Гибридизация клеток в культуре

Еще 15 лет назад был разработан метод гибридизации соматических клеток для проведения генетических исследований на клеточных культурах. На его основе была создана методика генетической рекомбинации путем искусственно вызываемого слияния протопластов ее уже удалось с успехом применить на материале грибов и растений. Первичный продукт такого слияния-клетка, объединяющая в себе геномы обеих родительских клеток. [c.471]

Если гибридомные клетки выращивали в панелях для культуры тканей с объемом лунок 2 мл (процедура гибридизации Б), а клонирование проводили в мягком агаре, как описано выше, то в некоторых случаях необходимо было проанализировать большое число колоний, прежде чем удалось обнаружить антителообразующую колонию. По этой причине клонирование проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах для микротитрования с помощью последовательных разведений клеточной взвеси. Преимущество такого подхода заключается в том, что образование антител единичными колониями, растущими в лун- [c.140]

С другой стороны, авторы использовали клетки селезенки мыши, иммунизированной эритроцитами барана. Клетки селезенки не жизнеспособны в культуре —они тоже не размножаются (тем более на НАТ-среде). Далее с помощью убитого вируса Сендай осуществляли соматическую гибридизацию клеток миеломы и селезенки. На методе гибридизации с использованием вируса Сендай останавливаться не будем, поскольку его вытеснила описанная ниже более простая техника. [c.113]

Опыты велись на клетках культуры D. melanogaster а, б) в условиях культивирования при 25° (а) и теплового шока (б). В случае а экспрессия генов теплового шока отсутствует, к случае б — идет весьма активно. Кроме того, опыты велись на дехорионизованных эмбрионах (е), где экспрессия генов теплового шока находится на среднем уровне После образования ДНК-белковых комплексов, выделения фрагментов ДНК, их двумерного разделения (в вертикальном направлении после удаления белка) и переноса на фильтр вели гибридизацию одних и тех же фильтров с разными пробами с регуляторной областью гена р70 теплового шока (ТШ-5 ) с кодируюш,ей областью того же гена (ТШ-код) с пробой транскрипционно неактивной инсерции в ген рДНК (неакт,). В неактивном гене видны три диагонали / — свободная ДНК, [c.149]

Рис. 163. Схема получения моноклональных антител с помощью габридом-ной техники АС — агент слияния клеток, 1 —В-клетки из селезенки иммунной мыши, 2 — культура миеломных клеток мыши, 3 — гибридизация, 4 — гибридомы, 5 — селекция и клонирование гибридом, 6 — гибридомы, образующие моноклональные антитела, 7 —- введение гибридом, образующих моноклональные антитела, в организм сингенной мыши, 8 — клетки гибридомы, образующие моноклональные антитела, культивируемые в виде культуры ткани, 9 — выращивание гибридомных клеток, образующих моноклональные антитела, в ферментаторе, 1дкж — иммуноглобулины в культуральной жидкости, 1дас — иммуноглобулины в асцитической жидкости, 10 — высаливание 1д-ов аммония сульфатом, 11 — стандартизация 1д-ов, 12 — лиофили-зация 1д-ов.

Две клетки, сливаясь, образуют гетерокарион - одну комбинированную клетку с двумя ядрами. Обычно, чтобы осуществить слияние клеток, клеточную суспензию обрабатывают инактивированными вирусами, или полиэтиленгликолем. Оба этих агента повреждают плазматическую мембрану клетки, что и приводит к слиянию клеток. Образование гетерокарионов дает возможность смешивать компоненты двух отдельных клеток с целью изучения их взаимодействия. Например, если неактивное ядро куриного эритроцита попадает в результате слияния в цитоплазму клетки, растущей в культуре ткани, то такое ядро реактивируется начинается синтез РНК, а затем и репликация ДНК. Именно в опытах по гибридизации клеток мыши и клеток человека впервые были получены данные, свидетельствующие о том, что белки поверхности клеток человека и мыши, находившиеся вначале на своих половинках гетерокариона, быстро диффундируют и перемешиваются по всей его поверхности [c.206]

Рис. 5-83. Эффективный метод, широко применяемый для выявления бактериальной колонии, содержащей определенный клон ДНК (см. также рис. 5-79). Каждая бактериальная клетка, несущая рекомбинантную плазмиду, дает начало колонии из идентичных клеток, которая на питательном агаре выглядит как белое пятнышко. Прижимая к поверхности чашки кружок из фильтровальной бумаги, получают реплику бактериальной культуры. Эту реплику обрабатывают щелочью, чтобы разрушить прилипшие к бумаге клетки и денатурировать плазмидпую ДНК, а затем проводят гибридизацию с высокорадиоактивным ДНК-зондом. Колонии бактерий, связавшие ДНК-зонд, выявляют методом радиоавтографии.

Сначала клетки обрабатывают колцемидом, чтобы заблокировать образование веретена зто приводит к накоплению метафазных клеток в культуре. Такие клетки имеют более округлую форму и слабее прикреплены к пластику, чем другие клетки популяции, поэтому при встряхивании флакона они легко отделяются от субстрата. Метафазные клетки затем обрабатывают гипотоническим раствором (что приводит к их набуханию), после чего фиксируют в смеси метанол — уксусная кислота. Когда суспензию таких клеток по каплям наносят на предметное стекло, клетки лопаются и хромосомы расправляются на стекле по мере высыхания раствора. Реактивы для этой процедуры приведены в табл. 8.12, а сам метод описан в табл. 8.13. На следующем этапе хромосомы обрабатывают РНКазой, чтобы исключить гибридизацию зонда с хромосомной РНК, и затем уксусным ангидридом, который ацетилирует хромосомные белки и тем самым еще более уменьшает неспецифическое связывание зонда. Хромосомную ДНК денатурируют нагреванием и гибридизуют с зондом, предварительно меченным I- TP. Избыток меченого зонда удаляют серией промывок в низкосолевом буферном растворе и покрывают препарат фотоэмульсией. После необходимой экспозиции выявляют участки образования зерен серебра, соответствующие сайтам амплификации гена. Необходимые реагенты приведены в табл. 8.14, а сама процедура описана в табл. 8.15. [c.266]

Помимо привычных методов гибридизации современный селекционер может воспользоваться для улучшения растительных культур методами молекулярной генетики. К их числу относятся введение в растительную клетку новой генетической информации с помощью плазмид, отбор новых типов из изолированных протопластов и соматическая гибридизация протопластов. Человек выращивает для своих нужд лишь небольшое число растений, а между тем существует множество еще неизученных растений, которые можно было бы широко использовать. К числу наиболее многообещающих видов относятся гваюла, дающая каучук, хохоба, дающая воск и масло, ЕсЫпосМоа, выращиваемая на зерно, и спаржевый горох, используемый для получения растительного белка. Новые методы разведения растений с применением тканевых культур и регулируемого воспроизведения могут быть полезны также и в лесоводстве. [c.527]

Опыты с ДНК, выделенной из клеток опухолей, также свидетельствуют о существовании онкогенов. Метод обнаружения клеточных онкогенов получил название переноса геиов или трансфекции . Он основан на том, что некоторые гены, присутствующие в опухолевых клетках, могут вызывать трансформацию нормальных клеток в культуре. Из опухолевых клеток выделяют ДНК, осаждают фосфатом кальция и добавляют к клеткам-реципиентам (обычно в этой роли выступает линия мыщиных фибробластов NIH/3T3). Через 1—2 недели под микроскопом наблюдают образование фокусов трансформации. Клетки, составляющие фокус, меняют свою морфологию из распластанных они становятся округленными. Из трансформированных клеток выделяют ДНК, и опыт повторяют. Так делают несколько раз, при этом уменьшается количество ДНК, не участвующей в переносе признака трансформации, и, следовательно, облегчается идентификация специфических генов (при помощи гибридизации по Саузерну (см. гл. 36)). С помощью этого метода было идентифицировано около 20 клеточных онкогенов некоторые из них сходны с геном ras вируса саркомы мыщей. Эти клеточные онкогены либо вообще не отличаются от нормальных генов, либо имеют небольшие структурные особенности (см. ниже). В первом случае при опухолевом перерождении может меняться регуляция их экспрессии. [c.359]

Вскоре и биохимические, и цитогенетические методы стали вместе использоваться в генетике соматических клеток. Появилась возможность выявлять специфические дефекты ферментов в отдельных клетках, растущих в культуре ткани. Разработка Генри Харрисом [254] и Эфрусси [247] методов гибридизации клеток человека с мышиными клетками позволила установить локализацию многих генов и построить хромосомные карты человека, которые уже соперничают в своей полноте с аналогичными картами для дрозофилы (разд. 3.4.3) и мыши (приложение 9). [c.32]

Разработаны приемы освобождения растительных клеток от твердых клеточных оболочек для получения культуры изолированных протопластов, отграниченных от окружающей среды одной только плазмалеммой. Изолированные протопласты получают в результате комбинированного действия ряда ферментов (пектиназы и целлулазы), которые гидролизуют клеточные оболочки. В результате возникает возможность более детального изучения внутреннего строения клетки. Культивирование протопластов приводит в дальнейшем к ресинтезу клеточных стенок и образованию обычной культуры клеток, из которой затем можно вновь регенерировать целое растение. Изолированные протопласты представляют также большой научный и практический интерес, поскольку, изменяя соответствующим образом состав питательной среды, можно стимулировать их слияние друг с другом, осуществляя таким образом процесс так называемой соматической (неполовой) гибридизации растительных клеток. Культивируемые затем в определенных условиях гибридные протопласты могут дать начало новому растению с признаками, унаследованными от обоих родителей. Соматическая гибридизация может применяться во всех случаях, когда получение гибридов обычным (половым) путем невозможно из-за ряда физиологических или цитогенетических барьеров между растениями, например при отдаленной гибридизации. [c.10]

Этапным периодом для развития метода культуры клеток можно считать 70-е годы, когда были сделаны успехи в разработке способа получения изолированных протопластов растений, а также открытие гибридизации соматических клеток. Изолированные протопласты высших растений и культивируемые клетки животных стали объектом клеточного конструирования путем гибридизации или введения в них чужеродного генетического материала (клеточных органелл, бактерий). Применение методов клеточного конструирования служит задачам улучшения свойств клеток-продуцентов в культуре, а в случае растительных клеток также получению растений с новыми свойствами (в силу тотипо-тентности растительной клетки). [c.7]

Было известно, что клетки, зараженные каким-нибудь вирусом, могут сливаться со здоровыми клетками и образовывать гигантские многоядерные клетки. Эти наблюдения использовали И. Ока-да в Японии и Г. Харрис в Англии для разработки техники гибридизации соматических клеток. Они употребляли для гибридизации вирус Сендай, обладающий способностью сливать клетки между собой. В результате обработки этого вируса ультрафиолетовыми лучами или алкилирующим мутагеном удается повредить его РНК и оставить неповрежденной белковую оболочку. Такой инактивированный вирус утрачивает свои инфекционные свойства, ио сохраняет способность сливать соматические клетки. С помощью инактивированного вируса Сендай удалось повысить выход гибридных клеток в несколько тысяч раз. При внесении инактивированного вируса Сендай в смен]аиную культуру двух типов клеток в некотором количестве образуются многоядерные гибридные клетки — гетерокарионы, содержащие в общей цитоплазме ядра обеих родительских клеток. Большинство многоядериых гетерокарионов быстро погибает, но те из них, которые содержат по одному ядру обеих исходных клеток, часто выживают и размножаются делением. После митоза и деления цитоплазмы из двуядерного гетеро-кариона образуются две одноядерные клетки (синкарионы), т. е. настоящие гибридные соматические клетки (рис. 66). Каждая из них содержит один набор хромосом линии А и один набор линии Б. [c.168]

Другой особенностью используемых для гибридизации клеток миелом является отсутствие у них фермента гипоксантинфосфори-бозилтрансферазы, участвующего в синтезе ДНК- Этот фермент обеспечивает запасный путь синтеза аденозинмонофосфата в тех случаях, когда нормальная цепь ферментативных реакций заблокирована (например, в присутствии ингибитора — аминоптерина). На питательной среде, содержащей гипо-ксантин, аминоптерин и тимидин (НАТ-сре-да), такие миеломные клетки размножаться не способны. Вторым партнером для слияния служат иммунные лимфоидные клетки селезенки или лимфоузлов, которые сами по себе нежизнеспособны в культуре. Сомати- [c.164]

Были выделены мутантные белки, не обладающие токсичностью из-за изменений либо в А-, либо в В-час-ти молекулы. Смесь нетоксичного мутантного белка, измененного в А-части молекулы, и нетоксичного мутантного белка, измененного в В-части, приобретала токсичность лйщь в том случае, если ее сначала инкубировали с трипсином, затем с тиолом, а потом удаляли тиол диализом (в условиях, обеспечивающих окисление 5Н-групп с образованием дисульфидных мостиков). Эти эксперименты по гибридизации отчетливо показали, что для токсичности молекулы необходимы как В-часть, так и А-часть, обладающая АВР-рибозилирующей активностью. В опытах на культуре клеток нетоксичные белковые мутанты с неактивным А-ф рагментом вели себя как конкурентные ингибиторы нативного токсина. Отсюда следует, что токсин связывается со специфическими рецепторными участками на поверхности клетки. Впоследствии было установлено, что связывание интактного или надрезанного токсина с клетками осуществляется в результате взаимодействия его молекул с молекулами гликопротеина, расположенными на поверхности клетки [43]. Следует отметить, что сначала в клетку проникает А-субъединица механизм это- [c.126]

Некоторые исследователи предпочитают избегать применения адъюванта Фрейнда. Действительно, он может стимулировать развитие гранулом, клетки которых повышают фоновый рост в культурах после гибридизации. Предпочтительнее использовать адсорбированный на квасцах антиген в смеси с убитыми клетками Bordetella pertussis в качестве адъюванта [9]. Другой способ, который был успешно применен в случае иммуноглобулинов, заключается в связывании антигена с частичками пластика [10] с последующим осуществлением иммунизации в/б, без адъюванта. Относительно небольшие пептиды иногда необходимо конъюгировать с белком-носипелем, но они могут приобрести иммуногенность при введении в полный адъювант Фрейнда. [c.123]

Перед тем как рассмотреть некоторые наиболее существенные модификации, мы остановимся на двух основных методиках гибридизации, которые используются одинаково успешно. Они иллюстрируют возможность широких вариаций при осуществлении различных стадий метода без снижения эффективности гибридизации. В частности, в первом случае клетки после слияния культивируют в 96-луночной панели для микротитрования. Во втором случае гибридомы выращивают в 24-луноч-аых панелях для культуры тканей (объем лун ки 2 мл). В данном случае выбор панели может быть обусловлен как удоб- [c.123]

В том случае, когда клетки после слияния рассевают в лунки панели для культуры ткани объемом 2 мл, вероятность того, что в одной лунке окажется более одного клона, повышается. Просматривая культуры под инвертированным микроскопом, можно наблюдать два и более клонов в лунке. Клонирование клеток, продуцирующих антитела нужной специфичности, предпринимают немедленно после образования монослоя (обычно па 21—28-е сутки после гибридизации). Тем не менее гибридо-ыу продолжают наращивать в нескольких лунках, а затем во флаконах, пока не образуется достаточное для замораживания и хранения в жидком азоте количество клеток. Необходимо иметь, по меньшей мере, пять ампул исходной клеточной взвеси на случай, если возникнут трудности или неудачи при клонировании. Во время культивирования гибридомы во флаконах культуральную среду тестируют для выявления антител нужной специфичности. Если наблюдается прогрессирующее сни-жение образования антител на стадии роста культуры во флаконах, то это означает, что несекретирующие варианты гибридных клеток обогнали в росте антителообразующие клетки, В таком случае важно отобрать антителообразующие гибрид ные клетки путем клонирования, а небольшое количество клеток из этих флаконов сохранить для последующих процедур клонирования. Клонирование клеток из тех флаконов, где а культуральной среде выявляют прогрессивное снижение образования антител, почти всегда безуспешно. Если все же очень важно выделить такую клеточную линию, то следует извлечь из жидкого азота и разморозить образец клеток, замороженный на самой ранней стадии культивирования и сразу же после восстановления клеток в культуре провести клонирование. Клони-рование может быть осуществлено либо путем высевания небольшого количества клеток в мягкий агар, либо с помощью лимитирующих разведений. [c.139]

Ксеногенная иммунизация животных клонированными популяциями жизнеспособных клеток лимфомы приводит к активации и увеличению числа клеток, способных продуцировать антитела к чужеродным антигенам мышиных лимфом. С помощью соматической гибридизации получают иммортализованные антителосинтезирующие клоны и из них отбирают (тестируя антитела на способность связываться с клетками) только те, которые секретируют антитела против антигенных детерминант клеточных поверхностей. Культуры, которые содержат клетки, продуцирующие МА, клонируют в мягком агаре и подвергают повторному тестированию на способность связываться с клетками большого числа линий, представляющих различные стадии и направления дифференцировки. [c.176]

Через двое суток после гибридизации в каждую лунку добавляют по 100 мкл селективной среды. Селективной средой служит S-среда, содержащая гипоксантин (Ю М), аминоптерин (4-10 М), тимидин (1,6-10 М) и уабаин (1-10 М). Для предотвращения цитостатического эффекта тимидина добавляют дезоксицитидин до конечной концентрации 2-10 М ( onzelmann et al., 1982b). Однако эта предосторожность, по-видимому, необязательна, поскольку все наши гибриды были получены в отсутствие этого вещества. Через 4—5 дней после слияния по 150 мкл среды из каждой лунки заменяют на свежую селективную среду. Обычно в некоторых лунках обнаруживают размножение клеток через 10 сут после слияния, но иногда это происходило позже только через 30 сут. При засеве по 3,6-10 слившихся клеток на лунку размножение, как правило, получают в 10—40% культур. Клетки конфлюентно-го монослоя отделяют от подложки с помощью среды, не содержащей Са + и Mg2+ (разд. III, Д, 4), и переносят в большие по размеру лунки 24-луночных панелей ( ostar 3524), которые содержат S-среду с гипоксантином (10 М) и тимидином (1,6-10 М), но без аминоптерина, чтобы свести к минимуму остаточный токсический эффект последнего. Через 3—4 сут клетки конфлюентного монослоя отделяют от подложки и переносят в небольшие пластиковые флаконы на 10 мл в S-среде без селективных агентов. [c.288]

Не все виды растений способны к регенерации, и до недавнего времени считалось, что их дифференцированные клетки лишены этой способности. Работы по гибридизации клеток заставили изменить это мнение. С помощью определенных ферментов можно без труда выделить из листьев протопласты, т. е. отдельные клетки без клеточных стенок. Если такие клетки гибридизовать с другими клетками или просто оставить в культуре, то протопласты восстанавливают свои клеточные стенки и при помещении в соответствующую среду формируют целые растения. Такая регенерация была получена на нескольких видах, в том числе на петрушке, табаке и картофеле (Dudits et al., 1980 Shepard, 1982). Как и у бегонии, новой зародышевой плазме, а затем цветкам и гаметам дают при этом начало единичные, полностью дифференцированные соматические клетки листа. [c.301]

Соматическая гибридизация животных кл ток Основные успехи в молекулярной биологии клеток животных д эг гмгнуты благодаря использованию клеточных культур. Ио. ров ь ные клетки можно получить из любой ткани путем разрущения межклеточных контактов протеолитическими ферментами. Клетки большинства видов животных способны размножаться в подходящих условиях, причем, как правило, на твердых поверхностях. Часто эти клетки сохраняют признаки дифференцировки тех тканей, из которых они были получены. Однако после 50—100 циклов деления культивируемые клетки погибают. Изредка в этих культурах выживают мутантные клетки, которые дают начало бессмертным клеточным линиям. На твердых поверхностях они образуют монослой, после чего их рост превращается. В отличие от них, бессмертные линии раковых клеток размножаются в жидких [c.142]

Потенциальные возможности н иoJИlЗoвaшIя стерильной культуры выделенных протопластов в исследовательской работе очень велики. Ианример, проникновение вирусов в растительную клетку или ноглощенне клетками макромолекул гораздо проще изучать в отсутствие клеточной степки. Однако наиболее перспективным является успешное слияние протопластов различного происхождения с образованием новых видов растений путем соматической гибридизации. Выведение новых растений всегда было ограничено необходимостью эффективного полового оплодотворения. Невозможность получения жизнеспособных межвидовых и межродовых гибридов может быть обусловлена рядом нарушений нормального полового процесса в частности, неспособностью пыльцевой трубки проникнуть в зародышевый мешок, разрушеннем эндосперма п т. п. Этих сложностей можно избежать, если вместо полового размножения использовать прямое слияние вегетативных клеток. Уже было произведено успешное слияние выделенных растительных протопластов (рис. [c.247]

Каждая бактериальная клетка, несущая рекомбинантную плазмиду, дает начало колоьши из идентичных клеток, которая на питательном агаре выглядит как белое пятнышко. Прижимая к поверхности чашки кружок из фильтровальной бумаги, получают реплику бактериальной культуры. Эту реплику обрабатывают щелочью, чтобы разрушить прилипшие к бумаге клетки и денатурировать плазмидную ДНК, а затем проводят гибридизацию с высокорадиоактивным ДНК-зондом. Калонии бактерий, связавшие ДНК-зонд, выявляют методом радиоавтофафии. [c.332]

Начинается ли репликация ДНК Е.соИ в произвольном месте хромосомы, или же в хромосоме имеется определенный участок инициации Репликация ДНК-строго регулируемый процесс, поэтому а priori кажется гораздо более вероятным, что она начинается в определенном месте. Действительно, как показали работы по определению относительного числа различных генов в условиях быстрого синтеза ДНК, репликация в клетках Е.соИ начинается в одном определенном месте хромосомы. Рассмотрим два гена - д и >. Предположим, что ген д расположен вблизи отточки начала репликации, а ген Ь - вблизи от конца. Тоща ген д будет реплицироваться намного раньше, чем ген Ь. В быстро расту шей культуре на один ген Ь будет приходиться примерно два гена д. Если же, наоборот, репликация ДНК начинается в случайной точке, количество генов д и будет одинаковым. Относительное число генов было определено с помошью метода гибридизации, который рассматривается ниже (разд. 25.5). Результаты этих экспериментов ясно показали, что относительное число генов действительно зависит от их положения на карте (рис. 24.36). Эти данные позволили сделать следующие выводы. [c.29]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология