Стафилококковый белок А DA

ВЫЯВЛЕНИЕ АНТИГЕНОВ КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТИ С ПОМОЩЬЮ РОЗЕТКООБРАЗУЮЩИХ ЭРИТРОЦИТОВ, НАГРУЖЕННЫХ СТАФИЛОКОККОВЫМ БЕЛКОМ А [c.273]

В конце 1960 - начале 1970-х годов стали известны трехмерные структуры папаина, химотрипсиногена, а-химотрипсина, р-трипсина, эластазы, стафилококковой нуклеазы, рибонуклеазы и некоторых других белков. Во всех случаях ситуация коренным образом отличалась от миоглобина и гемоглобина. Перечисленные белки содержали не более, чем у лизоцима, и столь же нерегулярные а-спирали и р-структуры. [c.74]

Для того чтобы продемонстрировать принцип иммуноферментного анализа, приведем результаты анализа иммуноглобулина, специфичного к вирусу клещевого энцефалита (ВКЭ) в сыворотке крови пациентов. Этот показатель является очень важным как минимум по двум аспектам. Применительно к человеку, укушенному клещом, результат анализа показывает, достаточно ли устойчив человек к энцефалиту. А в случае использования крови здоровых доноров этот показатель свидетельствует о тйм, содержит ли кровь достаточное количество антивирусных антител, для того чтобы быть использованной для приготовления антивирусного иммуноглобулина. Последний может быть использован для введения человеку, укушенному клещом, для предотвращения развития инфекции. Известно, что поверхностный вирусный белок Е является основным антигеном ВКЭ. Этот белок можно достаточно прочно сорбировать на поверхности полистироль-ной пробирки. Если взять его в избытке, достаточном для количественного связывания антител к белку Е в образце, последние будут сорбированы практически полностью. После удаления образца добавляется конъюгат стафилококкового [c.258]

Белки, в которых связывание иона металла необходимо для стабилизации структуры или существенно для реализации каталитической функции при сравнительно слабом взаимодействии иона металла с некоторыми специфическими аминокислотными остатками, как, например в термолизине или стафилококковой нуклеазе. [c.16]

Примеры влияния различных заболеваний ЖКТ на биодоступность препаратов приведены в табл. 5.7. Следует отметить, что эти заболевания могут влиять не только (и не столько) на всасывание препарата, но и на все другие фармакокинетические процессы — распределение, связывание с белками, метаболизм, экскрецию. В результате у больных изменяются уровни препарата в крови и многие фармакокинетические параметры (включая и площадь под кривой концентрация — время ) по сравнению с уровнями и параметрами у здоровых людей. Для того чтобы выделить влияние той или иной патологии на процессы всасывания и биодоступность, оказывается недостаточным сравнить динамику концентрации в группах больных и здоровых людей при пероральном приеме препарата, необходимо провести сравнительное исследование фармакокинетики препарата при внутривенном введении и приеме внутрь в обеих группах. В противном случае можно сделать ошибочные выводы. Так, уровни пропранолола возрастают в крови больных при разных заболеваниях — целиакии, болезни Крона, гепатите, ревматоидном артрите, колите, стафилококковой пневмонии и др., однако это далеко не во всех случаях связано с изменением (увеличение.м) биодоступности препарата. [c.228]

Рис, 3. Все IgG мыши при pH 8 адсорбируются на колонке стафилококкового белка А. иммобилизованного на сефарозе 4В. Как правило, yi элюируются при pH 6, У2л при pH 4,5, а Ysb при pH 3 (Еу et al., 1978). Слева — элюцня IgG, содержавшихся в асцитной жидкости при развитии вторичной опухоли у мышей, которым имплантировали клетки гибридомы. В средине — элюция IgG, адсорбированного из 50 мл СПК (примерно 50 мл СГГк содержится в 300 мл культуральной надосадочной жидкости). Справа — элюция специфических антител, адсорбированных из 300 мл надосадочной жидкости, к которой была добавлена СПК, предварительно очищенная от бычьего IgG. Из 300 мл надосадочной жидкости можно, как правило, выделить около 7— 10 мг чистых антител. [c.19]

Метод включает обработку клеточной популяции антисывороткой к искомому поверхностному антигену, а затем индикацию клеток, связавших антитела, с помощью бараньих эритроцитов. Если лимфоидная клетка имеет на своей поверхности соответствующий антиген, эритроциты скапливаются вокруг нее и образуется легко различимая под микроскопом розетка. Клетки, ие содержащие искомого антигена, не связывают антитела и поэтому не привлекают индикаторные БЭ. Для приготовления индикаторных БЭ их нагружают стафилококковым белком А. Это белок с мол. весом 42 000, который входит в состав клеточной стенки Staphylo o us aureus и специфически связывает F -фраг-мент иммуноглобулинов класса G некоторых видов животных (Sjoquist et al., 1972). [c.274]

F Rn, находится на стыке доменов Сн2 и СнЗ, перекрывая участок взаимодействия со стафилококковым белком А. Вероятно, основное функциональное значение в этом участке имеют три или четыре остатка гистидина по-видимому, от них зависит связывание IgG с F Rn при pFl 6,5 (pFl молока, поступившего в просвет кишечника) и его высвобождение при pH 7,5 (pH крови). [c.112]

Аффинная хроматография с использованием естественных лигандов иммуноглобулинов, например стафилококкового белка А (компонент клеточной стенки стафилококков, связывающийся с областью Су2 и СуЗ больщинства подклассов IgG, т. е. IgGI, lgG2 и IgG3). [c.532]

БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ТОКСИНЫ, ядовитые в-ва, выделяемые бактериями в окружающую среду (экзотоксины) илп содержащиеся в микробных клетках (эндотоксины). К экзотоксинам относятся ботулинич, токсин (типов А, В, С, D, Е, F, G), столбнячный, дифтерийный, стафилококковый токсины и др.— белки с мол. м. от 4-10 до неск. млн. обладают антигенными сп-вамн хорошо раств. в воде, ие раств, в СП. и орг. р-ритслях инактивируются щелочами, окислителями, нек-рыми гидролазами, а также при нагревании (наир., при 100 °С — за 20 мин), солнечным светом. Длительно хранятся в высушенном виде. ЛДао ботулинич. [c.65]

Кроме специфических Са2+-связывающих белков, ион Са + связывают также и другие белки. К их числу относятся а-амилазы (гл. 7, разд. В.6), термолизин (гл. 7, разд. Г.4), стафилококковая нуклеаза (гл. 7, разд. Д.5), конканавалин А (рис. 5-7) и некоторые белки системы свертывания крови (рис. 6-16). Последние представляют особый интерес, поскольку они содержат специфичеомие Са2+-связывающие участки, образование которых зависит от витамина К (дополнение 10-Г). Ионы кальция связываются также с различными углеводами, например с карагениновыми гелями (гл. 2, разд. В.5). [c.375]

D, Е, F, G), столбнячный, дифтерийный, стафилококковый токсины и др.— белки с мол, м, от 4-10 до неск. млн. обладают антигенными св-вами хорошо раств. и воде, не раств. в СП. и орг. р-рителях инактивируются щелочами, окислителями, нек-рыми гидролазами, а также при нагревании oiaiip., при 100 °С — за 20 мин), солнечным светом. Длительно хранятся и высушенном виде. ЛДи ботулинич. [c.65]

Ограниченная диффузия возникает, если молекулярная диффузия в порах матрицы затруднена из-за экранирования подхода макромолекул к прикрепленному аффинному лиганду. Экспериментально вклад этой диффузии можно определить с большим трудом, но для аффинной хроматографии на очень пористых носителях эти трудности становятся минимальными. На практике для достижения равновесных условий желательно, чтобы скорость потока была по возможности низкой. Например, при скорости потока 400 мл/ч для выделения стафилококковой нуклеазы на колонке объемом 20 мл небольшие количества нуклеазы появлялись в первом пике вместе с белковыми примесями, особенно если общая концентрация белков в образце была высока (20—30 мг/мл) [5]. Однако даже при такой высокой скорости потока нуклеаза полностью сорбировалась, если наносился менее концентрированный образец. Зависимость связывания лактатдегидрогеназы на №-(6-аминогексил)-5 -АМР — сефарозе от скорости потока пссле-дована Лоу и др. [21]. Было найдено, что увеличение скорости потока относительно мало влияет на сорбцию. При высоких скоростях потока эффективность колонки (ВЭТТ), а также связываемость р уменьшаются. Влияние скорости потока более заметно в небольших колонках, с которых часть белка с ферментативной активностью элюируется со свободным объемом. Влияния концентрации инертного белка (бычьего сывороточного альбумина) при высоких скоростях потока (67 мл/ч) также не обнаружено. [c.84]

В ядрах клеток всех эукариотов ДНК присутствуют в виде ассоциатов с гистоновыми белками. Эти ассоциаты, или хрома-тиновые фибриллы, представляют собой надмолекулярную структуру, повторяющимся элементом которой является частица, называемая нуклеосомой. Каждая нуклеосома состоит из восьми гистонов (по две молекулы гистонов Н2А, Н2В, НЗ и Н4) и включает участок намотанной на этот белковый октамер нити ДНК длиной в 140 нуклеотидных пар. Продолжение этой нити образует перемычку со следующей нуклеосомой. В зависимости от т ого, какому организму или какой ткани этого организма принадлежит данная клетка, перемычка между нуклео-сомами может содержать от О (дрожжи) до 100 (сперма морского ежа) нуклеотидных пар. Стафилококковая нуклеаза расщепляет молекулу ДНК в области перемычек с образованием фрагментов, длина которых кратна длине участка ДНК, входящего в состав нуклеосомы [136]. После отделения от белков эти фрагменты можно разделить с помощью электрофореза в агарозном геле и таким образом обнаружить различия в структуре повторяющегося звена хроматина (рис. 10.13, Л). При обработке хроматина ДНКазой I нуклеосомальная ДНК расщепляется на фрагменты, содержащие в среднем 10,4 нуклеотидных пар (я —целое число) [137]. Эти сравнительно более короткие фрагменты ДНК можно разделить с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (рис. 10.13, ). [c.193]

К третьей группе принадлежат белки, у которых имеются участки, целиком построенные из а-спиралей, и участки, целиком состояш,ие из Р-слоев, — (а -Ь )-белки. На рис. 1.10 изображена модель стафилококковой нуклеазы — типичного представителя (а + Р)-белка. Примерами белков такого типа являются инсулин, попаин, рибонуклеаза. [c.64]

Наконец, рассматривая распространенное предположение, что а-спираль у гетерогенной аминокислотной последовательности представляет собой самую компактную структуру, нужно отметить, что в данном случае наибольшей плотностью должны были бы обладать высокоспирализованные белки. Однако это не так. Например, плотность миоглобина и гемоглобина (1,35 и 1,34 г/см соответственно), состоящих на 75% из а-спиралей, оказывается даже несколько меньше плотности карбоксипептидазы, химотрипсина, рибонуклеазы и стафилококковой нуклеазы (1,39, 1,37, 1,41 и 1,39 г/см соответственно), имеющих незначительное содержание а-спиралей, которые к тому же очень искажены [125—129]. Отсутствие корреляции между спиральным содержанием и плотностью белка следует и из сопоставления значений плотности, полученных Козманом и соавт. [130] из расчета на основе известных координат атомов трехмерных структур. [c.264]

Известны случаи прямого, вполне очевидного несоответствия процесса денатурации двухстадийному приближению. Это проявляется, например, у карбоангидразы при ее денатурации гуанидингидрохлори-дом в различном характере экспериментальных кривых и типичных для двухстадийного процесса зависимостей [41]. У стафилококковой пени-циллиназы отклонения от модели Брандтса обнаруживаются в несовпадении характера изменений при денатурации различных физических параметров. Так, если судить по вязкости и УФ-поглощению, белок совершает свой единственный конформационный переход и полностью денатурирует при 0,5 М гуанидингидрохлорида, а согласно спектрам дисперсии оптического вращения (ДОВ), первые конформационные изменения происходят только при 1,5 М концентрации того же денатуранта. Проводившие эти исследования Б. Робсон и Р. Пейн сделали вывод, что в интервале концентраций 0,5—1,5 М гуанидингидрохлорида в растворе существует в заметном количестве третье промежуточное конформационное состояние белка [42]. [c.351]

Отклонение процесса денатурации от схемы двух состояний может быть не только истинным, но и кажущимся, хотя сделать здесь однозначное отнесение не всегда представляется возможным. Если, например, конформация белка включает несколько доменов, то их развертывание при денатурации может происходить последовательно, в значительной степени независимо и с разной скоростью. Денатурация муль-тисубъединичных белков, имеющих четвертичную структуру, обычно начинается с диссоциации и их последующего развертывания [43, 44]. Усложняют процесс денатурации и затрудняют его интерпретацию также межмолекулярная ассоциация и вьшадение в осадок развернутых белковых цепей, что часто происходит в слабоденатурирующей среде. В результате образуется третье состояние белка. Подобным образом ведут себя карбоангидраза и стафилококковая нуклеаза, развертывающиеся при малой концентрации гуанидингидрохлорида и необратимо денатурирующие из-за малой растворимости в этих условиях. Еще одна причина сложности процесса денатурации может заключаться в неоднородности молекулярной организации белка (в присутствии других белков или молекул в ассоциированном состоянии), которая имеет место или с самого начала, или возникает в процессе развертывания. Известным примером такого рода является овальбумин. Сложный характер его перехода N О впервые был отмечен Р. Симпсоном и У. Козманом в 1953 г. и в течение более двадцати лет не мог быть объяснен [c.351]

В 1972 г. Д. Сачс и соавт. [114] разработали иммунологический метод, который был использован для изучения процесса ренатурации белков, не содержащих дисульфидных связей. Метод основан на предположении о двухфазном механизме свертывания и идентификации конформационных состояний фрагментов нативной трехмерной структуры белка с помощью специально подобранных антител. Далее выявляются зависимости между константой равновесия предельных состояний (D и N) и константами связывания антител с белковыми фрагментами. Д. Сачс и соавт. [115] применили метод для определения константы равновесия N D стафилококковой нуклеазы, а Дж. Харрел и соавт. [116] и Б. Фурье и соавт. [117] — для изучения конформаций промежуточных состояний миоглобина. О характере получаемой при исследовании иммунохимического метода информации можно судить по результатам рассмотренной в разд. 9.4. работы Л. Чавеца и Г. Шераги [86], применивших его в исследовании ренатурации рибонуклеазы А. [c.385]

Схема разделения и очистки пептидов, описываемая ниже (включающая гельфильтрацию, хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе или дауэксе-50, высоковольтный электрофорез и хроматографию на бумаге), применима к белкам средней молекуляр-1ЮЙ массы (до 40 000). Крупные фрагмеггты, плохо разделяющиеся на бумаге и элюирующиеся с нее, первоначально отделяют гель-фильтрацией, а основную часть пептидов после фракцио- шрования на ионообменнике очищают окончательно хроматографией на бумаге. Однако эта схема применима далеко ие ко всем типам гидролизатов белков. Например, мембран11ые белки плохо расщепляются ферментами с высокой специфичностью, такими, как трипсин или стафилококковая протеаза гидрофобные пептиды склонны к образованию агрегатов при гель-фильтрации, осаждаются на ионообменных колонках и экстрагируются в охлаждающую среду при высоковольтном электрофорезе на бумаге и в органическую фазу при промывках в реакции Эдмана. Оптимальная схема анализа структуры мембранных белков включает их фрагментацию с помощью химических методов на небольшое число крупных пептидов, разделение в денатурирующих условиях на полиакриламидных гелях и определение аминокислотной последовательности автоматическим методом после присоединения пептида к твердой матрице. Альтернативный вариант основан на использовании протеаз с низкой специфичностью (таких, как пепсин или эластаза). При этом образуется значительное число коротких пептидов, которые [c.352]

Для установления общей последовательности белка пептиды одного типа гидролиза должны быть перекрыты пептидами, полученными из другого гидролизата. Некоторые комбинации протеолитических фрагментов, такие, как трипсин и химотрипсин или трипсин и стафилококковая протеаза, хорошо дополняют друг друга в этом отношении, в то время как комбинация трипсин + протеаза из А. mellea или химиотрипсин + пепсин менее выгодны, поскольку они образуют значительное число фрагментов, отличающихся только на один аминокислотный остаток (табл. 10.1). Нет необходимости определять полную структур/ всех пептидов второго набора, обычно ограничиваются получением таких характеристик, как аминокислотный состав, N-концевые аминокислоты, электрофоретическая подвижность, но, безусловно, должна быть установлена аминокислотная последовательность перекрывающих областей и тех участков цепи, корректность структуры которых вызывает сомнение. Перекрывающая последовательность должна захватывать. по крайней мере два С-концевых остатка одного пептида и два N-концевых другого. Если установление структуры белка не завершено в значительной степени, то более короткие перекрывающие по следовательности, чем указанные, должны быть подтверждены дополнительными данными. Если же структура установлена почти полностью, то вероятность конкурирующей последовательности для неубедительного перекрытия снижается и пептиды могут быть ориентировочно размещены по цепи. Стратегия [c.359]

Способностью неспецифически активировать Т-клетки обладают и молекулы другой группы, так называемые суперантигены , большинство которых имеет бактериальное происхождение. К ним относятся стафилококковые энтеротоксины (вызывающие острые пищевые отравления некоторых типов), токсин, вызывающий развитие синдрома токсического шока при сепсисе, токсин эксфолиативного дерматита и некоторые вирусные белки. Суперантигены связываются с молекулами МНС класса II на АПК и распознаются ТкР, однако не посредством того же механизма, какой действует при распознавании Т-клеточным рецептором комплекса МНС-антигенный пептид. Суперантиген связывается только с Ур- [c.206]

Иммуноанализ антител. 1. Антиген в солевом растворе инкубируют на пластиковой подложке или в пробирках, в результате чего небольшое его количество адсорбируется на поверхности пластика. 2. Свободный антиген удаляют путем отмывания. (Подложку затем можно обработать избытком постороннего белка, чтобы предотвратить последующее неспецифическое связывание белков.) 3. Добавляют исследуемые антитела, которые связываются с антигеном. 4. Несвя-завшиеся белки удаляют отмыванием. 5. Антитела определяют при помощи меченого лиганда. Лигандом может служить, например, стафилококковый белок А, который связывается с F -областью IgG чаще используют другие антитела, специфичные по отношению к исследуемым антителам. Применяя лиганд, который связывается с антителами определенного класса или подкласса, можно дифференцировать изотипы антител. 6. Несвязанные антитела удаляют отмыванием. 7. Определяют связавшуюся метку. Типичная кривая титрования представлена внизу. С повышением количества антител интенсивность сигнала возрастает линейно от фонового значения до уровня плато. Титр антител можно определить правильно лишь в линейной области. Уровень плато, как правило, в 20-100 раз выше фонового. Чувствительность метода обычно составляет приблизительно 1-50 нг специфических антител в 1 мл. Специфичность метода можно проверить, добавив свободный тест-антиген в повышающихся концентрациях к исследуемым антителам на зтапе (3). Антиген связывается с антителами и блокирует их соединение с антигеном, фиксированным на подложке. Добавление возрастающих количеств свободного антигена снижает интенсивность сигнала. [c.534]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология