Рентгеноструктурный анализ рибонуклеазы

Первоначально данные рентгеноструктурного анализа получают в виде карты электронной плотности, представляющей собой стопку прозрачных пластин с контурами плотности, которые затем интерпретируются. Очевидно, что и исследуемую молекулярную структуру можно представить таким же образом. Такой опыт был проделан для рибонуклеазы [396] все связи отпечатывались в виде полос, а вандерваальсовы огибающие полости — в виде соединяю- [c.166]

Использование этих стандартных спектров КД для подсчета соотношений а-спирали, -формы и неупорядоченных конформаций глобулярных белков с попыткой воссоздания экспериментально измеренного спектра КД белка по алгебраической сумме различных долей спектра из трех чистых конформаций стало главным применением этого спектроскопического метода в данной области. Достигаемая при этом точность зависит от того, насколько конформационно чистым является стандарт, и для этой цели были рекомендованы и несколько поли ( -аминокислот). Неопределенностью, однако, является то, в каких условиях эти поли (аминокислоты) становятся полностью конформационно неупорядоченными. В качестве стандарта с неупорядоченной конформацией предложен поли ( -серин) при высоких солевых концентрациях [23]. КД-спектры, вычисленные для миоглобина, лизоцима и рибонуклеазы на основе их третичных структур, которые ранее были установлены для этих глобулярных белков по данным рентгеноструктурного анализа, согласуются по всем характеристическим точкам с экспериментальными спектрами КД при использовании в качестве одного из стандартов поли ( -серина) [35]. Подобные данные по анализу соответствия кривых по нативным белкам и полипептидам многочисленны, и они дают информацию о степени конформационной упорядоченности этих веществ в растворах [36]. Эти данные не дают, конечно, ответа на вопрос, какая именно часть первичной структуры а-спирализована, какая отвечает -форме и какая— неупорядоченной, однако основываясь на последовательности аминокислотных остатков белка или полипептида, можно строить рискованные предположения о том, где эти конформации локализованы. Как отмечалось в разд. 23.7.2.4, аминокислоты белков разделяются на те, которые при включении в полипептиды способствуют принятию упорядоченной конформации, и те, которые тому не способствуют. Такая информация получена при рассмотрении [c.437]

В молекуле нет дисульфидных мостиков. Известна последовательность аминокислот [47] и конформация цепи [48—51] миоглобина кашалота. Это был первый белок, структура которого определена с помощью рентгеноструктурного анализа. Он отличается от лизоцима и рибонуклеазы тем, что 121 аминокислотный остаток находится в а-спиральных участках [12]. Молекулу можно рассматривать как корзину, состоящую из восьми спиралей, которая содержит гем-группу внутри гидрофобной полости. Выступает на- [c.369]

Рис. 8-7. Конформация молекулы рибонуклеазы, установленная методом рентгеноструктурного анализа. Пунктирными линиями показаны водородные связи между петлями полипептидной цепи, уложенными в виде складчатого р-слоя. Полость в середине верхней части молекулы служит центром связывания субстрата. Расположение внутрицепочечных дисульфидных поперечных связей показано ва рис. 8-8.

Порядок чередования отдельных остатков аминокислот в цепи может быть установлен последовательным отщеплением с обоих концов молекулы отдельных аминокислот, которые предварительно метятся превращением в какие-либо устойчивые к гидролизу производные, например в производные динитроанилина. Этим путем было установлено строение нескольких наиболее простых белков (инсулина, гемоглобина, рибонуклеазы и др.), молекулы которых построены из нескольких десятков (в некоторых случаях больше сотни) различных и одинаковых молекул а-аминокислот и имеют молекулярную массу 5000—15000. Эти химические данные дополняются результатами рентгеноструктурного анализа. Для многих более сложных белков установлен порядок чередования нескольких аминокислотных звеньев с каждого конца молекулы. [c.298]

Лизоцим был третьим по счету белком и первым ферментом, структура которого была установлена методом рентгеноструктурного анализа при высоком разрешении. В настоящее время аналогичным образов охарактеризованы структуры многих других ферментов, в том числе рибонуклеазы, карбоксипептидазы, папаи-на, химотрипсина и субтилизина. Лизоцим, однако, по-прежнему остается самым ярким примером применения рентгенографии для объяснения характера действия ферментов. [c.258]

Какое значение имеет подобная структура и как она, связана с функцией глобулярных белков К сожалению, ответить на этот вопрос еще невозможно. Правда, известно, что окисленная и восстановленная формы гемоглобина кристаллизуют ся различно. Это указывает на перестройку структуры белка при его функционировании, т. е. при соединении кислорода с гемом. Однако в чем заключается эта перестройка, неизвестно, ибо до сих пор изучена только окисленная форма гемоглобина (метгемоглобин). Вообще же для исчерпывающего ответа на этот вопрос необходимо провести параллель между структурой целого ряда белков и их функциями, что требует, в свою очередь, определить их третичную структуру. В настоящее время в ряде лабораторий проводится -рентгеноструктурный анализ ряда белков инсулина, цитохрома С, рибонуклеазы, лизоцима и др. Однако эта работа сталкивается с большими трудностями при дешифровке рентгенограмм. При разрешении в [c.126]

Уже давно высказывалось мнение, что первичная структура белка — аминокислотный состав — определяет его пространственную структуру 1116, 117]. Поскольку за последнее десятилетие структура пяти белков — гемоглобина [1181, миоглобина [ПО, 1111, лизоцима [112, 113], а-химотрипсина [119] и рибонуклеазы А [120] — стала известна детально, а еще для нескольких белков рентгеноструктурный анализ дал достаточное разрешение для того, чтобы увидеть основные черты вторичной и третичной структур, многие исследователи пытаются найти корреляцию между аминокислотным кодом (составом и последовательностью аминокислотных остатков) и конформационным кодом (пространственной структурой). [c.388]

Рибонуклеаза содержит в восстановленном состоянии 8 сульфгидрильных групп. Хаотическая, ненаправленная рекомбинация их при окислении может привести к 105 разным пространственным формам, из которых только одна (или несколько) соответствует природному ферментативно активному белку. Высокая степень восстановления биологической активности при реокислении свидетельствует о том, что либо первичная структура однозначно определяет характер вторичной и третичной, так что окисление проходит однозначно, либо возможно суш ествование нескольких пространственных форм рибонуклеазы, которые обладают биологической активностью. Данные хроматографии, рентгеноструктурного анализа и других исследований свидетельствуют в пользу первого предположения. [c.157]

По данным рентгеноструктурного анализа установлено, что молекула рибонуклеазы представляет собой компактную глобулу с довольно значительным углублением. В этом углублении и помещается активный центр фермента. [c.297]

Рентгеноструктурный анализ белков и фермент-ингибиторных комплексов после классических работ Перутца, Кендрью и Филлипса стал развиваться быстрыми темпами во многих научных центрах, несмотря на то, что он по-прежнему оставался дорогостоящим, трудоемким и длительным. Через несколько лет стали известны третичные структуры химотрипсиногена, химотрипсина, рибонуклеазы, папаина, инсулина и многих других белков и их комплексов. [c.53]

Суммируя вандерваальсовы объемы всех атомов, можно рассчитать молекулярный объем белка. Получаемый таким методом объем равен 16 900 А для рибонуклеазы 8 (если пренебречь остатками, недостаточно хорошо идентифицированными с помощью рентгеноструктурного анализа) и приблизительно 18 100 А для лизоцима. Эти величины на 10% больше объемов, измеренных в растворах и полученных из данных о молекулярных массах и экспериментально определенных плотностей (см. гл. 10). [c.111]

СТРУКТУРА РИБОНУКЛЕАЗЫ ПО ДАННЫМ РЕНТГЕНОСТРУКТУРНОГО АНАЛИЗА [c.78]

Таким образом, в понимании механизма реакции, катализируемой рибонуклеазой, достигнуты огромные успехи. На примере этого фермента мы дали лишь краткий обзор разнообразных методов, которые следует использовать при изучении механизма действия ферментов, однако большое число важных исследований здесь не рассматривалось. При этом необходимо отметить, что исследования с помощью физических методов (кинетика, рентгеноструктурный анализ и т.д.) хотя и дают очень ценную информацию, не всегда способны ответить на многие из возникающих вопросов. Естественно, что наилучшего понимания механизма действия ферментов достигают только при совокупном использовании данных, полученных как физико-химическими, так и любыми другими методами. Это хорошо показано на примере исследования рибонуклеазы. [c.81]

В нач. 50-х гг. была выдвинута идея о трех уровнях организации белковых молекул (К. У. Линдерстрём-Ланг, 1952)-первичной, вторичной и третичной структурах. Определены первичные структуры инсулина (Ф. Сенгер, 1953) и рибонуклеазы (К. Анфинсен, С. Мур, К. Хёрс, У. Стайн, 1960). По данным рентгеноструктурного анализа были построены трехмерные модели миоглобина (Дж. Кендрю, 1958) и гемоглобина (М. Перуц, 1958) и, т. обр,, доказано существование в Б, вторичной и третичной структур, в т. ч. а-спирали, предсказанной Л. Полингом и Р, Кори в 1949-51. [c.248]

Самый ценный вывод, который был сделан на основании данных, полученных методом рентгеноструктурного анализа, состоит в том, что основной группой, отщепляющей протон от 2 -гидроксила, является Н1з-12, в то время как кислотная группа, отдающая протон уходящему 5 -кислороду, принадлежит Н1з-П9 [59]. (Любопытно, однако, что синтезированное производное рибонуклеазы с М -карбоксиметилированным остатком Н13-12 проявляет некоторую каталитическую активность — факт, в связи с которым возникает ряд вопросов [60].) Характер зависимости активности рибонуклеазы от pH согласуется с предложенным механизмом, поскольку найдены два значения р а (5,4 н 6,4), соответствующие двум группам, состояние ионизации которых контролирует активность фермента. (На основании ЯМР-спектров, показанных на рис. 2-42, было получено значение р/Са, равное 5,8.) Вблизи двух остатков гистидина расположен остаток Ьуз-41. Возможно, его положительный заряд используется для частичной нейтрализации отрицательного заряда на атомах кислорода фосфатной группы, облегчая атаку нуклеофильным агентом. С точки зрения химии рибонуклеазы интересен тот-факт, что под действием бактериальной пептидазы отщепляется фрагмент, содержащий двадцать аминокислотных остатков. Этот 5-пептид . Может воссоединяться с остальной частью молекулы с образованием активного фермента, называемого рибонуклеазой 5. Структура этого, фермента была определена методом дифракции рентгеновских лучей и по существу оказалась аналогичной структуре нативной рибонуклеазы. [c.121]

В то время как основные типы РНК, обнаруживаемые в природе, являются однонитевыми нуклеиновыми кислотами, небольшая часть вирусов, например реовирусы, содержат РНК в виде двойной спирали. Эти РНК имеют такой состав оснований, в котором А = и и О = С. Они проявляют заметную устойчивость к гидролизу рибонуклеазами, если их не подвергать предварительной тепловой денатурации. Такие РНК могут быть выделены из растворов в виде нитей или же аналогичные нити могут быть приготовлены из препаратов синтетических двухцепочечных полимеров типа [(гА)-(ги)] и использованы для исследования методом диффракции рентгеновских лучей [63]. Данные рентгеноструктурного анализа свидетельствуют о том, что двухцепочечные РНК принимают спиральную форму, имеющую очень близкое сходство с /4-формой ДНК (наклон плоскости пар оснований к основной оси спирали около 10°, и на один виток спирали приходится 11 —12 оснований). Создается впечатление, что конформация такой /4-формы РНК, подобно /4-форме ДНК, диктуется формой углеводного кольца, находящегося в С-3-з/ (Зо-конформации. Вполне очевидно, что урацил может взаимодействовать с аденином столь же эффективно, как и тимин в образовании водородных связей. [c.60]

Основное внимание мы будем уделять тем белкам, структура которых в ативном состоянии была (расшифровала с 1по мощью рентгеноструктурного анализа лизоциму, рибонуклеазе, миоглоби-ну, гемоглобину и инсулину. Некоторое внимание будет уделено трипсину, химотрипсину и их предшественникам, а также цитохрому, для которых структура известна частично или, по крайней мере, определена последовательность аминокислот. В основном исследования выполнялись с помощью протонного магнитного резонанса, но ограниченное применение в специальных исследованиях получил и ЯМР других ядер ( Р, Р, и др.). [c.348]

Рибонуклеаза, еще один глобулярный белок небольшого размера, представляет собой фермент, секретируемый клетками, поджелудочной железы в тонкий кишечник, где он катализирует гидролиз некоторых связей в молекулах рибонуклеиновых кислот, содержащихся в перевариваемых пищевых продуктах. Третичная структура рибонуклеазы, установленная методом рентгеноструктурного анализа (рис. 8-7), характеризуется тем, что в ее полипептидной цепи имеется очень мало а-спиральньк участков, но зато в ней есть достаточно большое число сегментов, находящихся в р-конформации. В этом отношении рибонуклеаза отличается от миоглобина, цитохрома с и ли- [c.194]

Глобулярные белки, судя по результатам исследования их формы и размеров, имеют компактно свернутые полипептидные цепи. Рентгеноструктурный анализ миоглобина и других небольших по размерам одноцепочечных белков, таких, как цитохром, с, лизоцим и рибонуклеаза, показывает, что для каждого из этих белков характерна определенная третичная структура, т. е. специфический способ свертывания полипептидной цепи в пространстве. Во всех глобулярньк белках полипептидные цепи очень плотно свернуты, так что внутри молекулы белка если и остается, то лишь немного места для молекул воды. Почти все гидрофобные R-группы скрыты внутри молекулы и экранированы от взаимодействия с водой, большинство же ионных К-групп находится на поверхности в гидратированном состоянии и обращено в сторону [c.221]

В некоторых других видах РНК также обнаружено формирование спиральных структур. Сообщалось, например, что комплементарная РНК (стр. 237), получаемая ферментативным путем in vitro на ДНК (как на матрице), выделенной из бактериофага Т2, содержит при определенных условиях высокоупорядоченную двойную спиральную структуру, сходную с таковой ДНК [74]. Однако это, по-видимому, не относится к информационной РНК, присутствующей в полисомах (стр. 281). Форму двойной спирали имеют также РНК различных вирусов, в том числе РНК реовируса раневой опухоли и репликативных форм вируса полиомиелита [36, 74, 75], вируса Сендай [76] и вируса эпцефаломиокардита [77]. Об этом свидетельствуют результаты, полученные при определении относительного содержания комплементарных оснований и при изучении тепловой денатурации о том же говорят и устойчивость к панкреатической рибонуклеазе и отсутствие реакции с формальдегидом, а также данные рентгеноструктурного анализа 178, 95]. [c.59]

О пространственной структуре молекул ферментов известно пока мало. Считают, что количество спиральных участков в них невелико это было доказано методом рентгеноструктурного анализа для ряда белков, в частности яичного альбумина наиболее подробно — для лизоцима, а также для рибонуклеазы, а-химотрипсина. Сходные данные найдены и методом спектрополяри-метрии, например по Моффиту-Янгу (10—20—30%). Несомненно, что каждый ферментный белок обладает уникальной третичной структурой, где между спирализованными участками располагаются неспирализованные, количество которых велико и которые составляют значительную часть молекулы. Частицы многих ферментов состоят из нескольких (2—4) одинаковых субъединиц, связанных между собой различными способами (четвертичная структура). Часто они удерживаются вместе с помощью атомов металлов, коферментов. Разбавление во многих случаях приводит к диссоциации субъединиц, иногда же силы, связывающие их, более прочны и для этого требуется действие концентрированных растворов мочевины. Химотрипсин, например, находится в растворах чаще в виде димера, при разбавлении образуется мономер (Л1—23 000), а в концентрированных растворах содержится тример. Алкогольдегидрогеназа дрожжей при удалении из нее атомов цинка диссоциирует на четыре неактивные субъединицы (М = 36 000). [c.73]

В настоящее время в ряде лабораторий проводится рентгено-структурпый анализ многих белков. Инсулин, рибонуклеаза, лизоцим и цитохром С являются ближайшими объектами. Методы снятия рентгенограмм, фотометрпрования пятен и методы вычислений поддаются в значительной степени механизации и автоматизации. Можно полагать, что в ближайшие годы рентгеноструктурный анализ даст нам точное знание первичной, вторичной и третичной структуры десятков белков. Тогда эта проблема перейдет в область решенных, т. е. станет проблемой вчерашнего дня. Даже сейчас, когда только что на примерах миоглобина и гемоглобина выработан подробный путь — алгорифм измерений и расчетов — п показан их конечный итог, мы уже можем считать все три уровня строения белка в главных чертах установленными. [c.110]

Новые успехи применения рентгеноструктурного анализа в расшифровке строения глобулярных белков были неразрывно связаны с его дальнейшим методическим усавершенствованием. Рентгеноструктурный анализ глобулярных белков двинулся вперед семимильными шагами после того, как в 1953 г. Перутц разработал принципы получения таких производных гемоглобина, которые содержали тяжелые атомы и которые кристаллизовались изоморфно с исходным белком, но заметно различались по дифракционным картинам своих кристаллов [354]. Этот прием позволил разработать и усовершенствовать так называемый метод изоморфного замещения, который дал исследователям принципиальную возможность однозначно определять белковые структуры. В продолжение 1953—1960 гг. метод был использован для изучения многих кристаллических белков, главным образом гемоглобина, миоглобина, инсулина, рибонуклеазы и лизоцима. Наиболее трудным было получение кристаллов соответствующих изоморфных производных белков, содержащих тяжелые атомы-заместители. [c.149]

Субтилизин может расщеплять рибонуклеазу по связи между остатками 20 и 21. Образующийся S-пептид остается связанным с остатком белка, который называют S-белком . 8-Белок полностью сохраняет свою активность, и по данным рентгеноструктурного анализа его структура отличается от структуры немодифици-рованного белка лишь незначительно. В растворе мочевины он диссоциирует и теряет активность. При реассоциации активность восстанавливается. [c.363]

Наиболее конкретные и подробные экспериментальные данные о пространственной организации ряда глобулярных белков дал метод рентгеноструктурного анализа. В настоящее время этим методом установлена пространственная структура семи белков. Это — миоглобин гемоглобин химотрипсин лизоцим рибонуклеаза карбоксипептидаза А карбоксиангидраза С . Среди изученных белков самый низкомолекулярный — карбоксиангидраза С (33 аминокислоты) и самый высокомолекулярный — карбоксипептидаза А (307 аминокислот в цепи). За исключением гемоглобина, построенного из четырех цепей и имеющего, таким образом, четвертичную структуру, все остальные белки содержат одну ковалентно непрерывную полипептидную цепь. [c.154]

Предыдущая глава была посвящена одному из самых выдающихся не только в биологии, но и во всем естествознании научных достижений уходящего столетия. На рубеже 1950-1960-х годов, как отмечалось, Перутц и Кендрью завершили расшифровку трехмерных структур гемоглобина и миоглобина. Тем самым они впервые решили поставленную еще четверть века до этого Берналом задачу определения с помощью рентгеновской дифракции пространственного строения белковых молекул. Труд Перутца и Кендрью означал становление нового магистрального направления в развитии биологии - морфологии элементарных биосистем, открывающей невиданные доселе возможности в познании строения живой материи. Рентгеноструктурный анализ белков после классических работ Перутца и Кендрью, а также Филлипса, установившего в 1965 г. трехмерную структуру лизоцима, стал развиваться быстрыми темпами во многих научных центрах. Спустя лишь два года после определения строения первого фермента были расшифрованы структуры рибонуклеазы А [228-230], а-химотрипсина [231] и карбо-ксипептидазы А [232]. К 1975 г. число белков, кристаллографические молекулярные структуры которых стали известны с разрешением <3,5 А, достигло 79 [196]. В настоящее время оно превышает 2500 [233]. [c.54]

Нейтроны — незаряженные частицы. В дифракционных экспериментах длина волны нейтронного потока должна быть того же порядка, что и длины валентных связей. В рентгеноструктурном анализе обычно используют медное излучение с = 1,54 А. Нейтроны с длинами волн такого порядка испускаются при температуре -100° и называются тепловыми. Они имеют значительно более низкую энергию (0,025 эВ) по сравнению с рентгеновским излучением (10 ООО эВ) и не разрушают кристаллы белков, поэтому набор дифракционных данных для нейтронов можно получить от одного кристалла, что является несомненным достоинством метода. Недостаток метода нейтронной дифракции — малая интенсивность потока частиц. Распределение скоростей нейтронов, из которого вырезается монохроматический поток, отвечает кривой Максвелла. Интенсивность первичного потока нейтронов по крайней мере на два порядка слабее характеристического излучения рентгеновской трубки. Выше отмечалось, что способность атомов рассеивать нейтроны существенно не зависит от порядкового номера в Периодической системе элементов Менделеева. Поэтому метод изоморфного замещения с использованием тяжелых атомов бесполезен в нейтроноструктурном анализе белков. Альтернативный подход к решению фазовой проблемы еще не найден. В связи с этим для расшифровки нейт-ронограмм необходимо использовать данные рентгеноструктурного анализа. К настоящему времени с помощью метода нейтронной дифракции в комбинации с рентгеноструктурным анализом получены полные трехмерные структуры следующих пяти белков трипсина, лизоцима, миоглобина, рибонуклеазы и крамбина (разрешение 2,2 2,2 1,4 2,8 и 1,3 А соответственно ошибка в определении координат < 0,3 А) [548]. [c.167]

Например, на рис. 2.12 показан полипептидный скелет бычьей рибонуклеазы А. Химическое исследование белка показывает, что 1,5-дифтор-2,4-динитробензол сшивает остатки лизина 7 и 41. Неожиданная чувствительность белка к модификации иодуксусной кислотой приводит к любопытному заключению гистидины 12 и 119 модифицируются по приншту или-или это можно объяснить тем, что они располагаются в активном центре фермента недалеко друг от друга. Сопоставляя сведения о последовательности и обе группы химических данных, легко видеть, что плоское расположение пептидной цепи исключается. Молекула должна быть уложена в пространстве более сложным образом, и результаты рентгеноструктурного анализа действительно подтверждают это. [c.70]

Правильность выделения специальной группы реовирусов стала очевидной, когда в начале 60-х гг. обнаружили уникальные особенности структуры реовирусной РНК. Сначала заметили, что при окрашивании клеток, зараженных реовирусами, акридиновым оранжевым наблюдается флуоресценция в зеленой области спектра (ортохроматическая), а не в оранжевой (мета-хроматическая), характерной для одноцепочечной РНК. Акридиновый оранжевый обладает высоким сродством к одноцепочечным нуклеиновым кислотам и окрашивает их метахроматически. Поскольку к тому времени уже было известно, что реовирусы содержат РНК, был сделан вывод, что эта РНК двухцепочечная [107]. Дальнейшие исследования показали, что реовирусная РНК состоит из комплементарных цепей, образующих двойную спираль [102, 157]. Для нее характерны высокая температура плавления и малый температурный интервал денатурации, устойчивость к панкреатической рибонуклеазе и иная, чем у одноцепочечной РНК, плавучая плотность. Определение нуклеотидного состава реовирусной РНК показало, что она содержит одинаковое число пуриновых и пиримидиновых оснований. Двухцепочечный характер реовирусной РНК был подтвержден также данными рентгеноструктурного анализа [16, 102]. [c.266]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология