Рекомбинантные идентификация

Рис. 19.1. Получение линии трансгенных мышей с использованием ретровирусных векторов. Эмбрион, обычно находящийся на стадии 8 клеток, инфицируют рекомбинантным ретровирусом, несущим трансген. Самки, которым бьи имплантирован эмбрион ( суррогатные матери), производят на свет трансгенное потомство. Для идентификации мьщ1ат, несущих трансген в клетках зародьшгевой лршии, проводят ряд скрещиваний.

Каждая глава завершается подробным резюме и списком вопросов для повторения. Мы надеемся, что это поможет усвоить прочитанное. Все ключевые идеи иллюстрируются тщательно подобранными цветными рисунками (всего их более 200) мы убеждены, что один рисунок может сказать больше, нежели тысяча слов. Гл. 1 знакомит читателя с основами молекулярной биотехнологии и некоторыми коммерческими аспектами, а следующие пять глав (гл. 2-6) — с ее методологией. Все вместе эти главы подготовят читателя к восприятию материала всех последующих глав. В гл. 7-12 части II рассмотрены способы получения ценных метаболитов, вакцин, лекарственных веществ и продуктов, использующихся для диагностики, а также методы биодеградации удобрений и пестицидов. В гл. 13 описаны способы крупномасштабного культивирования генетически измененных микроорганизмов с целью получения коммерческих продуктов. Часть. III посвящена молекулярной биотехнологии растений и животных (гл. 14 и 15). Гл. 16 и 17 знакомят читателя с применением технологии рекомбинантных ДНК для идентификации генов человека, ответственных за развитие некоторых заболеваний, и подходами к генной терапии. В последней, IV части рассмотрены вопросы регламентации исследований в области молекулярной биотехнологии, оформления патентов на различные продукты и изобретения. [c.10]

Рис. 21.10. Образование HSV-вектора с помощью рекомбинации. Проводят котрансфекцию кдетки-хозяи-на плазмидой, которая содержит терапевтический ген, фланкированный последовательностями ДНК из вспомогательных областей HSV-генома, и ДНК HSV дикого типа. HSV-геном реплицируется в клеточно1М ядре по типу катящегося кольца , при этом между фрагментами ДНК HSV, входящими в состав плазмиды, и ДНК HSV дикого типа может произойти рекомбинация (штриховая линия). Молекулы ДНК HSV дикого типа и рекомбинантного HSV упаковываются в вирусные частицы, высвобождающиеся из клетки после лизиса. Вирусы размножают и проводят скрининг бляшек для идентификации рекомбинантных HSV. Полученные HSV-векторы хранят в условиях, исключающих их загрязнение HSV дикого типа.

Для получения коммерческих продуктов с помощью рекомбинантных микроорганизмов необходимо сотрудничество специалистов в двух областях молекулярных биологов и биотехнологов. Задача молекулярных биологов заключается в идентификации, изучении свойств, модификации нужных генов и создании эффективных систем их экспрессии в клетках микроорганизмов, которые можно будет использовать для промыщ-ленного синтеза соответствующего продукта, а задача биотехнологов — в обеспечении условий оптимального роста нужного рекомбинантного микроорганизма с целью получения продукта с наибольщим выходом. На заре развития молекулярной биотехнологии ученые наивно полагали, что переход от лабораторного синтеза к промышленному — это вопрос простого увеличения масштаба, т. е. условия, оптимальные для малых объемов, будут оптимальными и для больших, так что достаточно просто взять больший реактор и соответственно больший объем культуральной среды. [c.349]

Как MALDI, так и ионизацию электрораспылением можно легко сочетать с ферментативным расщеплением белков для последующего определения их параметров. После расщепления белка полученная смесь целиком помещается в MALDI-спектрометр и анализируется. В наиболее благоприятных случаях можно определить массу более чем 90% пептидных фрагментов. Этот подход можно использовать для определения изменений в белке, например при определении параметров рекомбинантных белков или для идентификации ковалентно-связанных модификаторов белка. Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением, вследствие того, что она легко сочетается как с ЖХ-МС, так и тандемной масс-спектрометрией, может быть источником еще и дополнительной информации о последовательности аминокислот в белке. При химической ионизации пептид фрагментируется на два комплементарных ряда ионов, которые имеют последовательности аминокислот, начиная с С- и N-терминальных атомов пептида. Тандемная масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением оказывается более экспрессной и находит более разнообразное применение, чем традиционные биохимические методы, такие, как последовательное отщепление аминокислот по методу Эдмана. [c.308]

Хотя некоторые векторы устроены весьма замысловато, все системы клонирования отвечают двум основным требованиям наличие нескольких сайтов для клонирования и возможность достаточно простой идентификации клеток с рекомбинантными ДНК. Следует отметить, что уникальные сайты рестрикции выполняют в опытах с рекомбинантной ДНК двойную функ- [c.62]

Идентификация клонов. Если вставка содержит гены, способные к экспрессии в новом хозяине, рекомбинантные клоны могут быть идентифицированы по синтезируемому ими продукту. Однако чаще приходится идентифицировать непосредственно нуклеотидную вставку, для чего используют методы гибридизации. Бактериальные (нлн фаговые) колонии выращиваются на нитроцеллюлозных фильтрах, помещенных на чашку Петри с питательной средой (рис. 253). После этого приготавливаются так называемые реплики — к фильтру с исходными колониями прижимается свежий нитроцеллюлозный фильтр, который затем переносится на чашку Петри с плотной питательной средой, где на нем образуются колонии, идентичные первым. [c.436]

Новейшим достижением в биотехнологии явилось создание технологии рекомбинантных ДНК, или генной инженерии. Эта область объединяет химию нуклеиновых кислот и белков, микробиологию, генетику и биохимию. Первой задачей генной инженерии является выделение и идентификация генетического материала (ДНК) из одного организма. Далее этот материал модифицируется с тем, чтобы его можно было ввести в новый организм-хозяин . При воспроизведении генетического материала хозяина введенная ДНК также воспроизводится. [c.117]

Ведущиеся ныне ожесточенные дебаты о трансгенных сельскохозяйственных растениях сосредоточены на двух основных проблемах безопасности и беспокойстве о равном доступе и праве собственности. Обеспокоенность потенциальной опасностью ГМО базируется преимущественно на представлениях о том, что введение чужеродных ДНК в основные сорта продовольственных культур противоестественно и, стало быть, сопровождается неустранимым риском для здоровья. Но поскольку все живые организмы, включая продовольственные растения, животных, микробов и т. д., содержат ДНК, как можно считать рекомбинантные ДНК противоестественными Даже определить понятие чужеродный ген и то проблематично, поскольку множество генов оказываются общими для самых разных организмов. Конечно, необходимо помечать ГМ-продукты, особенно в тех случаях, когда их свойства заметно отличаются от традиционных (скажем, по пищевой ценности) или в них присутствуют явные аллергены или токсины. Но в чем смысл такой идентификации в тех слу- [c.35]

В принципе строение протеогликанов допускает почти неограниченное разнообразие. Они могут существенно различаться по содержанию белка, по величине молекул и по числу и типу гликозаминогликановых цепей в молекуле. Кроме того, хотя для них всегда характерны повторяющиеся последовательности дисахаридов, длина и состав цепей гликозаминогликанов могут сильно варьировать, так же как и пространственное расположение гидроксильных, сульфатных и карбоксильных групп вдоль цепи. Поэтому задача идентификации и классификации протеогликанов по содержащимся в них сахарам чрезвычайно сложна. К настоящему времени многие сердцевинные белки секвенированы с помощью метода рекомбинантной ДГЖ, и в будущем классификация протеогликанов, вероятно, станет более осмысленной, когда будет основана на структуре их сердцевинных белков, а не гликозаминогликанов [c.491]

Методы идентификации клонов, содержащих рекомбинантные молекулы [c.154]

Специфические белок-белковые и белково-нуклеиновые взаимодействия лежат в основе функционирования всех без исключения генетических систем. Не менее важную роль в данных процессах играют и взаимодействия между белками и низкомолекулярными соединениями. Поэтому исследование механизмов таких взаимодействий, а также идентификация молекулярных партнеров, участвующих в формировании функционирующих макромолекулярных комплексов, является важнейшей задачей молекулярной биологии. Грандиозность задачи привлекла в эту область большое количество исследователей и породила обилие разработок, направленных на ее решение. Одним из методических прорывов последнего времени в изучении белок-белковых взаимодействий было создание дрожжевой ди-гибридной системы, которая с тех пор широко используется для решения многих аналогичных проблем, в том числе и для отбора рекомбинантных белков, полученных методами белковой инженерии [117, 118]. [c.355]

Предварительно клонированные гены вводят в клетку животных различными путями. Суть одного из них состоит в трансформации клеток требуемым геном, соедршенным с одним из генов, для которых осуществляется селекция. Для идентификации и последующего размножения клеток, содержащих интегрированную ДНК, был разработан метод, получивший название метода маркера. Примером может служить метод получения клеток, дефектных по синтезу фермента тимидинкиназы (ТК -клетки). Такие клетки трансформировались фрагментами ДНК вируса герпеса (HSV), содержащего ген фермента ТК, и после трансформации они приобретали способность к синтезу фермента на селективной среде, т.е. становились ТК -клетками. Клетки ТК легко отличаются от клеток TK , поскольку способны расти на средах с ами-ноптерином (ингибитор, блокирующий определенные стадии биосинтеза нуклеотидов), гипоксантином и тимидином. Следовательно, в данном случае для трансформации клеток животных бьши использовапы гибриды бактериальных плазмвд с геном ТК из вируса герпеса. Для этого предварительно проводили клонирование и идентификацию генов в клетках Е. соИ и затем полученная рекомбинантная плазмида вводилась в ТК -клетки. Анализ мето- [c.125]

Визуальная идентификация зон лизиса — утомительная и субъективная процедура. Вместо нее для обнаружения рекомбинантных бакуловирусов можно использовать ДНК-гибридизацию или полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Кроме того, если под контроль промотора бакуловируса, активного с ранних и до поздних стадий литического цикла, поместить ген la Z Е. соН, кодирующий -галакгозидазу, и такую конструкцию включить во фрагмент ДНК, встраивающийся в геном A MNPV, то в присутствии хромогенного субстрата -галактозидазы зоны с рекомбинантными вирусами окрасятся в синий цвет. [c.144]

Идентификация экспрессирующих рекомбинантных клонов. ТИе-тод идентификации экспрессирующих клонов зависит от свойств продукта экспрессии. Если этот продукт обладает собственной биологической активностью, то ои может быть идентифицирован по ее проявлению. Например, если экспрессии подвергается ген, кодирующий фермент, то клоны идентифицируют по наличию в них соответствующей ферментативной активности клоны, синтезирующие интерферон,— по противовирусной активности клеточных экстрактоа и т. д. [c.439]

Разработаны специализированные методы анализа и идентификации фрагментов ДНК, в том числе содержащих специфические гены. Предложены также процедуры разделения, служащие для выделения таких фрагментов ДНК. Другие аналитические методы используются для идентификации генетически видоизмененных клеток, в которые введена нужная ДНК, а также таких клеток, где эта ДНК (через промежуточную мРНК) управляет синтезом белков. Опять-таки выделение белкового продукта требует использования процедур разделения. Таким образом, применение химических приемов при работе с биологическими системами составляет сердцевину технологий, базируюыщхся на использовании рекомбинантной ДНК. [c.119]

Идентификация искомых клонов занимает иногда многое времени. Если же клонирование гена проведено, выявить сходные гены в банках кДНК относительно несложно, если применить метод Грюнштейна и Хогнесса. В этом случае колонии бактерий, содержащих рекомбинантные плазмиды, выращивают на нитроцеллюлозных фильтрах, помещенных на поверхность питательной среды. Затем бактериальные клетки разрушают, а высвободившуюся ДНК денатурируют. При этом она остается связанной с фильтром. Далее на фильтр наносят радиоактивный зонд — денатурированную ДНК или РНК, которая связывается с гомологичной или частично гомологичной бактериальной ДНК- Избыток радиоактивных молекул зонда,, которые не связались специфически с гомологичной ДНК, удаляют промыванием и выявляют лизированные колонии, связавшие зонд, методом радиоавтографии. Бактерии, для которых наблюдалась положительная реакция в этом тесте, можно выделить из дубликата — реплики набора колоний. [c.316]

Другие методы идентификации рекомбинантных плазмид основаны на экспрессии включенного в них гена. При этом идентифицируется белковый продукт, для чего используются иммунологические методы или методы определения его специфической активности. Для обнаружения антигенов в бактериях путем скрининга, на основе специфического их взаимодействия с антителами, часто используется метод, разработанный Брумом и Джилбертом. Для этого пластиковый диск покрывают слоем специфических радиоактивных антител и помещают его на предварительно лизированные колонии. Антигены из лизиро-ванных бактерий связываются с антителами на диске. Положение антигенов, адсорбированных на диске, определяют с помощью радиоавтографии. [c.316]

Экспериментальные данные о процессах перегруппировки генов, кодирующих константные и вариабельные участки иммуноглобулиновых цепей, были получены с помощью методов, основанных на применении рекомбинантных ДНК. Для этого из фракции полисом выделяли мРНК, кодирующую L-цепь миеломы, на ее основе с помощью обратной транскриптазы получали кДНК, которую клонировали на плазмид-ном векторе. Наработанную в значительных количествах клонированную кДНК расщепляли подходящей рестриктазой таким образом, чтобы получить два фрагмента, соответствующих V- и С-участкам L-цепи. Фрагменты ДНК разделяли препаративно с помощью электрофореза, вводили радиоактивную метку с помощью ник-трансляции, денатурировали и использовали в качестве зондов для идентификации фрагментов рестрикции ДНК из миеломных или эмбриональных клеток, содержащих последовательности, комплементарные последовательностям зондов. Наиболее существенно, что, как показано на рис. 16.22, в ДНК клеток миеломы оба V- и С-кодирующих участка локализуются на одном и том же со RI-фрагменте, в то время как в эмбриональной ДНК они находятся на различных Есо RI-фрагментах. Это означает, что на каком-то этапе развития между эмбриональной клеткой и дифференцированным лимфоцитом происходит специфическая перестройка ДНК, которая в данном случае привела к удалению Есо RI-сайта (или сайтов), находившегося в рамках протяженной области ДНК между V- и С-ко-дирующим участками в эмбриональной ДНК. После такой перестройки эти участки оказались расположенными в непосредственной близости друг к другу. Комбинация генов L-цепи, возникшая при их перегруппировке в ходе дифференциации лимфоцита, при его последующем митотическом делении устойчиво наследуется дочерними клетками. [c.241]

Таким образом, даже при помощи этих относительно простых методов и в соответствии со сделанными раннее выводами W. Laver [71] были обнаружены различия во внутренних вирусных белках между вирусными штаммами (73]. Эти наблюдения крайне важны для четкой идентификации биохимическими методами природы генных продуктов, содержащихся в предположительно рекомбинантном вирусе. По мере совершенствования электрофоре- [c.17]

Открытие явления сплайсирования берет свое начало из идентификации в инфицированных вирусом гриппа типа А клетках второго неструктурного белка, NS2, с м.м. 11000, для которого профиль триптического пептида отличался от такового для других 8 продуктов вирусного гена. Это означает, что один из 8 сегментов вРНК (генома) должен кодировать два белка [56]. Восьмой сегмент (наименьший сегмент вРНК), как было установлено, кодирует не только белок NS1, но и белок NS2. Это было показано в экспериментах с рекомбинантными вирусами, в которых белки NS1 и NS2 были пересортированы вместе [35, 53]. Две различные [c.84]

Второй новый метод требует применения техники рекомбинантных ДНК и клонированных зондов ДНК для идентификации и количественной оценки аллельного полиморфизма. К настоящему времени выявлено более 100 полиморфных генов в геноме человека и установлена их хромосомная локализация банк этих данных быстро увеличивается. Они оказываются чрезвычайно удобными маркерами, даже если эти гены не экспрессируются в структурные или ферментативно-активные белки. Окрининг этих маркеров с помощью блоттинга по Саузерну в настоящее время используется, хотя и в небольших масштабах, при идентификации клеточных линий [32]. [c.146]

Быстрое развитие иммунологии нашло свое отражение в данной, третьей книге из серии Иммунологические методы , которая включает изложение экспериментального опыта, накопленного в Базельском институте иммунологии. В нее входят пять глав, посвященных применению рекомбинантных ДНК в иммунологии в двух главах описано использование высокоэффективной жидкостной хроматографии для разделения белков отдельные главы касаются следующих вопросов применение моноклональных антител для идентификации мембранных антигенов лимфоцитов, типирование антигенов гистосовместимости, новые методы анализа белков с помощью двумерного электрофореза, лимфокины, поддерживающие рост В-клеток. В четырех главах описано получение и ведение линий клонированных В- и Т-кле-ток и гибридом, а еще в четырех обсуждаются новые методы детектирования клеток, продуцирующих ревматоидный фактор. Две главы посвящены таким общим иммунологическим методам, как флуоресцентный сортинг клеток и анализ методом лимитирующих разведений, и наконец, четыре последние главы касаются сложных методов, используемых при работе с определенными видами животных (птицами, овцами и амфибиями) для изучения специальных иммунологических вопросов. [c.7]

Ни пептид S-Tag, ни 103-звенный полипептид, используемый в качестве аффинного сорбента, не обладают ферментативной активностью, однако после образования комплекса в последнем индуцируется рибонуклеазная активность. Это позволяет количественно оценивать эффективность исследуемых систем экспрессии. Однако епде большей чувствительностью и удобством в применении обладают системы, в которых S-белок ковалентно связан с флуоресцентными красителями или ферментами (например, с классической пероксидазой хрена). Такую систему можно эффективно использовать для идентификации рекомбинантного белка с помопдью вестерн-блоттинга и ее часто применяют одновременно со второй аффинной меткой. [c.130]

Среди искусственных систем биосинтеза белка важное место занимают бесклеточные системы [260]. Любая бесклеточная система создается, прежде всего, для моделирования конкретных биохимических процессов, происходящих в живом организме, и во время функционирования воспроизводит некоторые существенные особенности жизнедеятельности клетки. В генной инженерии бесклеточные белоксинтезирующие системы часто используются для исследования кодирующего потенциала и механизмов экспрессии клонированных генов in vitro, а также на промежуточных этапах конструирования рекомбинантных генов для идентификации мРНК или фрагментов ДНК по кодируемым белкам. [c.185]

Для идентификации сайтов молекулы IgE, связывающихся с F eRI тучных клеток или с F eRII В-клеток, были применены методы генетической инженерии. Синтез рекомбинантных пептидов, соответствующих тем или иным отрезкам после- [c.112]

Отсутствие заметной гомологии между ДНК многих микоплазм было отмечено еще в работах конца 60-х годов [58—60]. По более точным количественным данным перекрестной гибридизации ДНК разных микоплазм в растворах было установлено, что гомология по ДНК у большинства видов не превышает 2 %, и только у нескольких пар сравниваемых микоплазм гомология составила от 4 до 21 % [61—63]. В нашей работе [64] по перекрестной блот-гибридизации ДНК ряда микоплазм показано, что при низком уровне гомологии ДНК исследованных видов эта гомология касается отдельных протя- женных фрагментов генома, а не коротких участков, распределенных по всей его длине. Более того, у некоторых микоплазм единственными гомологичными участками ДНК оказываются рибосомные гены., На основании этих результатов мы начали использовать в качестве гибридизационных зондов для обнаружения и идентификации микоплазм тотальные препараты ДНК, полученные из микоплазм, выращенных на специальных средах. Такие зонды оказались высокоэффективными и достаточно специфичными, но их нельзя рекомендовать к широкому применению, так как получение чистых культур микоплазм и их выращивание в препаративных количествах связаны со значительными техническими трудностями. В связи с этим мы предприняли клонирование случайных рестриктазных фрагментов ДНК микоплазм в бактериальной плазмиде pBR322 и проверку рекомбинантных Ь лазмиЯ на специфичность в опытах по блот- и дот-гибридизации с ДНК различных микоплазм и ДНК клеток эукариот. Был составлен комплект плазмид-зондов, содержащих фрагменты ДНК, видоспецифичные для каждой из взятых микоплазм. В дальнейшем этот комплект должен быть расширен. [c.118]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология