассчитаны с помощью этого графика с использованием уравнения (5) и приведены в табл. I [9].

Рис. 6-4. Обратнофазовая хроматография шести белков-стандартов. Смесь шести белков (/ — апротинин, 2 — инсулин, 3 — бычий сывороточный альбумин, 4 — апомиоглобин, 5— карбоангидраза Б, 6 — овальбумин) в 12 мМ НС1 хроматографировали в системе растворителей 1 (А), 2 ( ) н 3 (В), как описано в разд. У,Б.

Свойства бычьего сывороточного альбумина и некоторые примеры иммобилизации. Для разделения хиральных изомеров и для аффинной хроматографии были иммобилизованы еще некоторые узкоспецифичные белки, однако примеры использования этих неподвижных фаз для анализа биологических жидко- [c.547]

Как и в предыдущих разделах, мы попытаемся кратко рассмотреть применение ионообменной хроматографии на примере изучения белков сыворотки. До сих пор наиболее популярным методом разделения сывороточных белков является хроматография на колонке анионообменной ДЭАЭ-целлюлозы по методу Собера и Петерсона [18]. Предложено несколько модификаций этого метода. Фракции сыворотки элюируются с колонки различными способами градиентного элюирования и выходят обычно в следующем порядке IgG (как правило, имеет несколько пиков), р-, а-глобулины и затем альбумин. Этот метод особенно эффективен для приготовления препаратов IgQ высокой иммунохимической чистоты из нативной сыворотки. Его можно комбинировать с другими способами очистки, например с осаждением риванолом, Na2S04 и т. п. Подобным образом в качестве одного из этапов препаративного выделения анионообменная хроматография может применяться для очистки других белков сыворотки. При изучении структуры белка ее можно использовать для выделения и очистки полипептидов после расщепления белка ферментами или какими-либо другими веществами. [c.23]

Смотреть страницы где упоминается термин Сывороточный альбумин хроматография: [c.201] [c.79] [c.247] [c.155] [c.219] [c.142] [c.188] [c.276] [c.368] [c.377] [c.153] [c.257] [c.417] [c.258] [c.185] [c.153] [c.386] [c.13] [c.143] [c.228] [c.231] [c.107] [c.89] [c.148] [c.44]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология