Центрифугирование в градиенте плотност плотность полимера в растворе

В седиментационном анализе можно проводить два типа экспериментов. При анализе методом скоростной седиментации проводят определения скорости оседания и диффузии частиц при бioльшиx скоростях вращения ротора, тогда как при анализе методом седиментационного равновесия выжидают установления равновесия между процессами седиментации и диффузии в процессе центрифугирования при меньших скоростях вращения ротора. Теоретически неоднородность распределения по молекулярным весам в образце можно охарактеризовать с помощью обоих указанных методов, получая методом скоростной седиментации распределение по коэффициентам седиментации, а методом седиментационного равновесия — распределение по молекулярным весам. Распределение по молекулярным весам легче интерпретировать хими-ку-полимерщику, не имеющему специальной подготовки. Было показано, что детализированный характер распределения по коэффициентам седиментации можно получить методом скоростной седиментации в отсутствие дополнительных предположений о форме кривой распределения. Такие дополнительные предположения, как правило, необходимы при анализе методом седиментационного равновесия. Скоростное ультрацентрифугирование приобрело, следовательно, наиболее широкое распространение при исследовании неоднородности распределения но молекулярным весам полученные этим методом данные обычно комбинируют с результатами других измерений, преобразуя кривую распределения по коэффициентам седиментации в кривую распределения по мол екулярным весам, в ряде случаев более подходящую для целей исследования. Метод седиментационного равновесия применяется в основном в качестве способа определения абсолютных величин средних молекулярных весов, но применение этого метода для растворов в смешанных растворителях ультрацентрифугирование в градиенте плотности), как недавно было показано, позволяет оценить распределение полимера по плотности. [c.216]

Особым преимуществом центрифугирования в градиенте плотности перед многими другими методами является то, что примеси, даже если они высокомолекулярны или присутствуют в больших количествах, не мешают измерениям в тех случаях, если их плотность в растворе настолько отличается от плотности исследуемого полимера, что они собираются около мениска или дна ячейки или по крайней мере за пределами полосы полимера. [c.443]

ВЫХ оснований или нуклеотидов, полученных после расщепления полимера (подробнее — см. стр. 58). С нуклеотидным составом ДНК однозначно связаны два физических свойства двухцепочечных комплексов, которые часто используются для характеристики полученных препаратов 2 . 2в Одно из них — так называемая температура плавления Гщ — это температура, при которой происходит распад двухцепочечного комплекса на одноцепочечные молекулы этот процесс легко наблюдать по изменению УФ-поглощения или оптического вращения раствора (подробнее см. в гл. 4). Другая характерная константа ДНК — плавучая плотность р — может быть определена из результатов равновесного ультрацентрифугирования Такое центрифугирование проводят обычно в растворах солей, обладающих высокой плотностью чаще всего применяют хлорид или сульфат цезия. При длительном центрифугировании устанавливается градиент плотности раствора, а ДНК собирается в узкой зоне, где существует равновесие между центробежной силой и выталкивающей силой, которая определяется разностью плотности осаждаемого вещества и применяемого солевого раствора в данной зоне. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности Сз С1 может служить не только аналитическим методом для характеристики препарата ДНК, но и полезным препаративным методом для разделения ДНК, различающихся по нуклеотидному составу. Подобным же образом препаративное ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы используется для разделения молекул ДНК, различающихся по скорости седиментации. [c.31]

Сходными выглядят и данные зонных методов (рис. 2) — седиментационные кривые распределения С (%) в зоне раствора полимера при центрифугировании в градиенте плотности и профиль зоны раствора, проходящего хроматографическую колонку. В процессе обоих явлений зона претерпевает расширение, вызванное [c.8]

Наиболее распространенный способ создания градиента плотности — центрифугирование раствора полимера в смеси двух или более жидкостей, отличающихся по плотности, молекулярным массам или по обоим показателям. Полимер собирается в области, где плотность раствора р близка к плотности полимера в растворе, т. е. где кажущийся парциальный удельный объем [c.30]

В предыдущих разделах было показано, что центрифугирование в градиенте плотности является ценным методом исследования природных и синтетических полимеров. Если применимость этого нового метода к исследованию полимеров природного происхождения была продемонстрирована уже на многих примерах, так что метод практически стал стандартной операцией для биохимиков и биофизиков, его применение для исследований синтетических полимеров пока ограничено. Только недавно были получены результаты, показывающие, что центрифугирование в градиенте плотности не только применимо к синтетическим полимерам, но во многих случаях имеет преимущества перед другими методами. Эти преимущества особенно очевидны, когда имеются полимеры высокого молекулярного веса или количество полимера в образце очень мало. В качестве примера рассматривалось обнаружение микрогеля и была показана возможность оценки его молекулярного веса. Без труда могут быть определены небольшие различия в плотностях в растворе для двух полимеров. Из данных о концентрации полимера как функции расстояния от центра вращения может быть получена информация о распределении полимеров по молекулярному весу и по химическому составу, причем для смеси полимер-гомологов могут быть оценены значения средних молекулярных весов, включая среднечисловой молекулярный вес. Это позволяет в принципе заменить определение осмотического давления или по меньшей мере использовать эти измерения в качестве дополнения к осмотическому методу, так как при центрифугировании чувствительность повышается с увеличением молекулярного веса в противоположность осмометрии. Вопрос о том, является ли центрифугирование в градиенте плотности подходящим методом исследования микроструктуры полимеров, в общем виде еще не решен. По крайней мере в одном случае (атактический и стереорегулярный полистирол) было показано, что метод действительно применим. Однако до сих пор еще не известно, можно ли в общем случае ожидать, что различия в микроструктуре приведут к достаточным различиям в кажущихся парциальных удельных объемах, чтобы этот эффект можно было использовать для определения степени стереорегулярности. [c.443]

Важной разновидностью седимеита-ционного метода, получившей широкое применение при исследовании природных полимеров, является центрифугирование в градиенте плотности [3, с. 418]. В центрифужной пробирке создают градиент плотности (например, смёшивая при помоши автоматически действующих насосов водный раствор сахарозы с водой в постепенно уменьшающихся соотношениях), а затем наслаивают поверх него исследуемый раствор полимера в легком растворителе (рис. 169). [c.544]

Метод центрифугирования в градиенте плотности был изобретен впервые Линдерштрём-Лангом. К изучению нуклеиновых кислот в водных растворах его с успехом применили Месельсоп, Сталь и Виноград [26]. Для линейных полимеров в органических растворителях его впервые разработали Бреслер, Нырков и [c.171]

Одним из методов, который успешно применяют для разделения тяжей ДНК, является предложенный Доти и Мармуром [23] метод термической обработки ДНК в растворителе с низкой ионной силой. Однако для его применения в случае исследования ДНК или ДНП, поврежденных ионизирующей радиацией, необходимо точеое тестирование образования одиночных полинуклеотидных участков после термического разделения тяжей ДНК. Обычно о разделении тяжей судят на основании изменения молекулярного веса, поведения полимера при центрифугировании в градиенте плотности СзС1 и т. д. Анализируя ряд экспериментальных подходов, дающих возможность судить о наличии в растворе однотяжевых структур, можно прийти к выводу о том, что один из наиболее перспективных методов, дающий прямой ответ на вопрос о количестве тяжей в макромолекуле полимера,— это определение характера кинетических закономерностей деградации. Принцип метода применим к тем деградационным воздействиям, которые вызывают статистически независимые единичные разрывы в главных цепях валентностей. [c.9]

Центрифугирование в градиенте плотности основано на том же принципе. Как и в вышеуказанном случае, градиент плотности создается градиентом концентрации. В колонке градиент концентрации достигается тем, что слои с различной концентрацией помещают друг над другом, после чего начинается медленная диффузия, постепенно выравнивающая градиент. Роль сил тяготения сводится главным образом к стабилизации системы путем снижения до минимума конвекционных токов. Наоборот, при центрифугировании в градиенте плотности градиент концентрации является результатом сил, действующих в центрифуге, и достигает равновесного значения. Установленный таким образом градиент плотности достаточно стабилен. Этот эффект был использован Пикельсом [2] для снижения конвекции в опытах по центрифугированию. Такой же принцип применяли Калер и Ллойд [31 в своих опытах с так называемой стабилизированной движущейся границей в препаративной ультрацентрифуге. Другим применением градиента плотности является зонное центрифугирование —методика, разработанная Брекке [4], которая позволяет разделять компоненты смеси полимеров на дискретные зоны. Предварительно создают градиент плотности, так что ни в одной точке плотность не превышает плотности любого из компонентов исследуемого образца, раствор которого помещают сверху, а затем подвергают центрифугированию. Различные компоненты мигрируют в разные зоны, которые все более и более разделяются по мере центрифугирования. Еще до того, как движущаяся с наибольшей скоростьЕо зона достигнет дна кюветы, центрифугу останавливают и анализируют различные зоны. Очевидно, что метод основан на различиях в скоростях седиментации. Градиенту плотности принадлежит второстепенная ролы стабилизация системы и влияние плотности жидкости на скорость седиментации. [c.418]

Описанные до сих пор методы были в основном препаративными, причем градиент плотности устанавливали заранее. Как уже упоминалось, градиент плотности может быть получен с помощью самого поля центрифуги. Это имеет место при центрифугировании смеси двух или более жидкостей, отличающихся по плотности, молекулярному весу или по обоим показателям. При растворении макромолекулярного компонента в этой смеси растворителей он будет собираться в области, где плотность близка к плотности полимера в растворе. Мезельсон, Шталь и Виноград [8] первыми применили этот принцип к системе дезоксирибонуклеиновая кислота (ДИК)— водный раствор хлористого цезия. Они получили основные соотрюшения для распределения концентрации полимера в предположении об идеалыюсти раствора и показали, что для единичного полимерного ко.мпопента имеет место гауссово распределение концентрации (ср. нижеследующие разделы). Это предсказание теории было подтверждено опытами с ДНК, полученной из бактериофага Т4, что указывало на высокую степень монодисперсности этого полимера. Для других образцов ДНК были обнаружены несимметричные полосы вследствие композиционной неоднородности препаратов (см. раздел Ж)- [c.419]

Хорошо известный метод исследования избирательной сольватации — светорассеяние [53] в связи с осмотическим равновесием это явление было рассмотрено Айзенбергом [54]. Из изложенного выше ясно, что центрифугирование в градиенте плотности — удобный альтернативный метод [42, 54]. Этот вопрос не будет здесь рассматриваться более подробно, поскольку количество данных для синтетических полимеров мало. Укажем только на одно обстоятельство, играющее важную роль при анализе полимер-гомологов (см. раздел Е). Для полимера определенного химического состава не зависит (или практически не зависит) от молекулярного веса. Это является следствием того факта, что величина фа/йФ1 в уравнении (XI11-24) пропорциональна Мг-Этот результат нельзя рассматривать как точное общее правило, а лишь как хорошее приближение. Можно показать, что он выполняется довольно точно, если для расчета свободной энергии полимерного раствора хорошим приближением является формула Флори — Хаггинса. Это доказательство со всеми подробностями приведено в работе Херманса и Энде [42] и здесь не будет повторяться. [c.432]