Ингибитор трипсиновый

Семена белкового типа, исследуемые в первую очередь благодаря наличию в них большого количества белка (горох, конские бобы, фасоль, чечевица, люпин), принадлежат к семейству бобовых — Leguminosae. В горохе, конских бобах, фасоли и чечевице содержатся ингибиторы протеаз и лектины [110, 113]. Среднее содержание трипсиновых ингибиторов составляет [c.346]

Переваривание миозина и получение раствора тяжелого меромиозина. Тяжелый меромиозин получают перевариванием миозина трипсином при комнатной температуре. К раствору миозина добавляют имидазольный буфер, приготовленный на 0,5 М КС (pH 7,6), до конечной концентрации имидазола 10 мМ и белка 30—40 мг/мл (можно меньше). Раствор трипсина в 0,5 М K I добавляют к раствору миозина, соблюдая весовое соотношение трипсин — миозин 1 100. Через 30—40 мин протеолиз останавливают добавлением раствора ингибитора трипсина из соевых бобов в двукратном избытке по сравнению с весовым количеством трипсина 3. Трипсиновый гидролизат диализуют в течение ночи [c.394]

Рис. 11.24. Конформационная карта метиламида N-ацетилглицина (а), диметиламида N-aцeтил- -aлaнинa (б) и конформационные точки Gly и других аминокислотных остатков, предшествующих Pro в трехмерных структурах миоглобина, а-химотрип-сина, белка хрусталика глаза, лизоцима, нейротоксина II, рубредоксина, панкреатического трипсинового ингибитора и ферроцитохрома с

Трипсиновый ингибитор (быка) [c.194]

Трипсиновый ингибитор (быка) 58 5,4 31,6 56,4 94,5 [c.214]

Итак, благодаря избирательности бифуркационных флуктуаций и их строгой согласованности структурная самоорганизация белковой молекулы приобретает детерминистические черты (случайность порождает необходимость). Из конформационно жестких и взаимодействующих с ними лабильных фрагментов возникают нуклеации, которые через ряд чисто случайных, но тем не менее неизбежных и строго последовательных событий входят в домены или в нативную трехмерную структуру белка. Весь процесс самосборки пространственной структуры не требует времени больше, чем затрачивается на рибосомный синтез белковой цепи. Уникальность бифуркаций, порядок их возникновения и устойчивый конструктивный характер обусловлены конкретной, отобранной в ходе эволюции аминокислотной последовательностью. В то же время рассматриваемая модель свертывания не исключает образование "неправильных" промежуточных состояний, содержащих структурные элементы, отсутствующие в конечной конформации. Более того, поскольку в основу модели положен беспорядочно-поисковый механизм, осуществляющий сборку белка методом "проб и ошибок", то возникновение непродуктивных состояний белковой цепи становится неизбежным. Однако они нестабильны, так как продуктивные состояния, появляющиеся в результате бифуркационных флуктуаций, всегда более предпочтительны по энергии. К обсуждению этого вопроса вернемся в главе 17 при количественном описании механизма ренатурации панкреатического трипсинового ингибитора. [c.98]

Эти разные белки находят у большинства других видов бобовых. Преобладающая часть семян бобовых растений содержит антитрипсиновые вещества, гемагглютинины [56, 69, 70, 93, 96] и липоксигеназы [36 . Трипсиновые ингибиторы — это белки с молекулярной массой от 8000 до 25 ООО Да [70[ и с повышенным содержанием цистеина. Каждый растительный вид содержит, как правило, несколько изоформ ингибиторов три у конских бобов, девять у гороха. Гемагглютинины представляют собой в большинстве случаев гликопротеины, содержащие 1—5 % углеводов, с молекулярной массой от 50 ООО (горох, конские бобы) до 120 ООО Да (соя). Эти белки, часто представленные в форме нескольких изолектинов, имеют четвертичную структуру, число субъединиц которой колеблется от двух (конские бобы) до четырех (соя, фасоль, горох). Субъединицы состоят из двух полипептидных цепей, одна из которых с низкой молекулярной массой (а), другая — с более высокой (Р). У гороха цепи аир имеют молекулярную массу соответственно 7000 и 17 ООО Да [69]. [c.167]

Выявлены функции ближних, средних и дальних взаимодействий, определяющих возможность, направленность и предел самопроизвольного процесса свертывания белковой цепи в нативную конформацию. Этот вопрос рассматривается (с привлечением экспериментальных данных и неравновесной термодинамической модели) в следующей главе после анализа результатов априорного расчета пространственной структуры молекулы бычьего панкреатического трипсинового ингибитора. [c.426]

АПРИОРНЫЙ РАСЧЕТ ТРЕХМЕРНОЙ СТРУКТУРЫ МОЛЕКУЛЫ ПАНКРЕАТИЧЕСКОГО ТРИПСИНОВОГО ИНГИБИТОРА [c.426]

Всем отмеченным требованиям удовлетворяет белковая молекула бычьего панкреатического трипсинового ингибитора (БПТИ). Решающее значение в выборе этого белка как тест-объекта сыграло то обстоятельство, что молекула БПТИ экспериментально и теоретически изучена Почти во всех отношениях более глубоко и всесторонне, чем другие белки. [c.427]

Итак, завершено рассмотрение опытных данных Крейтона о механизме сборки трипсинового ингибитора. Оно основывалось на неравновесной термодинамической модели, физической теории структурной самоорганизации и конкретных результатах априорного расчета конформационных возможностей полипептидной цепи и геометрии нативной трехмерной структуры белка. Общим итогом анализа является адекватное естественному процессу ренатурации представление всего пути свертывания белка -от состояния статистического клубка до строго детерминированной нативной конформации макромолекулы. К принципиальным результатам рассмотрения следует, по-видимому, отнести выявление причин и количественное теоретическое обоснование возможности спонтанной, быстрой и безошибочной сборки флуктуирующей беспорядочным образом белковой цепи. [c.482]

В предыдущих главах обсуждены результаты первых и пока единственных априорных расчетов трехмерных структур двух низкомолекулярных белков - нейротоксина II и панкреатического трипсинового ингибитора. Они демонстрируют возможность количественного подхода к описанию на атомном уровне нативной конформации и механизма структурной самоорганизации белковой молекулы, руководствуясь только знанием аминокислотной последовательности. Совпадение найденных теоретически и полученных экспериментально значений двугранных углов ф, /, (о и X с [c.482]

Высоко оценивая значимость кристаллографических и иных опытных данных о белках, следует тем не менее иметь в виду их принципиальную недостаточность в решении ряда общих и многих конкретных вопросов структурной и структурно-функциональной организации. Поэтому теоретический конформационный анализ неизбежно должен стать неотъемлемой составной частью всех исследований морфологических и биологических свойств белковых молекул. Для этого необходимо, чтобы расчетный метод был бы менее трудоемким и более быстрым, чем изложенный в книге метод априорного расчета. Надежность существующего метода подтверждается хорошим совпадением результатов расчета с опытными данными. Точность рассчитанных априорно координат атомов нейротоксина II и панкреатического трипсинового ингибитора не уступает точности рентгеноструктурного анализа белков с разрешением -2,0 А. О его скоростных качествах можно судить по следующему примеру. Так, полный расчет трехмерной структуры белка, имеющего -100 аминокислотных остатков, проводится двумя-тремя сотрудниками, владеющими методом, с помощью двух современных персональных компьютеров за -4 месяца, [c.591]

Панкреатический трипсиновый ингибитор [269] 1 [c.109]

Подробный анализ небольших изменений при ассоциации трипсина и панкреатического трипсинового ингибитора быка проведен Хубером и стр. [269]. [c.126]

Наиболее распространенный метод — экстрагирование в жидкой среде, которое заключается в переводе белков в растворимое состояние в щелочной среде, куда помещают отщелушенные (лишенные оболочек) и размолотые семена [38]. Нерастворимые вещества отделяют центрифугированием, после чего белки осаждают добавлением кислоты, промывают и высушивают. Часть антипитательных веществ удаляется во время этих операций. Таким образом, большая часть а-галактозидов и почти 70% трипсиновых ингибиторов и лектинов отделяются в процессе экстракции в щелочной среде и промывки выделенных белков гороха и конских бобов [39]. Содержание вицина и конвицина в экстрактах конских бобов всегда меньше, чем в исходной муке [87]. Содержание фитиновой кислоты в экстрактах зависит от pH при экстракции и осаждении у сои осаждаются выделенные белки, более богатые фитиновой кислотой при pH 5 5 чем при pH 4,5 [22]. [c.348]

Примесь химотрипсина в препарате трипсина может в значительной степени исказить специфичность трипсинового гидролиза, поэтому крайне важно избегать загрязнения трипсина химо-трипсином. Загрязненный препарат трипсина можно очистить хроматографией [841 химотрипсин, содержащийся в препарате, можно инактивировать кислотой или недавно полученными синтетическими ингибиторами. [c.35]

При турбосепарации семена щелущатся и в конечном итоге тонко измельчаются на получаемые частицы воздействует поток воздуха, разделяя их на легкую фракцию, обогащенную белками, и тяжелую фракцию, содержащую крахмал. В ходе этой операции антипитательные вещества концентрируются в белковой фракции. Испытания различных семян показали также, что трипсиновые ингибиторы с гемагглютинирующей активностью — сапонины, вицин и конвицин, галактозиды, фитиновая кислота, в случае их наличия концентрируются в белковых фракциях [28, 94, 113, 115]. [c.348]

Решающую роль в создании количественного метода сыграли положения о гармонии всех внутриостаточных и межостаточных взаимодействий и их преобладающем энергетическом влиянии над взаимодействиями белковой цепи с молекулами и ионами окружающей среды. Одно из этих положений позволило разделить проблему структурной организации белка на три менее громоздкие и поддающиеся последовательному решению частные проблемы ближних, средних и дальних взаимодействий. В результате специально разработанной классификации пептидных структур на конформации, формы и шейпы стало возможным получение достоверных количественных данных о конфор-мационных состояниях целых наборов структурных вариантов различных таксономических групп, ограничившись детальным анализом их отдельных представителей. Классификация настолько сократила объем вычислительных работ, что сделала реальным расчет трехмерных структур бе лков, на первых порах низкомолекулярных. Изложенные в книге результаты априорных расчетов структур трипсинового ингибитора, сложного фрагмента нейротоксина II и большого числа олигопептидов, состоящих из десятков аминокислотных остатков, свидетельствуют об адекватном отражении предложенными теориями (бифуркационной и физической) структурной самоорганизации белков и пептидов и реальности предсказания их нативных конформаций. [c.8]

Важнейшим достижением в изучении механизмов структурной организации белков явились экспериментальные исследования Крейтона 1970-1980-х годов, особенно его работы, посвященные эмпирическому подходу к изучению промежуточных состояний обратимой денатурации цистинсо-держащих белков [29, 30]. Разработанные Крейтоном методы позволяют Идентифицировать дисульфидные связи, регулировать скорость их образования и разрушения и по последовательности возникающих промежуточных MOHO-, ди- и т.д. S-S-продуктов следить за ходом свертывания белковой цепи. Предпринятое им на этой основе исследование пути свертывания панкреатического трипсинового ингибитора [29] опережает и сейчас, по прошествии двух десятилетий, научный уровень аналогичных работ по ренатурации других белков. Подход Крейтона, однако, неприемлем для белков, лишенных S-S-мостиков. [c.86]

Исследование процесса ренатурации барназы Ферштом и соавт. [31-33] (как и панкреатического трипсинового и ингибитора Крейтоном [29, 30]) подробно изложено во втором томе издания "Проблема белка" [2. Ч. III]. Анализ результатов привел к заключению, что первая попытка воссоздать на уровне отдельных аминокислотных остатков количественную картину всего пути свертывания белка, не содержащего дисульфидные связи, не достигла желаемой цели. Декларированный Ферштом порядок ренатурации не является неизбежным следствием объективного рассмотрения, а представляет собой один из многих правдоподобных вариантов. Принципиальное возражение заключается в несоответствии равновесной термодинамики и формальной кинетики - теоретической основы эмпирического подхода Фершта - сугубо неравновесному характеру процесса структурной самоорганизации белка. [c.88]

Рис. 11.23. Конформационная карта метиламида Ы-ацетил-1-аланина и конформационные точки аминокислотных остатков (за исключением Gly) в трехмерных структурах миоглобина (а), а-химотрипсина (6), белка хрусталика глаза (в), лизоцима (г), нейротоксина II (точки) и рубредоксина (крестики) (д), панкреатического трипсинового ингибитора (точки) и ферроцитохрома с (крестики) (е)

Панкреатический трипсиновый 58 ингибитор БПП - брадикининпотенцирующий пептид. ОП - опиоидный пептид. [264] [c.387]

Молекула трипсинового ингибитора содержит шесть остатков цистеина, которые образуют в нативной структуре три дисульфидных мостика ys - ys , ys - ys3 и ys o- ys (см. рис. IV.5). Исследование пространственного строения БПТИ проводилось, как уже отмечалось, для линейной последовательности без каких-либо предположений о локализации S-S-связей. Считалось, что сближенность соответствующих остатков ys является следствием детерминированного процесса укладки пептидной цепи в наиболее предпочтительную по энергии межостаточных взаимодействий структуру. Поэтому рассматриваемые расчетные данные [c.448]

В конце 1970-х и в 1980-е годы исследования подобного плана [40-46] не претерпели существенных изменений и не внесли новых идей в решение проблемы свертывания и структурной организации нативного белка. Для иллюстрации рассмотрим кратко результаты анализа процесса сборки белковой цепи бычьего панкреатического трштсинового ингибитора, полученные С.Миязавой и Р. Джерниганом [46]. Авторы представили белковую последовательность в виде цепочки жестких сфер, совмещенных с атомами С и СР аминокислотных остатков. Конформационными параметрами считались двугранные углы ф, у, которым разрешалось принимать дискретные значения через каждые 10°. Межостаточные взаимодействия учитывались исключительно между теми парами остатков, которые в кристаллической структуре трипсинового ингибитора образуют близкие контакты. При оценке взаимодействия между двумя остатками энергия принималась равной -2,2 ккал/моль, если расстояние между соответствующими атомами СР в нативной конформации белка находилось в интервале 2,4-6,5 А когда расстояние было < 2,4 А, энергия считалась бесконечно большой, а > 6,5 А - равной нулю. Следовательно, притяжение друг к другу могли испытывать только те остатки (жесткие сферы) атомы СР которых сближены в реальной трехмерной структуре. Для [c.488]

Проанализировав существовавшие к тому времени алгоритмы предсказания (Е. Каба и Т. Ву [133-135], Б. Робсона и Р. Пейна [136, 137], П. Чоу и Г. Фасмана [138, 139], Г. Шераги и соавт. [39]), А. Бэржес и Г. Шерага констатировали, что ни один из них не может быть использован для достижения поставленной цели. Затем они переводят свою задачу в гипотетическую область и ведут поиск решения с идеальным алгоритмом предсказания. На основе известной кристаллической структуры БПТИ, а не эмпирических корреляций, авторы относят 58 аминокислотных остатков белка к 5 конформационным состояниям (а , а , е, ), отвечающим экспериментальным данным и низкоэнергетическим областям потенциальной поверхности конформационной карты p-V /. Каждому состоянию они приписывают усредненные по известным кристаллическим структурам восьми белков соответствующие значения углов ф, j/. Двугранные углы боковых цепей (%) были взяты с округлением до 5° из рентгеноструктурных данных для молекулы БПТИ. Вопреки ожиданиям оказалось, что построенная таким образом трехмерная структура даже отдаленно не напоминает конформацию белка. Ситуация не улучшилась и при минимизации энергии с учетом невалентных взаимодействий. Сравнение контурных карт расстояний между атомами С модельной и опытной конформаций показывает, что в собранной с помощью идеального алгоритма экспериментальной геометрии боковых цепей и проминимизированной трехмерной структуре отсутствуют все характерные особенности нативной конформации удалены друг от друга цистеиновые остатки, образующие между собой дисульфидные связи, практически нет намека на вторичные структуры и не воспроизводится глобулярная форма молекулы трипсинового ингибитора. Для исправления положения были введены дополнительные ограничительные условия, облегчающие приближение модельной структуры к нативной конформации. Однако ни учет реализуемой в белке системы дисульфидных связей (5-55, 14-38, 30-51), ни введение сближения соответствующих остатков ys, ни включение в расчет специальной функции, имитирующей стремление неполярных остатков оказаться внутри глобулы, а полярных выйти наружу, ничто не помогло получить пространственную форму белка, близкую к нативной. Конечно, можно было бы еще более ужесточить условия и добиться совпадения. Но это не имело бы значения, поскольку не повлияло бы на окончательный вывод о невозможности даже в случае 100%-ного правильного предсказания конформационных состояний остатков получить структуру, отдаленно напоминающую реальный белок. [c.502]

Аналогичная задача, отвечающая второй стадии комбинированного Метода, решалась в работе Бэржеса и Шераги [132], которая уже рассматривалась. В ней также конформационные состояния всех остатков Панкреатического трипсинового ингибитора были отнесены не с помощью эмпирических корреляций, а на основе кристаллической структуры молекулы. Оказалось, что рассчитанная с использованием такого идеального Алгоритма предсказания, каким является эксперимент, конформация белка Даже отдаленно не напоминала его нативную структуру. Следовательно, Попытки уложить вторичные структуры в супервторичные и получить [c.509]

Решающим доказательством справедливости предложенного подхода к решению задачи о структурной организации белка явились результаты априорного расчета трехмерной структуры бычьего панкреатического трипсинового ингибитора и количественное представление свертывания белковой цепи как самопроизвольного, быстрого и безошибочного процесса. Рассчитанная при использовании аминокислотной последовательности и стандартной валентной схемы конформация белка совпала с кристаллической структурой молекулы БПТИ. Точность расчета значений всех двугранных углов вращения ф, у, (О и %, расстояний между атомами С всех остатков и длин реализуемых водородных связей оказалась близкой точности рентгеноструктурного анализа белков высокого разрешения. На основе данных о конформационных возможностях аминокислотной последовательности БПТИ получили свое объяснение все детали ренатурации белка, механизм которой был изучен экспериментально. Тем самым, во-первых, была подтверждена неравновесная термодинамическая модель сборки белка. Во-вторых, была апробирована физическая теория структурной организации белка, вскрывающая природу бифуркационных флуктуаций и утверждающая представление о нативной конформации белковой молекулы как о глобальной по внутренней энергии структуре, плотнейшим образом упакованной и согласованной в отношении всех своих внутриостаточных и межостаточных невалентных взаимодействий. Именно гармония между ближними, средними и дальними взаимодействиями ответственна за резкую энергетическую дифференциацию и выделение из множества возможных структурных вариантов стабильной и уникальной для данной аминокислотной последовательности конформации белка. В-третьих, продемонстрированы реальность фрагментарного метода теоретического конформационного анализа пептидов и белков и удовлетворительное количественное описание с его помощью их пространственных структур применительно к условиям полярной среды. Под- [c.589]

Ковалентные промежуточные состояния на пути свертывания бычьего панкреатического трипсинового ингибитора (BPTI) (451, 793]. Обозначения пояснены в тексте. Правильные дисульфидные связи показаны в крайней рамке справа. В промежуточиы.ч состояниях, например Ид и Ilg, правильные дисуль-фидиые связи изображены тем же шрифтом, что и в N-состояиии. Приведенный иа рисунке путь свертывания относится к быстро свертывающимся цепям, т. е. к 85% несвернутых молекул. [c.187]